尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因的克隆和組織表達(dá)分析

胡欣欣，曹建萌，盧邁新，陳 瓊，陳昆平

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因的克隆和組織表達(dá)分析

胡欣欣1,2，曹建萌1，盧邁新1，陳 瓊1,2，陳昆平1,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

為了探究補(bǔ)體C9在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)免疫中發(fā)揮的作用，本研究克隆并分析了尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因(OnC9)。結(jié)果顯示：OnC9的cDNA序列全長2 502 bp，包含1 761 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼586個(gè)氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明，OnC9與牙鲆(Paralichthysolivaceus)補(bǔ)體C9氨基酸相似性最高，達(dá)73.0%，與其他魚類補(bǔ)體C9的相似性介于49.3%～71.4%之間。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，OnC9基因在所檢測(cè)的各個(gè)組織或器官中表達(dá)水平有明顯差異，在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓，在腦、脾臟、心臟、頭腎、胸腺和血液中表達(dá)量最低。在無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染魚體后，肝臟、后腎等組織中OnC9表達(dá)量表現(xiàn)為在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出現(xiàn)三個(gè)峰值的波動(dòng)表達(dá)的規(guī)律。說明OnC9在無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚后的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)；補(bǔ)體C9；無乳鏈球菌；組織表達(dá)分析

補(bǔ)體系統(tǒng)(Complement System)是由一組可溶性蛋白、膜結(jié)合性蛋白和補(bǔ)體受體組成的蛋白反應(yīng)系統(tǒng)，是一個(gè)高度復(fù)雜的免疫防御系統(tǒng)，具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)病原體的溶解與吞噬、免疫復(fù)合體的溶解等關(guān)鍵作用[1-3]。在魚類中，補(bǔ)體激活途徑有三種：經(jīng)典途徑(Classical complement pathway，CCP)、凝集素途徑(Lectin complement pathway，LCP)、旁路途徑(Alternative complement pathway，ACP)[4-5]。這三種途徑活化后，機(jī)體都將產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合體(Membrane attack complex，MAC)[6]。MAC是由C5b、C6、C7、C8和12-18個(gè)C9分子組成的兩性成孔結(jié)構(gòu)，可聚合在靶細(xì)胞表面，通過增加其通透性，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡，是補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種重要機(jī)制[7-8]。已有研究表明，天然單體補(bǔ)體C9作為單鏈糖蛋白可直接造成靶細(xì)胞的裂解，是介導(dǎo)MAC在靶細(xì)胞表面組裝的重要分子[9]。據(jù)報(bào)道，從人血清中提取的補(bǔ)體C9，即使在沒有其它補(bǔ)體組分的情況下，也能快速地引起細(xì)菌的完全死亡[10]。近年來，在草魚(Ctenopharyngodonidella)[11]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[13]等中已有補(bǔ)體C9基因的研究報(bào)道。而補(bǔ)體C9作為介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的重要組分，在尼羅羅非魚中還沒有相關(guān)研究。

羅非魚，屬鱸形目(Perciformes)鱺魚科(Cichlidae)，是我國淡水魚類養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)品種，但近年來鏈球菌病嚴(yán)重制約了羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。當(dāng)前認(rèn)為，進(jìn)行抗鏈球菌病羅非魚新品種的定向選育和應(yīng)用疫苗對(duì)該病進(jìn)行免疫預(yù)防是解決羅非魚鏈球菌病的兩種可行的方法[14]。而上述工作都依賴于對(duì)羅非魚免疫基因和免疫機(jī)制的系統(tǒng)的研究。本研究選擇尼羅羅非魚免疫相關(guān)基因補(bǔ)體C9 (OnC9)為對(duì)象，既克隆了OnC9全長cDNA序列，又應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time Quantitative PCR，qPCR)技術(shù)分析其在健康魚不同組織中的表達(dá)情況，也了解無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染之后OnC9基因表達(dá)的變化，旨在探究OnC9在羅非魚免疫中的功能，為后續(xù)研究疫苗發(fā)揮免疫預(yù)防功能的分子機(jī)理、開發(fā)該基因潛在的抗鏈球菌病相關(guān)分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用尼羅羅非魚8.5日齡胚胎和幼魚均取于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所高要養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地。幼魚平均體質(zhì)量為45 g，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周后，解剖4尾健康尼羅羅非魚，收集腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液等組織樣本，放入1.5 mL RNase-free凍存管中，液氮凍存，備用。

SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit和Advantage?2 PCR Enzyme System購于Clontech公司。2×EasyTaq?PCR SuperMix、總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒、All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit、TransStart?Top Green qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit、E.coliDH5α、pMT19-T Vecter、反轉(zhuǎn)錄RNA PCR Kit購于TaKaRa；用于瓊脂糖凝膠回收的試劑盒購于Omega公司。TIANgel Purification Kit購于天根生化科技有限公司。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的引物合成、測(cè)序都是由廣州艾基生物工程有限公司完成。

1.2 感染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行無乳鏈球菌感染羅非魚實(shí)驗(yàn)，確定半致死濃度。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：隨機(jī)取尼羅羅非魚150尾，平均分為5組，每組30尾(4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組)。37 ℃條件下培養(yǎng)無乳鏈球菌12 h，濃度經(jīng)測(cè)定為0.99×109CFU/mL。然后用磷酸鹽緩沖液將其濃度稀釋到104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL。實(shí)驗(yàn)組每尾魚腹腔注射200 μL，對(duì)照組注射等體積磷酸鹽緩沖液。病魚呈現(xiàn)打轉(zhuǎn)，不規(guī)則游動(dòng)等非正常狀態(tài)。7 d天之后，預(yù)驗(yàn)結(jié)果為：104CFU/mL組死亡2尾，105CFU/mL組死亡12尾，106CFU/mL組死亡26尾和107CFU/mL組死亡29尾，經(jīng)計(jì)算確定105CFU/mL為該批次實(shí)驗(yàn)的半致死濃度。

取健康尼羅羅非魚160尾，平均分到5個(gè)100 L水族箱中，一箱用作對(duì)照組，剩余用作實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射無乳鏈球菌(105CFU/mL)200 μL，對(duì)照組注射等體積的PBS緩沖液。細(xì)菌感染0、4、8、12、24、36、48、72、120、168 h，分別取4尾尼羅羅非魚的肝臟、腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓放入1.5 mL RNase-free凍存管中，液氮凍存，備用。

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒的操作說明，提取8.5日齡胚胎總RNA和幼魚各組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的提取效果，并用核酸蛋白定量儀(Bio-Rad Smartspic plus)檢測(cè)RNA純度和完整性。制備8.5日齡尼羅羅非魚cDNA，按照PrimeScriptTMII 1st strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行操作；RACE-Ready cDNA的制備，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書進(jìn)行操作。qPCR cDNA的制備，按照All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit(全式金)說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)所用PCR引物見表1。

表1 尼羅羅非魚OnC9基因克隆和組織表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used for amplifying cDNA and analyzing expression for the OnC9 gene in O. niloticus

以尼羅羅非魚補(bǔ)體C9的預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM-003449649.2)為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物C9-f和C9-r，以8.5日齡的尼羅羅非魚總cDNA為模板擴(kuò)增OnC9 cDNA的中間片段。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O 11 μL，Total 25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束之后，其反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用TIANgel Purification Kit回收純化目的片段，把純化的目的片段與載體pMD-19T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，37 ℃條件下過夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后獲得陽性克隆，送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)已獲得的中間片段，設(shè)計(jì)上游5’RACE引物C9-5’RACE-T、C9-5’RACE-N和下游3RACE引物C9-3RACE-1T、C9-3RACE-1N、C9-3RACE-2T、C9-3RACE-2N，與SMARTer試劑盒中自帶的通用引物UPM和NUPM，通過巢式PCR擴(kuò)增OnC9基因的3端和5’端。反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增程序1：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增程序2：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃延伸3 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。結(jié)束之后，其產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、連接、陽性克隆檢測(cè)和測(cè)序與中間片段克隆的步驟相同。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件對(duì)測(cè)序后所得序列進(jìn)行同源性檢索，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，得到全長cDNA序列。利用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在線確定開放閱讀框并預(yù)測(cè)氨基酸序列；ExPASy網(wǎng)站的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)；SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白的信號(hào)肽；TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)；利用PSORT (http://psort.hgc.jp/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析蛋白結(jié)構(gòu)；ExPASy網(wǎng)站的PROSITE (http://prosite.expasy.org/prosite.html)在線預(yù)測(cè)氨基酸功能域。

使用軟件clustalX進(jìn)行氨基酸的多序列比較，DNASTAR中的MegAlign比較不同物種同源基因的相似性。MEGA 5.1軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 OnC9基因組織表達(dá)分析

