二十二碳六烯酸蝦青素酯的合成及質(zhì)譜分析

楊 魯，李學(xué)敏，周慶新，李兆杰，徐 杰，薛長(zhǎng)湖*

二十二碳六烯酸蝦青素酯的合成及質(zhì)譜分析

楊 魯，李學(xué)敏，周慶新，李兆杰，徐 杰，薛長(zhǎng)湖*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

以二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）與蝦青素作為反應(yīng)底物合成DHA蝦青素酯，探索出最佳反應(yīng)條件為：蝦青素250 mg、DHA 282 mg、無(wú)水丙酮5 mL、4-二甲氨基吡啶（DMAP）100 mg、1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亞胺（EDCI）100 mg，充氮、避光、磁力攪拌，25 ℃反應(yīng)3 h。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定結(jié)果表明：產(chǎn)物中存在游離蝦青素、DHA蝦青素單酯、DHA蝦青素雙酯。經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，采用峰面積歸一法進(jìn)行積分計(jì)算出各組分含量，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件下，產(chǎn)物中DHA蝦青素酯峰面積可達(dá)95.67%，其中主要為DHA蝦青素雙酯（77.46%）、部分DHA蝦青素單酯（18.21%）和少量游離蝦青素（3.24%）。用硅膠層析柱進(jìn)行梯度洗脫，增加溶劑極性（石油醚-丙酮體積比100∶0～92∶8）依次洗脫出DHA蝦青素雙酯、DHA蝦青素單酯，純度分別為（98.2±0.5）%和（94.0±0.6）%。

蝦青素；DHA蝦青素酯；合成；分離鑒定；質(zhì)譜

蝦青素（3,3’-二羥基-β,β’胡蘿卜素-4,4’-二酮基）是類(lèi)胡蘿卜素的一種，天然蝦青素主要來(lái)源于雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母、蝦、蟹等甲殼類(lèi)動(dòng)物[1]，但動(dòng)物不能合成蝦青素，只能通過(guò)食物鏈從植物或藻類(lèi)中獲得。蝦青素有多種結(jié)構(gòu)形式，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，天然蝦青素中9、13和15位為Z式結(jié)構(gòu)，因此蝦青素可能的幾何異構(gòu)體有全-E、(9Z)、(13Z)、(15Z)、(9Z、13Z)、(9Z、15Z)、(13Z、15Z)和(9Z、13Z、15Z)等[2]。蝦青素可以淬滅單線態(tài)氧、清除自由基[3-4]、防止或終止單線態(tài)氧和自由基引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[5]。因此，它具有抗癌[6-7]、抗炎、抗衰老、抗疲勞活性、預(yù)防心血管疾病[8-10]、保護(hù)視神經(jīng)、提高免疫力、有效降低糖尿病發(fā)病率[11-12]等功能。蝦青素因具有抗氧化性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等特性，已被用于保健食品[13-14]。在自然界中蝦青素以游離態(tài)、單酯或雙酯混合形式存在，且以酯的形式為主。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是ω-3多不飽和脂肪酸，對(duì)人類(lèi)健康具有重要的意義，有益于胎兒大腦及視力的發(fā)育[15]，對(duì)成年人而言，DHA是參與維持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)作的重要營(yíng)養(yǎng)物[16-18]。DHA的缺乏會(huì)引起多種疾病，如阿爾茨海默氏病、精神分裂癥、誦讀困難、注意力缺陷或多動(dòng)癥[19-20]。

