甘草總黃酮提取部位抗驚厥作用的研究

權洪峰 ，閆欣 ，彭曉東

1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏銀川 750004；2.銀川市第一人民醫(yī)院藥劑科，寧夏銀川 750004

天然黃酮類化合物具有廣泛的中樞作用，且作用機制涉及調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)在內(nèi)多種神經(jīng)功能的介入而發(fā)揮作用[1]。甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，因其味甘甜而得名。《中國藥典》1977年版后歷版藥典均規(guī)定甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Batal.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根及根莖。課題組前期研究結果表明，從寧夏栽培甘草中富集所得總黃酮部位（GF）可能通過多種機制改善實驗動物的慢性應激抑郁行為[2-3]。從天然產(chǎn)物中獲得具有抗癲癇（epilepsy）作用的活性成分而用于臨床治療由來已久,其中不乏大量的黃酮類化合物,且涉及甘草屬藥用植物中獲得的生物活性成分[4-6]。該實驗于2017年6—8月利用傳統(tǒng)的電驚厥及藥物致驚厥的方法，研究寧夏地區(qū)栽培甘草中獲得的甘草總黃酮提取部位的抗驚厥作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠，體重為18～22 g。由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供 [SYXK （寧）2011-0001]。動物均在室溫（22±2）℃，相對濕度 50%～60%，自然光照的條件下飼養(yǎng)。

1.2 實驗材料與儀器

甘草總黃酮提取部位 （GF,實驗室自制，批號：20150322）。戊四氮（批號：103065百靈威化學試劑）、匹魯卡品（批號:P6503）、阿托品(國藥準字：H20045048)、地西泮（批號:120118）、苯妥英鈉（批號:H14020776）。 生理藥理多用儀由蚌埠醫(yī)學無線電二廠生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及實驗步驟 實驗分為對照組、GF高劑量組 （400.0 mg/kg）、中 劑 量 組 （150.0 mg/kg）、低 劑 量 組（50.0 mg/kg）及陽性藥物對照組，分別灌胃（ig）給藥 1次/d。7 d后于末次給藥后1 h實施實驗。

1.3.2 GF對正常動物自主活動的影響實驗 采用曠場實驗(open field test，OFT)對動物自主活動的評估。實驗采用自制敞箱（30 cm×30 cm×30 cm），內(nèi)壁及底部涂黑，底部劃分成 9個面積相等的方格（10 cm×10cm），攝像頭垂直距敞箱 30 cm，四周避光。將小鼠放入中心格內(nèi)，開始拍攝記錄6 min，統(tǒng)計小鼠后 4 min內(nèi)水平移動格數(shù)。小鼠每次被放入固定的中央格。曠場實驗前30 min腹腔注射（ip）地西泮（4 mg/kg）為陽性對照[2-3]。

1.3.3 最大電休克驚厥試驗 依照文獻建立小鼠最大電休克驚厥模型 （maximal electroshock seizure model，MES）[7]，小鼠篩選以35～40 V/0.5 s為參數(shù)，出現(xiàn)后肢強直癥狀者可用于實驗。灌胃給藥1 h后，同參數(shù)實驗，以后肢強直癥狀不發(fā)生為抗MES的陽性反應。MES前 30 min腹腔注射苯妥英鈉（50 mg/kg，ip）為陽性對照。

1.3.4 戊四氮致驚厥試驗 小鼠灌胃給藥 1 h后，皮下注射戊四氮 （100 mg/kg，sc）,給藥后觀察并記錄小鼠豎尾、陣孿以及強直各項癥狀出現(xiàn)的潛伏期。PTZ前30 min腹腔注射地西泮（7.5 mg/kg，ip）為陽性對照[7]。

1.3.5 匹魯卡品致急性驚厥試驗 灌胃給藥 30 min后，首先皮下注射給予1 mg/kg劑量的阿托品，30 min后腹腔注射350 mg/kg劑量的匹魯卡品誘發(fā)驚厥反應，觀察 1 h內(nèi)小鼠反應。依據(jù) Racine分級進行評估[8]，即 0級（無抽搐發(fā)作）、1 級（耳、面部抽搐）、2 級（肌陣攣，但無直立位）、3級（肌陣攣，伴直立位）、4級（全身強直陣攣發(fā)作）、5級（強直陣攣發(fā)作，并失去體位控制）。并實施記錄。1 h后腹腔注射注射2.5 mg/kg劑量地西泮終止發(fā)作。

1.4 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism繪圖軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用 one-way ANOVA 的 Dunnett和 Dunnett’s T3(3)統(tǒng)計方法[9]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GF對小鼠正常自主活動的影響

