Serratia sp. NDW3 GADH小亞基基因ga2dh的克隆及表達(dá)分析

楊美英, 盧冬雪, 孫合美, 武志海, 岳勝天, 付 麗

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118； 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

Serratia sp. NDW3 GADH小亞基基因ga2dh的克隆及表達(dá)分析

楊美英1, 盧冬雪1, 孫合美1, 武志海2, 岳勝天1, 付 麗1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118； 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

【目的】 克隆葡萄糖酸脫氫酶(GADH)小亞基基因ga2dh并進(jìn)行鑒定?！痉椒ā?研究水稻根際細(xì)菌Serratiasp.NDW3溶磷過(guò)程中菌株溶磷量、GADH活性與ga2dh基因表達(dá)量的變化，對(duì)ga2dh基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)ga2dh基因在大腸埃希菌BL21中的表達(dá)?！窘Y(jié)果】Serratiasp.NDW3溶磷過(guò)程中g(shù)a2dh基因的相對(duì)表達(dá)量在12 h最大，GADH活性在24 h達(dá)到最大值，NDW3溶磷量在36 h后趨于穩(wěn)定。從Serratiasp.NDW3菌株中克隆獲得了781 bp的ga2dh基因序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該序列與Serratiasp. SCBI菌株的基因相似性為99.62%，編碼的蛋白屬于葡萄糖酸脫氫酶亞基3超家族，主要由3個(gè)α-螺旋構(gòu)成，且氨基酸序列中包含有位于胞內(nèi)、胞外和跨膜的區(qū)域。ga2dh基因在大腸埃希菌BL21體內(nèi)表達(dá)，能夠使得菌體GADH的活性顯著增加?！窘Y(jié)論】Serratiasp. NDW3菌株溶磷的主要機(jī)制依賴于直接氧化途徑，ga2dh基因編碼的小亞基不僅對(duì)GADH活性起重要作用，也是介導(dǎo)GADH跨膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分。

水稻； 溶磷菌； GADH；ga2dh； 基因表達(dá)； 酶活性

磷是繼氮之后作物所需的第2大營(yíng)養(yǎng)元素，在作物光合作用、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及大分子物質(zhì)的生物合成中都起著關(guān)鍵的作用[1]。但根據(jù)資料調(diào)查顯示，我國(guó)有74%的耕地土壤缺磷[2]?？扇苄粤追适┤朕r(nóng)田后，由于土壤的固定作用，大部分迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽魑镫y以吸收的無(wú)效磷，無(wú)法被植物直接吸收利用，導(dǎo)致作物對(duì)磷肥的當(dāng)季利用率不超過(guò)30%[3]。土壤中溶磷微生物能依靠自身的代謝或與其它生物協(xié)同作用[4]，將不溶性磷轉(zhuǎn)變成植物可吸收利用的磷。

溶磷菌可明顯促進(jìn)作物的株高、干質(zhì)量[5]及產(chǎn)量的增加[6]，也可以促進(jìn)作物對(duì)磷素的吸收[7]，增加土壤生物量。因此，越來(lái)越多的溶磷菌被分離，主要集中在假單胞菌屬Pseudomonas、埃希氏菌屬Escherichia、腸細(xì)菌屬Enterbacter等[8]。不同的溶磷菌溶磷的形式不同。微生物分泌的有機(jī)酸可作為Ca2+的螯合劑，從而使磷從不溶性磷酸鹽中釋放出來(lái)。其中葡萄糖酮酸在土壤磷酸鹽的風(fēng)化和溶解過(guò)程中起著重要作用[9]。Arvind等[10]提出，參與直接氧化途徑的葡萄糖脫氫酶(GDH)和葡萄糖酸脫氫酶(GADH)都定位在溶磷微生物的細(xì)胞膜外側(cè)[8]，當(dāng)葡萄糖擴(kuò)散至質(zhì)膜時(shí)，在GDH的作用下被氧化成葡糖酸，葡糖酸進(jìn)一步在GADH的作用下被直接氧化形成酸性特別強(qiáng)的葡糖酮酸[11],然后被分泌到細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，使胞外處于酸性極高的環(huán)境，從而溶解不溶性磷酸鈣[12]。

FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)-GADH由FAD-脫氫酶大亞基、含有血紅素C的中間亞單位和1個(gè)小亞基組成，大亞基和中間亞單位的功能主要是參與氫及電子的傳遞，小亞基功能未知[13]。本研究以水稻根際土壤分離到的溶磷細(xì)菌—Serratiasp. NDW3為研究對(duì)象，對(duì)菌株NDW3 GADH小亞基基因ga2dh進(jìn)行克隆與分析，旨在明確該基因的性質(zhì)以及在菌株NDW3溶磷過(guò)程中的作用特點(diǎn)，進(jìn)一步揭示溶磷菌的溶磷機(jī)制，為溶磷菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株Serratiasp. NDW3為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)作物營(yíng)養(yǎng)代謝與調(diào)控實(shí)驗(yàn)室于2014年分離于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田、具有較好溶磷能力的溶磷菌。大腸埃希菌菌株DH5α、BL21(DE3)及載體pET28a(+) 均為該實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T載體試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及限制性內(nèi)切酶、Ex-Taq酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)于TaKaRa公司。細(xì)菌RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，Easy Script TMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

NBRIP (National botanical research institute′s phosphate) 培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[14]。

1.2 菌株NDW3溶磷量的測(cè)定

采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定菌株的溶磷量[15]，以NBRIP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Ca3(PO4)2為唯一磷源，接種等量滅活菌液為對(duì)照。菌株NDW3接種在LB培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)液細(xì)胞濃度為D600 nm=0.6時(shí)，菌液以φ為1%的接種量接入裝有50 mL液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，30 ℃，150 r·min-1進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)3次。每隔12 h取樣1次，將2 mL發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，取1 mL上清液加水至3 mL，加入3 mL定磷試劑，測(cè)定上清液的含磷量，計(jì)算供試菌株的溶磷量；菌體用于RNA的提取。

1.3 GADH活性的測(cè)定

GADH活性測(cè)定參照Yang等[16]方法：通過(guò)鐵氰化鉀作為電子受體，取780 μL McIIvaine緩沖液放入25 mL離心管中，然后加入0.1 mol·L-1鐵氰化鉀和1 mol·L-1葡萄糖酸鈉各100 μL，混勻后加入20～200 μL提取的粗酶液，再加入500 μL鐵-Dupanol溶液終止反應(yīng)，25 ℃溫育20 min進(jìn)行顯色，最后加入3.5 mL去離子水，在波長(zhǎng)為660 nm條件下測(cè)定光密度值，空白對(duì)照用去離子水代替酶液。GADH酶活力單位被定義為每分鐘內(nèi)催化1 μmol葡萄糖酸鈉所需的酶量(4.0個(gè)光密度等于氧化1 μmol的葡萄糖酸)，酶活性用每毫克蛋白的酶活力單位數(shù)表示。

1.4 熒光定量PCR

根據(jù)細(xì)菌總RNA試劑盒方法提取菌株NDW3的RNA，采用Easy ScriptTMFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用定量試劑SYBR Premix ExTaqTM進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，GA2DH-F：5′-CATCGTTTACAGCGTGGACTAC-3′， GA2DH-R:5′-TCCAGGTGTAGCGGTGAAATG-3′ ，內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA，引物16S-F: 5′-CCAACCGACCTTTTTCACCC-3′, 16S-R: 5′-TACGGCGTGTTCAT-CTGGC-3′。反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix ExTaqTMII (2×) 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。利用Step One 生物軟件和Microsoft Excel 分析處理試驗(yàn)結(jié)果，參照ABI公司提供的ΔΔCt計(jì)算方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ga2dh基因的克隆與序列分析

從GenBank上檢索序列，根據(jù)同屬菌ga2dh基因的序列設(shè)計(jì)引物。以菌株NDW3的基因組DNA為模板，分別以ga2dh-F: 5′-GACTATCTTTGGATGGAATGTG-3′和 ga2dh-R: 5′-GCGTCTACTTTTTTCA-TTACCG-3′為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)正確的DNA片段經(jīng)凝膠試劑盒回收與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α。經(jīng)酶切及PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序。將核苷酸序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列后進(jìn)行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并利用SWISS-MODLE網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，TMHMM-2.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)。