近年來(lái)研究表明，蝦青素酯的吸收利用率較游離蝦青素更高，尤其是帶有中長(zhǎng)脂肪酸鏈的蝦青素酯，而單、雙酯的吸收利用率又有明顯區(qū)別[21-22]。所以本實(shí)驗(yàn)將蝦青素與DHA兩者結(jié)合起來(lái)，預(yù)期兩者能起到較好的協(xié)同作用，從而高效地發(fā)揮它們?cè)谌梭w健康方面的有益作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)辛酸蝦青素酯、棕櫚酸蝦青素酯、DHA蝦青素酯等單一脂肪酸蝦青素酯的化學(xué)合成[21,23]，但這些文獻(xiàn)中都只是合成這些單一脂肪酸蝦青素酯作為原料，并沒(méi)有對(duì)其合成方法進(jìn)行優(yōu)化，也沒(méi)有對(duì)這些單一脂肪酸蝦青素酯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)做詳細(xì)分析。本研究不僅優(yōu)化了化學(xué)合成DHA蝦青素酯的方法，還利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）聯(lián)用法具體分析了DHA蝦青素酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其裂解規(guī)律，為今后設(shè)計(jì)出高生物利用度蝦青素酯功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全反式蝦青素（all-trans-astaxanthin）標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；合成蝦青素（純度10%） 浙江巴仕曼生物科技有限公司；DHA（純度80%） 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類(lèi)健康實(shí)驗(yàn)室制備；4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）、1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDCI） 上海Medpep有限公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；色譜純甲基叔丁基醚美國(guó)Muskegon公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司；Heidolph Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；6410B Triple Quard LC/MS（配有大氣壓化學(xué)電離（atmospheric-pressure chemical ionization，APCI）源）、1100型HPLC儀（配有二極管陣列檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；YMC-Carotenoid-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本YMC株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 蝦青素原料預(yù)處理

稱(chēng)取600 g合成蝦青素（含量10%）置于5 L的燒杯里，加入3 L二氯甲烷，機(jī)械攪拌1 h，布氏漏斗抽濾，收集濾液，減壓旋蒸至干，濾渣倒回?zé)兄貜?fù)以上操作3 次，整個(gè)過(guò)程避光操作。最終得到64.45 g黑紫色粉末，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為84.22%，得率為90.47%。

1.3.2 DHA蝦青素酯的合成及反應(yīng)條件優(yōu)化

1.3.2.1 反應(yīng)體系的影響

各取250 mg蝦青素（0.419 mmol）、282 mg DHA（0.858 mmol）分別加入5 個(gè)棕色小瓶中，再分別加入5 mL無(wú)水丙酮、無(wú)水乙酸乙酯、無(wú)水二氯甲烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水正己烷，混合均勻后各加入100 mg EDCI（0.514 mmol）、100 mg DMAP（0.835 mmol），25 ℃、充氮、磁力攪拌。反應(yīng)3 h后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入50 mL丙酮，再用100 mL 1 mol/L鹽酸溶液、100 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 mL飽和氯化鈉溶液依次清洗。回收有機(jī)相，減壓旋蒸至無(wú)丙酮后，于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.2.2 反應(yīng)溫度的影響

各取250 mg蝦青素（0.419 mmol）、282 mg DHA（0.858 mmol）、5 mL無(wú)水丙酮分別加入4 個(gè)棕色小瓶中，混合均勻后各加入100 mg EDCI（0.514 mmol）、100 mg DMAP（0.835 mmol），充氮、磁力攪拌，分別于15、25、35、45 ℃條件下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后將混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入50 mL丙酮，再用100 mL鹽酸溶液（1 mol/L）、100 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 mL飽和氯化鈉溶液依次清洗。回收有機(jī)相，減壓旋蒸至無(wú)丙酮后于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.2.3 EDCI用量的影響

各取250 mg蝦青素（0.419 mmol）、282 mg DHA（0.858 mmol）、5 mL無(wú)水丙酮分別加入3個(gè)棕色小瓶中，混合均勻后各加100 mg DMAP（0.835 mmol），再分別加入EDCI 50 mg（0.257 mmol）、100 mg（0.514 mmol）、200 mg（1.028 mmol），25 ℃、充氮、磁力攪拌。反應(yīng)3 h后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入50 mL丙酮，再用100 mL鹽酸溶液（1 mol/L）、100 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 mL飽和氯化鈉溶液依次清洗?；厥沼袡C(jī)相，減壓旋蒸至無(wú)丙酮后，于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.2.4 DMAP用量的影響

各取250 mg蝦青素（0.419 mmol）、282 mg DHA（0.858 mmol）、5 mL無(wú)水丙酮分別加入3個(gè)棕色小瓶中，混合均勻后各加100 mg EDCI（0.514 mmol），再分別加入DMAP 50 mg（0.417 mmol）、100 mg（0.835 mmol）、200 mg（1.67 mmol），25 ℃、充氮、磁力攪拌。反應(yīng)3 h后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入50 mL丙酮，再用100 mL鹽酸溶液（1 mol/L）、100 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 mL飽和氯化鈉溶液依次清洗?；厥沼袡C(jī)相，減壓旋蒸至無(wú)丙酮后于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