根據(jù)已克隆得到的OnC9 cDNA序列，設(shè)計(jì)qPCR引物，將4尾健康尼羅羅非魚的12個(gè)健康組織(腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液)和無乳鏈球菌感染后的6個(gè)相關(guān)組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行qPCR。同時(shí)，根據(jù)已克隆出的OnC9 cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物C9-q，以EF-1α為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：10 μL 2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix，引物各0.4 μL，passive Reference Dye(50×) 0.4 μL，ddH20 7.8 μL，cDNA模板1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。qPCR反應(yīng)在ABI Stepone plus熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)上進(jìn)行，每個(gè)待測(cè)cDNA樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。qPCR數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法，用SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 OnC9 cDNA克隆和序列分析

結(jié)果序列包含1 761 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼586個(gè)氨基酸，5’非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)長133 bp，3UTR長608 bp。在3UTR區(qū)出現(xiàn)1個(gè)mRNA不穩(wěn)定性信號(hào)ATTTA和1個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA(圖1)。使用ProtParam分析OnC9前體蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)其分子式為C2787H4413N813O895S44，分子質(zhì)量是65.04 ku，等電點(diǎn)(pI)為5.99，半衰期是30 h，不穩(wěn)定指數(shù)是39.86，屬于穩(wěn)定蛋白。親水性平均指數(shù)是-0.557，屬于親水性蛋白。經(jīng)SignalP 4.1 Server在線分析可知，OnC9蛋白第1～27個(gè)氨基酸是信號(hào)肽，27～28氨基酸之間為可能的剪切位點(diǎn)。經(jīng)TMHMM在線預(yù)測(cè)可知，該蛋白586個(gè)氨基酸全部位于膜外，屬分泌蛋白。PSORT分析結(jié)果也證實(shí)OnC9蛋白主要在胞外(胞外82%、溶酶體19%、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)20%)。

OnC9存在血小板反應(yīng)素1(Thrombospondin 1，TSP1)結(jié)構(gòu)域、低密度脂蛋白受體A(LDL-receptor class A， LDLRA)結(jié)構(gòu)域、膜攻擊復(fù)合物/穿孔素(Membrane attack complex/perforin，MACPF)結(jié)構(gòu)域和表皮生長因子(Epidermal growth factor-like domain，EGF-Like)結(jié)構(gòu)域。TSP1結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸區(qū)段為：38～88和546～582；LDLRA結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸區(qū)段為：94～130；MACPF結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸區(qū)段為：275～487；EGF-Like結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的氨基酸區(qū)段為491～524。另外，使用PROSITE軟件搜索到OnC9還存在其它一些推斷的蛋白位點(diǎn)：13個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)G[^EDRKHPFYW]-x{2-[STAGCN][^P]位于G14、G64、G67、G315、G325、G366、G369、G416、G500、G535、G544、G557、G570，13個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)[ST]-x{2}-[DE] (aa45～48、74～77、96～99、124～127、199～202、237～240、254～257、264～267、334～337、355～358、438～441、445～448、455～458)。10個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)[ST]-x-[RK] (aa53～55、130～132、233～235、287～289、348～350、355～357、393～395、412～414、423～425、525～527)等。另外還存在1個(gè)酰胺化位點(diǎn)x-G[RK][RK] (aa557～560)和一個(gè)細(xì)胞黏著序列RGD (aa577～579)。

2.2 同源比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用DNASTAR中的MegAlign軟件將OnC9氨基酸序列和已報(bào)道的序列進(jìn)行同源性分析，OnC9與牙鲆(序列登陸號(hào)：BAA86878)、紅鰭東方鲀(Fugurubripes，AAC60288)、底鳉(Fundulusheteroclitus，AAR87007)、虹鱒(CAJ01692)、香魚(Plecoglossusaltivelis，CBX31962)、草魚(ABN49522)、人(Homosapiens，NP-001728)、小鼠(Musmusculus，NP-038513)、牛(Bostaurus，NP-001030441)、家兔(Oryctolaguscuniculus，NP-001075815)、爪蟾(Xenopuslaevis，NP-001079814)等物種的補(bǔ)體C9的氨基酸序列同源性分別為：73.0%、71.4%、63.9%、57.9%、54.3%、49.3%、38.3%、38.2%、41.9%、39.3%、40.6%。

圖1 尼羅羅非魚OnC9基因cDNA全序列及推測(cè)氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA and deduced amino acid sequences of the C9 gene in O.niloticus數(shù)字代表該行末核苷酸位點(diǎn)，加粗?jǐn)?shù)字代表該行末氨基酸位點(diǎn)，橢圓標(biāo)識(shí)起始密碼子和終止密碼子，粗斜體標(biāo)示多聚腺苷酸加尾信號(hào)，粗體字為poly(A)，大括號(hào)標(biāo)示N-糖基化位點(diǎn)，下劃線標(biāo)示為cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，波浪線標(biāo)示為蛋白信號(hào)肽，雙下劃線所示為LDLRA信號(hào)序列，方框所示為MACPF信號(hào)序列，灰色陰影表示EGF信號(hào)序列。