1.6 原核表達(dá)載體pET-28a-ga2dh的構(gòu)建與鑒定

以測(cè)序?yàn)殛?yáng)性的重組質(zhì)粒pMD18-T-ga2dh為模板，兩端具有EcoR I/XhoI酶切位點(diǎn)的引物Ga2dh-F:5′-CCGGAATTCGACTATCTTTGGATGGAATGTG-3′和Ga2dh-R:5′-CCGCTCGAGGCGTCTACTTTTTTCATTACCG-3′(下滑線部分為酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR，獲得兩端分別帶有EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)的目的片段。EcoR I和XhoI雙酶切目的片段和pET28a(+)，凝膠回收并于16 ℃金屬浴內(nèi)連接12 h。連接產(chǎn)物42 ℃熱激轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

1.7 重組質(zhì)粒pET-28a-ga2dh在大腸埃希菌體內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽(yáng)性的BL21(pET-28a-ga2dh)挑取單菌落到含卡那霉素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r·min-1，過(guò)夜培養(yǎng)。以φ為1%的接種量將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到含有Kan抗性的 LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃，160 r·min-1培養(yǎng)至D600 nm=0.6。加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)2和4 h，各取1 mL菌液，10 000 r·min-1，離心10 min收集菌體。將收集到的菌體加入100 μL樣品溶解液充分混勻。100 ℃處理10 min，裂解菌體細(xì)胞。12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，上樣20 μL，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.8 大腸埃希菌GADH活性的測(cè)定

菌體BL21(pET-28a-ga2dh)及BL21(pET-28a)GADH活性測(cè)定方法如下：將過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液，按φ為0.5% 接種于100 mL LB培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)液細(xì)胞濃度D600 nm=0.6時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每隔1 h取菌液20 mL,4 ℃，10 000 r·min-1離心10 min后，收集菌體。向菌體中加入含有1 mmol·L-1β-巰基乙醇的0.01 mol·L-1pH=6的磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲破碎20 min(功率50%，10 s工作，20 s間歇)，4 ℃浸提3 h。4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，去上清，向其中加入含有φ為1%的Triton-X 100的0.01 mol·L-1pH=6的磷酸鹽緩沖液3 mL，0 ℃，80 r·min-13 h，之后4 ℃浸提過(guò)夜，12 000 r·min-1離心10 min后，上清即為粗酶液。酶活性的測(cè)定參照“1.3”, 數(shù)據(jù)采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDW3溶磷量、GADH活性、ga2dh基因表達(dá)

為了明確GADH小亞基基因ga2dh的表達(dá)與GADH活性及溶磷之間的關(guān)系，測(cè)定了菌株NDW3在96 h內(nèi)溶磷量的變化及GADH的活性。如圖1所示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，溶磷量在36 h之前表現(xiàn)出不斷增加的趨勢(shì)，36～96 h內(nèi)變化不明顯。GADH活性在12 h時(shí)較小，24 h時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸降低。48 h內(nèi)ga2dh表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而下降，12 h相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于48 h。

2.2 ga2dh基因的克隆與鑒定

如圖2所示，以Serratiasp. NDW3提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出約780 bp左右清晰的目的片段。利用PCR和雙酶切驗(yàn)證目的片段與pMD18-T載體的連接，PCR與酶切都獲得清晰的目的條帶，說(shuō)明目的基因與載體連接成功。

2.3 ga2dh基因序列分析

利用BLAST對(duì)ga2dh基因序列及GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。菌株NDW3的ga2dh基因序列與Serratiasp. SCBI (CP003424.1)相似性最高，為99.62%。ga2dh基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3A看出，ga2dh基因編碼的蛋白屬于葡萄糖酸脫氫酶亞基3超家族，結(jié)構(gòu)主要由3個(gè)α-螺旋構(gòu)成，且預(yù)測(cè)結(jié)果的局部相似性均超過(guò)0.6。利用TMHMM-2.0將蛋白質(zhì)序列進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)(圖3B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列中前12個(gè)氨基酸位于胞內(nèi)，36位氨基酸之后形成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)位于胞外，13～35氨基酸位點(diǎn)之間形成跨膜的區(qū)域。

圖1 菌株NDW3溶磷量、GADH活性及ga2dh基因表達(dá)量的變化

Fig.1 Changes in soluble phosphorus content, GADH activity andga2dhgene expression level during phosphate solubilizing by strain NDW3