各取250 mg蝦青素（0.419 mmol）、282 mg DHA（0.858 mmol）、5 mL無(wú)水二氯甲烷分別加入5個(gè)棕色小瓶中，混合均勻后各加入100 mg EDCI和100 mg DMAP，25 ℃、充氮、磁力攪拌，分別于反應(yīng)1、2、3、4、5 h時(shí)終止反應(yīng)，隨即將混合物轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入50 mL二氯甲烷，再用100 mL鹽酸溶液（1 mol/L）、100 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 mL飽和氯化鈉溶液依次清洗?；厥沼袡C(jī)相，減壓旋蒸至干后于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.3 蝦青素單酯/雙酯的純化

將柱層層析硅膠置于110 ℃烘箱活化2 h，待用。稱(chēng)100 g硅膠與石油醚攪拌后濕法裝柱，用3倍柱體積的石油醚壓實(shí)硅膠柱。分別取2 g反應(yīng)產(chǎn)物，用5 mL石油醚溶解上樣。先用石油醚沖洗出未反應(yīng)的游離脂肪酸，再用石油醚/丙酮（96∶4，V/V）溶液沖洗出DHA蝦青素雙酯，最后用石油醚/丙酮（92∶8，V/V）溶液沖洗出DHA蝦青素單酯。洗脫后分別收集單酯部分和雙酯部分，減壓旋蒸至干，DHA蝦青素單/雙酯樣品置于－20 ℃避光保存，待用。

1.3.4 蝦青素單酯/雙酯的純度測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮配成1 mg/mL的儲(chǔ)備液（超聲波促溶，冰浴避光條件下操作），存放于棕色瓶中，－20 ℃條件下保存，使用前用丙酮稀釋成0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL質(zhì)量濃度的工作液用于色譜分析。樣品中蝦青素單/雙酯的純度按如下公式計(jì)算得到：

式中：M為蝦青素單酯或蝦青素雙酯的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；n為總蝦青素類(lèi)化合物的物質(zhì)的量/mol，以蝦青素為標(biāo)樣，經(jīng)峰面積計(jì)算得到；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測(cè)

正己烷-丙酮（4∶1，V/V）配制展開(kāi)劑，取15 mL加入層析缸中，密封平衡60 min；用3 mm的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣線距硅膠板下邊緣1.5 cm，重復(fù)多次，點(diǎn)樣過(guò)程用氮?dú)饧皶r(shí)吹干溶劑，以減小“點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)”和蝦青素化合物的降解，待溶劑前沿距硅膠板上邊緣1 cm時(shí)，取出硅膠板，室溫條件下自然顯色。

1.3.6 紫外檢測(cè)

取適量蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品及純化后的DHA蝦青素雙酯，用丙酮配制成適宜濃度，UV-2550紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全光譜掃描。

1.3.7 HPLC-MS/MS檢測(cè)

H P L C條件：Y M C-C a r o t e n o i d-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，B：甲基叔丁基醚；線性梯度洗脫：0～15 min，B維持在10%；15～21 min，B由10%升至30%；21～38 min，B維持在30%；38～46 min，B由30%升至48%；46～51 min，B維持在48%；51～54 min，B由48%升至100%；54～57 min，B由100%下降至10%；57～60 min，B維持在10%。流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)476 nm；進(jìn)樣量5 μL。

MS條件：APCI源，正離子模式，一級(jí)MS的質(zhì)量掃描范圍為m/z 300～1 400。霧化氣壓力60 psi；干燥氣（N2）流速5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，離子源溫度450 ℃。毛細(xì)管壓力3.7 kV，電暈電流4 μA。二級(jí)MS采用母離子掃描和子離子掃描模式，碎裂電壓為60 V，碰撞能量為25 eV，質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 500。

數(shù)據(jù)處理：通過(guò)參考文獻(xiàn)中的裂解規(guī)律，確定DHA蝦青素酯的特征離子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其定性分析；同時(shí)對(duì)目標(biāo)組分用峰面積歸一法進(jìn)行積分計(jì)算，從而得出反應(yīng)生成的DHA蝦青素酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLC分析和光譜掃描結(jié)果