利用MEGA 5.1軟件對(duì)OnC9氨基酸序列與其他物種的補(bǔ)體C9氨基酸序列進(jìn)行鄰接聚類分析(圖2)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，尼羅羅非魚首先與牙鲆、紅鰭東方鲀聚類，然后與虹鱒、底鳉、香魚、草魚等聚為一簇；人和哺乳動(dòng)物聚為一支，而兩棲類的非洲爪蟾單獨(dú)為一支，位于前面兩大分支的中間。

圖2 尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因和其它動(dòng)物的NJ分子進(jìn)化樹Fig.2 NJ-phylogenetic tree of C9 genes constructed by using amino acid sequences

對(duì)尼羅羅非魚和其它脊椎動(dòng)物進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示參與比對(duì)的脊椎動(dòng)物都具有TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like結(jié)構(gòu)域，哺乳動(dòng)物僅N端存在一個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域，魚類和兩棲類的補(bǔ)體C9氨基酸序列在C端和N端各存在一個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域，哺乳動(dòng)物C端不存在TSP1結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖3 魚類、兩棲類和哺乳動(dòng)物補(bǔ)體C9 C末端序列比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of C-terminal amino acid sequences of fish, amphibians and mammalian C9

2.3 OnC9基因在健康尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)分析

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，OnC9基因在所檢測(cè)的12個(gè)組織器官(腦、后腎、脾臟、心臟、肝臟、鰓、肌肉、頭腎、皮膚、胸腺、腸道、血液)中表達(dá)水平有明顯差異。OnC9在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腸道、后腎、鰓、皮膚，在肌肉中表達(dá)量比較低，腦、脾臟、心臟、頭腎、胸腺和血液中表達(dá)量最低。

圖4 尼羅羅非魚補(bǔ)體C9基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.4 Tissue distribution of the OnC9 gene in O. niloticus相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2.4 感染無乳鏈球菌后OnC9基因表達(dá)變化分析

尼羅羅非魚感染無乳鏈球菌后，不同時(shí)段下肝臟、腸道、后腎、肌肉等組織的OnC9表達(dá)變化如圖5所示。

圖5 無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚補(bǔ)體C9 基因在尼羅羅非魚中各組織的表達(dá)情況Fig.5 Quantitative expression profile of O. niloticus C9 gene after the challenge with Streptococcus agalactiae

3 討論

3.1 OnC9序列結(jié)構(gòu)及同源性分析

本研究克隆得到的5’UTR和3UTR序列比預(yù)測(cè)序列更長更完整。相似性分析顯示，克隆得到的序列與預(yù)測(cè)序列相似性為99%。在本研究中，OnC9同樣存在TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like結(jié)構(gòu)域；與其它硬骨魚類一樣，OnC9具有兩個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域，在氨基酸序列C端比哺乳動(dòng)物多一個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域。MAC中的C6，C7，C8α，C8β同樣存在重復(fù)的TSP1結(jié)構(gòu)域，所以從分子結(jié)構(gòu)方面來說，OnC9的氨基酸序列與被廣泛接受的其他物種的補(bǔ)體C9推導(dǎo)序列非常相似[11-13]。

NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，OnC9氨基酸序列與魚類的相似性為49.3%～73.0%，與哺乳類的相似性為38.2%～41.9%，與兩棲類補(bǔ)體C9的相似性為40.6%。同進(jìn)化樹顯示結(jié)果一樣，OnC9與魚類有較高的同源性，可進(jìn)一步確定得到的序列為補(bǔ)體C9氨基酸序列。同時(shí)，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，尼羅羅非魚首先與牙鲆(鰈形目)、紅鰭東方鲀(鲀形目)聚類，然后與虹鱒(鮭形目)、草魚(鯉形目)等聚為一簇，這與傳統(tǒng)分類觀點(diǎn)一致，即鯉形目的魚類是最先從魚類祖先中進(jìn)化出去的，然后是鮭形目種類，而鲀形目和鰈形目魚類則被認(rèn)為是種類眾多的、較為高等的鱸形目中進(jìn)化出來的[15]。