M: DL2000 Marker; 1：NDW3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2：重組質(zhì)粒的PCR鑒定； 3：重組質(zhì)粒的酶切鑒定。

圖2ga2dh基因的PCR擴(kuò)增與鑒定

Fig.2 PCR amplification and verification ofga2dhgene

A: ga2dh蛋白保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模擬及可靠性檢測(cè) B: ga2dh蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

圖3ga2dh基因序列的生物信息學(xué)分析
Fig.3 Bioinformatic analysis ofga2dhgene

2.4 ga2dh基因在大腸埃希菌中的表達(dá)

2.4.1 原核表達(dá)載體pET-28a-ga2dh的構(gòu)建 利用測(cè)序結(jié)果正確的pMD18-T-ga2dh為模板進(jìn)行PCR，獲得兩端帶有EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)的目的片段，利用雙酶切與載體pET-28a進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖4所示，酶切后的基因片段及載體大小分別與目的基因及pET-28a載體的大小一致，說(shuō)明原核表達(dá)載體pET-28a-ga2dh構(gòu)建成功。

2.4.2 原核表達(dá)載體在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將 BL21(pET-28a-ga2dh)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖5所示，BL21(pET-28a-ga2dh)

M: DL5000 Marker；1：重組質(zhì)粒的酶切片段。

在相對(duì)分子質(zhì)量約27 000 處存在明顯的蛋白表達(dá)條帶，且含量遠(yuǎn)高于對(duì)照，說(shuō)明該基因在大腸埃希菌BL21中可以表達(dá)。

M：蛋白Marker；1： BL21(pET-28a)；2：未誘導(dǎo)的BL21(pET-28a-ga2dh)；3：誘導(dǎo)的BL21(pET-28a-ga2dh)。

圖5ga2dh基因在BL21中的蛋白表達(dá)
Fig.5 Protein expression ofga2dhgene in bacterium BL21

2.4.3 大腸埃希菌BL21菌體GADH活性分析 利用LB培養(yǎng)基對(duì)帶有不同質(zhì)粒的BL21菌株進(jìn)行培養(yǎng)，GADH活性如表1所示。結(jié)果表明：BL21(pET-28a-ga2dh)菌株GADH活性隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸增強(qiáng)，在4 h時(shí)菌株的酶活性為411.67 U·mg-1， 顯著高于其他時(shí)間段 (P<0.05)。BL21(pET-28a) 菌株在4 h內(nèi)GADH活性也隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)，但同一時(shí)間內(nèi)，酶活性都遠(yuǎn)低于BL21(pET-28a-ga2dh)，且4 h時(shí)，酶活性僅為BL21(pET-28a-ga2dh)體內(nèi)酶活性的20.65%。這說(shuō)明GADH小亞基基因ga2dh的表達(dá)，能夠使大腸埃希菌BL21 GADH的活性顯著增加。

表1 GADH活性分析
Tab.1 The activity analysis of GADH

t培養(yǎng)/hGADH活性1)/(U·mg-1)BL21(pET?28a)BL21(pET?28a?ga2dh)144．67±2．52c124．00±16．09d247．33±2．53c165．67±21．00c371．67±5．69b294．67±24．44b485．00±3．06a411．67±24．18a

1) 同列數(shù)據(jù)后凡具有一個(gè)相同小寫字母，表示酶活性差異不顯著 (P>0.05, Duncan’s 法 )。

3 討論與結(jié)論

Serratiasp.是1類具有溶磷能力的革蘭陰性菌株，SerratiamarcescensGPS 5[17]，Serratiasp. MSK1[18]等菌株已被分離并鑒定。本研究從水稻根際土壤中也分離到1株溶磷能力較好的菌株Serratiasp. NDW3。Goldstein等[19]認(rèn)為菌株溶磷的特性受無(wú)機(jī)磷酸鹽濃度的影響。本試驗(yàn)以NBRIP為培養(yǎng)基，不溶性磷酸鈣為唯一磷源時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株NDW3溶磷量表現(xiàn)出先增加，36 h后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),這說(shuō)明菌株NDW3溶磷可能同樣受不溶性磷的調(diào)節(jié)，培養(yǎng)基中可溶性磷濃度達(dá)到一定值時(shí)，菌株溶磷特性受到抑制。