圖1A中合成產(chǎn)物條帶的比移值與雨生紅球藻蝦青素藻油中游離蝦青素及蝦青素單雙酯的位置一致，初步認(rèn)定成功合成了蝦青素酯，圖1B結(jié)果表明，游離蝦青素和DHA蝦青素雙酯在丙酮中的最大吸收波長(zhǎng)分別為475 nm和476 nm，由于游離態(tài)蝦青素和蝦青素酯的最大吸收波長(zhǎng)非常相似，可以利用游離蝦青素作為標(biāo)樣，準(zhǔn)確定量DHA蝦青素酯的含量。

圖1 產(chǎn)物TLC（A）和全光譜掃描（B）圖Fig. 1 Thin layer chromatograms and absorption spectra of the products

DHA和蝦青素的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱正己烷/丙酮體系分離純化的結(jié)果如圖1A中條帶4、5所示，分別為DHA蝦青素雙酯、DHA蝦青素單酯。DHA蝦青素單酯純度為（94.0±0.6）%，DHA蝦青素雙酯純度為（98.2±0.5）%。

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)體系的影響

圖2 反應(yīng)體系（a）、反應(yīng)溫度（b）、EDCI用量（c）、DMAP用量（d）對(duì)合成DHA蝦青素酯的影響Fig. 2 Effects of reaction temperature, time, EDCI dosage and DMAP dosage on the synthesis of DHA astaxanthin esters

如圖2a所示，以乙醇為反應(yīng)體系時(shí)，DHA蝦青素總酯峰面積只有44.69%，明顯低于丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷體系中DHA蝦青素總酯的產(chǎn)量，這主要是由于蝦青素、DHA蝦青素酯在乙醇中的溶解性遠(yuǎn)不如其他幾種體系。以丙酮為反應(yīng)體系時(shí)，DHA蝦青素總酯峰面積最高，可達(dá)到95.67%，所以丙酮為最適反應(yīng)體系。在這幾種體系中DHA蝦青素雙酯的含量都大于單酯，該方法更適合于生產(chǎn)DHA蝦青素雙酯。

2.2.2 反應(yīng)溫度的影響

如圖2b所示，不同反應(yīng)溫度條件下，產(chǎn)物中DHA蝦青素單酯峰面積都在20%左右，而DHA蝦青素雙酯都在74%左右。因此反應(yīng)溫度對(duì)DHA蝦青素酯產(chǎn)量無(wú)明顯影響，DHA蝦青素酯主要以雙酯存在，反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)生的單、雙酯比例無(wú)明顯影響，反應(yīng)溫度為25 ℃時(shí)DHA蝦青素總酯產(chǎn)量略高一些，而且溫度越高蝦青素在有機(jī)溶劑中的異構(gòu)化程度越高[23]，故將25 ℃定為最適反應(yīng)溫度。

2.2.3 EDCI用量的影響

如圖2c所示，控制DMAP用量都為100 mg，當(dāng)DMAP、EDCI各加入100 mg時(shí)，DHA蝦青素總酯含量高達(dá)95.67%。EDCI用量繼續(xù)提高到200 mg時(shí)，DHA蝦青素總酯含量略有下降，DHA蝦青素單酯含量略有上升，雙酯含量下降明顯，只有25.74%。結(jié)果表明：EDCI用量對(duì)合成DHA蝦青素酯的反應(yīng)有顯著影響，DHA蝦青素總酯生成量隨EDCI用量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。所以，EDCI用量為100 mg最為合適。

2.2.4 DMAP用量的影響

DMAP是一種超強(qiáng)親核的酰化作用催化劑，它的極性和水溶解能力使得它在引發(fā)反應(yīng)和凈化產(chǎn)品方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，在該反應(yīng)中被假定為?；^(guò)程的催化劑。在DMAP存在的情況下加入EDCI作為偶聯(lián)劑，尤其適用于催化ω-3多不飽和脂肪酸的?；磻?yīng)。DMAP用量對(duì)合成DHA蝦青素酯反應(yīng)的影響如圖2d所示，控制EDCI用量都為100 mg，當(dāng)DMAP、EDCI各加入100 mg時(shí)，DHA蝦青素酯含量高達(dá)95.67%。DMAP用量繼續(xù)提高到200 mg時(shí)，DHA蝦青素總酯含量略有上升，DHA蝦青素雙酯含量明顯上升，雙酯含量達(dá)到92.81%。結(jié)果表明，DMAP用量對(duì)合成DHA蝦青素酯的反應(yīng)有顯著影響，DHA蝦青素總酯生成量隨DMAP用量的增加而增加，并且總酯中雙酯比例隨之增加。為了盡量控制催化劑的用量，所以選定DMAP用量為100 mg最為合適。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成DHA蝦青素酯的影響Fig. 3 Effect of reaction time on the synthesis of DHA astaxanthin esters