3.2 OnC9組織表達(dá)特征

在哺乳動(dòng)物中，肝臟是大多數(shù)補(bǔ)體成分的主要產(chǎn)生部位[16-17]。補(bǔ)體C9在硬骨魚中的表達(dá)模式也類似。在草魚中，補(bǔ)體C9在肝臟的表達(dá)量最高，其次是脾、頭腎等[11]；條石鯛(Oplegnathusfasciatus)補(bǔ)體C9在肝臟的表達(dá)量最高，其次是血液和腦[18]；鮸(Miichthysmiiuy) 補(bǔ)體C9在肝臟中表達(dá)量非常高，其次是眼睛[15]。健康尼羅羅非魚補(bǔ)體C9在后腎、肝臟、鰓、肌肉、皮膚、腸道中均有表達(dá)，主要在肝臟中表達(dá)，在腸道、后腎、鰓、肌肉、皮膚中有少量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)同其它魚類補(bǔ)體C9熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣：補(bǔ)體C9在肝臟的表達(dá)量最高，這同時(shí)也驗(yàn)證了肝臟是合成補(bǔ)體的主要器官[17-19]。另外，條石鯛和尼羅羅非魚同屬鱸魚目，條石鯛補(bǔ)體C9在肝臟的表達(dá)量最高，其次是血液和腦，OnC9表達(dá)其次是腸道和后腎，這可能由于檢測(cè)的補(bǔ)體C9基因?qū)儆趦蓚€(gè)亞型。

無乳鏈球菌是危害羅非魚的主要病原之一。因此，亟需對(duì)無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。本研究表明，無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚168 h內(nèi)，肝臟、腸道、后腎、皮膚、肌肉、鰓中的OnC9表達(dá)量均表現(xiàn)為在感染后12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出現(xiàn)三個(gè)峰值的波動(dòng)式表達(dá)的規(guī)律，這與趙雪錦[20]在“粉玉”體色甌江彩鯉中的發(fā)現(xiàn)一致。此外，孟繁星[15]對(duì)鮸注射鰻弧菌(Vibrioanguillarum)后，補(bǔ)體C9的表達(dá)同樣呈現(xiàn)波動(dòng)式表達(dá)的規(guī)律。qPCR結(jié)果表明無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚可有效誘導(dǎo)肝臟中OnC9的表達(dá)。同“粉玉”體色甌江彩鯉、鮸等一樣，在尼羅羅非魚中，相對(duì)于其它組織，OnC9在肝臟中的表達(dá)是非常高的，這表明OnC9和大多數(shù)補(bǔ)體成分一樣，屬于急性期蛋白(acute phase protein，APP)[16, 21]。動(dòng)物體內(nèi)APP具有多種結(jié)構(gòu)和功能，并且它們?cè)谘装Y反應(yīng)中促進(jìn)組織修復(fù)和再生，從而使機(jī)體回復(fù)到內(nèi)穩(wěn)態(tài)[22]。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Cloning and expression analysis of complement 9 gene in Oreochromis niloticus

HU Xin-xin1,2, CAO Jian-meng1, LU Mai-xin1, CHEN Qiong1,2, CHEN Kun-ping1,2

( 1.KeyLab.ofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,MinistryofAgriculture,PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China; 2.CollegeofFisheries&Life,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

As a member of the complement system, complement 9 (C9) plays a key role in forming the pore-like membrane attack complex (MAC) of complement on target cells, which has the function of pore forming and is the effective component leading to cell lysis. In the present study, a full-length C9 (OnC9) cDNA ofOreochromisniloticus was 2 502 bp, containing 1 761 bp open reading frame, encoding 586 amino acids. The deduced amino acid sequence ofOnC9 shared 73.0% similarity with PoC9 (ParalichthysolivaceusC9), and 49.3%-71.4% identity with the C9 of other teleosts. Real-time quantitative PCR (qPCR) analysis demonstrated that the expression level ofOnC9 in different tissues ofO.niloticuswas significantly different, and the highest level was detected in the liver; the lower level was detected in intestine, kidney, gills, skin and muscle and the lowest level was detected in brain, spleen, heart, head kidney, thymus and blood. The expression ofOnC9 in liver, kidney and the other tissues appeared three peaks fluctuating at 12 hours, 48 (or 36) hours and 120 hours after infection ofStreptococcusagalactiae. The results suggested thatOnC9 may play an important role in tilapia immune response of anti-bacteria.

Oreochromisniloticus; C9;Streptococcusagalactiae; expression analysis

2016-04-18；

2016-09-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-49)；國家自然科學(xué)基金(31502205)；廣東省自然科學(xué)基金(2014A030310337)

胡欣欣(1991- )，女，碩士，專業(yè)方向?yàn)榱_非魚遺傳育種。E-mail:15139794169@163.com

盧邁新。E-mail: mx-lu@163.com

S917

A

1000-6907-(2017)01-0003-09