溶磷微生物的溶磷機(jī)理非常復(fù)雜，Sashidhar等[8]認(rèn)為葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸是細(xì)菌溶磷的主要機(jī)制，革蘭陰性細(xì)菌由于能分泌大量的有機(jī)酸進(jìn)入外膜空間，其溶磷效果要好于革蘭陽(yáng)性菌。研究發(fā)現(xiàn)參與直接氧化途徑的酶GDH和GADH都錨定在內(nèi)膜上，但催化結(jié)構(gòu)域卻朝向細(xì)胞質(zhì)膜的外表面，直接氧化途徑產(chǎn)生的葡萄糖酸和2-酮基葡糖酸被分泌到細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，使胞外處于酸性極高的環(huán)境[8]。ga2dh基因編碼GADH分子的1個(gè)小亞基，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ga2dh基因的相對(duì)表達(dá)量在12 h最大，GADH活性在24 h達(dá)到最大值，而溶磷量在36 h后趨于穩(wěn)定，這種規(guī)律可能是因?yàn)榫w內(nèi)ga2dh基因表達(dá)后，GADH蛋白的形成需要一定的時(shí)間，或在培養(yǎng)過(guò)程中隨著時(shí)間的增加，pH會(huì)抑制葡萄糖酮酸的產(chǎn)生，從而對(duì)酶產(chǎn)生了反饋抑制作用。ga2dh基因表達(dá)量、酶活性與溶磷量三者表現(xiàn)出依次滯后的趨勢(shì)與高度相關(guān)性，說(shuō)明Serratiasp. NDW3菌株溶磷的主要機(jī)制可能仍是依賴于直接氧化途徑。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ga2dh基因編碼的蛋白質(zhì)序列存在跨膜以及胞內(nèi)和胞外的區(qū)域。在大腸埃希菌中表達(dá)該基因可以明顯增加菌體GADH的活性。這說(shuō)明ga2dh基因編碼的小亞基不僅對(duì)GADH活性起重要作用，也是介導(dǎo)GADH的跨膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Cloning and expression analysis of GADH small subunit gene ga2dh from Serratia sp. NDW3

YANG Meiying1, LU Dongxue1, SUN Hemei1, WU Zhihai2, YUE Shengtian1, FU Li1

(1 College of Life Science， Jilin Agricultural University, Changchun, 130118 China；
2 Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, 130118 China)

【Objective】 To clone and identify GADH small subunit genega2dh. 【Method】 Changes in soluble phosphorus content, GADH activity andga2dhgene expression level during the phosphate solubilizing process ofSerratiasp. NDW3 from rice rhizosphere were studied. Thega2dhgene was cloned and expressed inEscherichiacoliBL21, and bioinformatic analysis was performed. 【Result】 The relative expression ofga2dhgene in the process of phosphate solubilizing bySerratiasp. NDW3 reached maximum at 12 h, GADH activity reached maximum at 24 h, and the soluble phosphorus content stabilized after 36 h. Thega2dhgene sequence of 781 bp was obtained fromSerratiasp.NDW3 by cloning. The similarity betweenga2dhgene andSerratiasp. SCBI sequences was 99.62% based on bioinformatic analysis. The protein encoded byga2dhbelonged to the superfamily of gluconate dehydrogenase subunit 3 and was composed of threeα-helices. The amino acid sequence was consisted of intracellular, extracellular and transmembrane regions. The expression ofga2dhgene inE.coliBL21 significantly increased GADH activity. 【Conclusion】 The main mechanism of phosphate solubilizing bySerratiasp. NDW3 is through the direct oxidation pathway. The small subunit encoded byga2dhgene not only plays an important role in GADH activation, but also is part of the transmembrane structure of GADH.

rice; phosphate solubilizing bacteria； GADH；ga2dh； gene expression； enzyme activity

2016- 06- 14優(yōu)先出版時(shí)間：2017-01-10

楊美英(1974—)，女，教授，博士，E-mail:jiaumeiying@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201687)

S565.101

A

1001- 411X(2017)02- 0069- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1423.024.html

楊美英, 盧冬雪, 孫合美， 等.Serratiasp. NDW3 GADH小亞基基因ga2dh的克隆及表達(dá)分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(2):69- 74.