如圖3所示，反應(yīng)3 h DHA蝦青素總酯峰面積達(dá)到最高值95.67%。繼續(xù)反應(yīng)，單、雙酯轉(zhuǎn)化率均趨于穩(wěn)定。DHA蝦青素單酯的含量比例先增加后降低，最后趨于穩(wěn)定，DHA蝦青素雙酯不斷增加，這符合蝦青素兩端的羥基隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸與DHA發(fā)生酯化的趨勢(shì)。故最適反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.3 HPLC-MS/MS分析產(chǎn)物成分

圖4 反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分離圖譜Fig. 4 HPLC-DAD chromatograms of the products

圖4 為本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分離圖譜，可以看出，色譜吸收峰主要分為3部分，結(jié)合MS分析可知，游離蝦青素的保留時(shí)間為8～10 min，DHA蝦青素單酯的保留時(shí)間為28～33 min，DHA蝦青素雙酯的保留時(shí)間在46～52 min。通過(guò)DAD全光譜掃描顯示，色譜峰均在波長(zhǎng)476 nm左右有最大吸光度。

通過(guò)HPLC-MS/MS對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析，結(jié)合前人研究成果及MS裂解規(guī)律[24]，得到本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)產(chǎn)物鑒定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，峰1為游離蝦青素，峰2、3為DHA蝦青素單酯，峰4、5、6為DHA蝦青素雙酯。由于全反式蝦青素在高溫、光照、有機(jī)溶劑環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生順式異構(gòu)體，異構(gòu)體中主要是9-順式蝦青素和13-順式蝦青素[25-26]，且峰2含量明顯高于峰3，所以峰2應(yīng)該是全反式蝦青素DHA單酯，峰3可能為9-順式蝦青素蝦青素DHA單酯或13-順式蝦青素DHA單酯，同理，由于峰4在峰4、5、6中含量最高，峰4應(yīng)該是全反式蝦青素DHA雙酯，而峰5和峰6分別對(duì)應(yīng)著9-順式蝦青素DHA雙酯和13-順式蝦青素DHA雙酯中的一種。

表1 反應(yīng)產(chǎn)物中各組分MS分析結(jié)果Table1 Mass spectral data of the products

圖5 DHA蝦青素單酯的二級(jí)MS圖（a）及裂解規(guī)律（b）Fig. 5 MS-MS spectra of the DHA astaxanthin monoester, along with its principal fragmentation pattern

由圖5可知，m/z 907.7為DHA蝦青素單酯質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰；m/z 579.4為[M＋H－C22:6]＋，是DHA蝦青素單酯的分子離子峰失去一個(gè)C22:6脂肪酸鏈所產(chǎn)生的碎片離子峰；m/z 561.5為[M＋H－C22:6－H2O]＋，是DHA蝦青素單酯的分子離子峰失去一個(gè)C22:6脂肪酸鏈又失去一分子水所產(chǎn)生的碎片離子峰；m/z 147.0、m/z 172.7、m/z 201.3都是蝦青素兩端六元環(huán)區(qū)裂解、重排后形成的特征碎片離子[27]。

圖6 DHA蝦青素雙酯的二級(jí)MS圖（a）及裂解規(guī)律（b）Fig. 6 MS-MS spectra of the DHA astaxanthin diester, along with its principal fragmentation pattern

由圖6可知，m/z 1 217.9為DHA蝦青素雙酯質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰；m/z 889.6為[M＋H－C22:6]＋，是DHA蝦青素雙酯的分子離子峰失去一個(gè)C22:6脂肪酸鏈所產(chǎn)生的碎片離子峰，m/z 561.5是DHA蝦青素雙酯分子同時(shí)失去兩個(gè)C22:6脂肪酸鏈所產(chǎn)生的碎片離子峰，m/z 147.0、m/z 172.7、m/z 201.3都是蝦青素兩端六元環(huán)區(qū)裂解、重排后形成的特征碎片離子。通過(guò)MS分析可知，蝦青素酯的裂解規(guī)律是以失去脂肪酸為主要特征。