GF 各劑量組（400.0、150.0、50.0 mg/kg）不能影響小鼠正常自主活動（P＞0.05）。

表1 甘草總黃酮提取部位對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

表1 甘草總黃酮提取部位對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

注：aP＜0.05,bP＜0.01 vs對照組。

組別 劑量 行為異常潛伏期（s） 大發(fā)作潛伏期（min） 死亡時間（min） 強直數(shù)/實驗總只數(shù)（只）強直百分率（%）對照組GF 30±15 27±15 33±13 30±15 4±2（17±5）b（13±5）a 7±2 6±4（25±13）b（14±5）a 5±3地西泮400.0 mg/kg 150.0 mg/kg 50.0 mg/kg 7.5 mg/kg 15/15 7/15 10/15 15/15 1/15 100.0（46.7）b（66.7）a 100.0 6.7b

表2 甘草總黃酮提取部位對PILO誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

表2 甘草總黃酮提取部位對PILO誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

組別對照組GF地西泮劑量400.0 mg/kg 150.0 mg/kg 50.0 mg/kg 7.5 mg/kg行為異常潛伏期（s）31±4.0 28±6.0 30±11.0 32±8.0大發(fā)作潛伏期（min）4±1.0 7±1.0 6±0.6 5±0.5死亡時間（min）7±2.0 9±2.0 8±3.0 6±1.0強直數(shù)/實驗總只數(shù)（只） 強直百分率（%）15/15 12/15 14/15 15/15 1/15 100.0 80.0 93.3 100.0 7.0b

2.2 GF對鼠

小鼠 MES驚厥試驗的影響：GF各劑量組（400.0、150.0、50.0 mg/kg）不能拮抗小鼠實施最大電休克引發(fā)的驚厥，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 GF對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響

如表1所示，與對照組比較，400.0 mg/kg劑量的GF能夠顯著延長PTZ誘導小鼠癲癇大發(fā)作的潛伏期，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）、死亡時間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）和強制發(fā)作的百分率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。150.0 mg/kg劑量的GF能夠延長PTZ誘導小鼠癲癇大發(fā)作的潛伏期，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）、死亡時間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）和強制發(fā)作的百分率，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。而 50.0 mg/kg劑量的 GF對 PTZ誘導的癲癇發(fā)作各項參數(shù)沒有影響，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 GF對PILO

誘導小鼠急性癲癇模型 的影響：如表2所示，GF各劑量組（400、150、50 mg/kg）不能拮抗 PILO 誘導小鼠急性癲癇發(fā)作，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

甘草為我國常用大宗中藥材,在中藥材中產(chǎn)量和銷量均居于大宗藥材的首位,同時也是食品加工、輕工業(yè)的重要原料。甘草的主要成分為黃酮類和三萜皂苷類化合物。課題組前期研究結果顯示，從寧夏栽培甘草富集得到的的GF可能通過多種機制改善實驗動物的慢性應激導致的抑郁行為[2-5]。

從天然產(chǎn)物中獲得具有抗癲癇作用的活性成分而用于臨床治療由來已久[4-6]，其中不乏姜黃素、木犀草素等黃酮類化合物。據(jù)報道[10]皮下注射PTZ可引起不同級別的抽搐如肌肉陣攣性抽搐、前/后肢體痙攣,最終死亡。光果甘草根水提物與空白組比較，對延長PTZ誘導小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期以及減少陣發(fā)性驚厥持續(xù)時間無顯著作用，而光果甘草根醇提物中（200.0 mg/kg）、高劑量（400.0 mg/kg）組顯著延長了PTZ誘導小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期并明顯減少陣發(fā)性驚厥持續(xù)時間，且與陽性藥物組（地西泮，2 mg/kg）高劑量（400.0 mg/kg）組陣發(fā)性痙攣的發(fā)作時間被推遲100%。

該實驗結果表明，在實驗劑量范圍內(nèi)，GF不能影響小鼠自主活動；對小鼠PILO及MES引起的驚厥表現(xiàn)沒有拮抗作用。GF可以劑量依賴性的拮抗PTZ引起的小鼠驚厥。與對照組比較，400.0 mg/kg劑量的GF能夠顯著延長PTZ誘導小鼠癲癇大發(fā)作的潛伏期、死亡時間及降低強制發(fā)作的百分率（46.7%）。150.0 mg/kg劑量的GF能夠延長PTZ誘導小鼠癲癇大發(fā)作的潛伏期、死亡時間及降低強制發(fā)作的百分率（66.7%）。

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