3 結(jié) 論

以DHA與蝦青素作為反應(yīng)底物合成DHA蝦青素酯，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件為：蝦青素250 mg、DHA 282 mg、無(wú)水丙酮5 mL、DMAP 100 mg、EDCI 100 mg，充氮、避光、磁力攪拌，25 ℃反應(yīng)3 h。合成產(chǎn)物經(jīng)過(guò)硅膠柱純化后，用C30色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，甲醇和甲基叔丁基醚為流動(dòng)相，采用HPLCMS/MS法對(duì)純化后樣品進(jìn)行分析，根據(jù)二級(jí)MS結(jié)果分析鑒定出產(chǎn)物主要成分為游離蝦青素、DHA蝦青素單酯、DHA蝦青素雙酯。以蝦青素為標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用峰面積歸一法進(jìn)行積分計(jì)算出各組分含量，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件下，產(chǎn)物中DHA蝦青素總酯峰面積可達(dá)95.67%；其中主要為DHA蝦青素雙酯（77.46%），部分DHA蝦青素單酯（18.21%）和少量游離蝦青素（3.24%）。純化后DHA蝦青素單酯純度為（94.0±0.6）%，DHA蝦青素雙酯純度為（98.2±0.5）%。DHA蝦青素酯的合成方法是合成不同分子結(jié)構(gòu)蝦青素酯的可靠依據(jù)，為后續(xù)研究不同分子結(jié)構(gòu)蝦青素酯的穩(wěn)定性、生物利用度、生物活性等奠定基礎(chǔ)，并為相關(guān)功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供原料。

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Docosahexaenoic Acid Astaxanthin Ester

YANG Lu, LI Xuemin, ZHOU Qingxin, LI Zhaojie, XU Jie, XUE Changhu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In this study, docosahexaenoic acid (DHA) and astaxanthin were applied as reaction substrates to synthesize DHA astaxanthin ester The optimal reaction conditions were determined as follows: 250 mg of astaxanthin 282 mg of DHA, 5 mL of anhydrous acetone, 100 mg of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and, 100 mg of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI), were reacted in a nitrogen atmosphere under dark conditions with magnetic stirring at 25 ℃ for 3 h. As identified by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the synthesized products were composed of free astaxanthin, DHA astaxanthin monoester and DHA astaxanthin diester. Each of these components was analyzed by HPLC-DAD and quantif ed by peak area normalization method. The results showed that under optimum conditions, DHA astaxanthin esters accounted for 95.67% of the total products, mainly DHA astaxanthin diester (77.46%), DHA astaxanthin monoester (18.21%) and small amounts of free astaxanthin (3.24%). DHA astaxanthin diesters and DHA astaxanthin monoesters were separated by silica gel column chromatography with increasing solvent polarity from 100:0 to 92:8 (petroleum ether:acetone, V/V). Finally, the purity of the purif ed DHA astaxanthin diesters and DHA astaxanthin monoesters were (98.2 ± 0.5)% and (94.0 ± 0.6)%, respectively.

astaxanthin; DHA astaxanthin ester; synthesis; isolation and identif cation; mass spectroscopy

10.7506/spkx1002-6630-201702035

TS254.1

A

1002-6630（2017）02-0220-07

楊魯, 李學(xué)敏, 周慶新, 等. 二十二碳六烯酸蝦青素酯的合成及質(zhì)譜分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 220-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702035. http://www.spkx.net.cn

YANG Lu, LI Xuemin, ZHOU Qingxin, et al. Synthesis and mass spectrometry analysis of docosahexaenoic acid astaxanthin ester[J]. Food Science, 2017, 38(2): 220-226. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702035. http://www.spkx.net.cn

2016-06-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571864）；“泰山學(xué)者攀登計(jì)劃”建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)

楊魯（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：yanglusp@163.com

*通信作者：薛長(zhǎng)湖（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)化學(xué)、水產(chǎn)品加工技術(shù)、海洋食品功效成分研究與海洋活性物質(zhì)。E-mail：xuech@ouc.edu.cn