定點(diǎn)突變提高極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性

曾 靜，郭建軍，袁 林*

定點(diǎn)突變提高極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性

曾 靜，郭建軍，袁 林*

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096）

極端嗜熱α-淀粉酶具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，因此在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力，并且其高溫適應(yīng)性機(jī)制研究可以為構(gòu)建耐高溫α-淀粉酶提供理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。通過(guò)分析來(lái)源于極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶ApkA的氨基酸序列，構(gòu)建缺失信號(hào)肽突變體ApkAds和單點(diǎn)突變體ApkAdsA180K。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，與ApkAds相比，突變體ApkAdsA180K的高溫活性和熱穩(wěn)定性明顯提高。其中ApkAds的最適反應(yīng)溫度為90 ℃，對(duì)應(yīng)的酶比活力為2 946.75 U/mg；突變體ApkAdsA180K的最適反應(yīng)溫度為100 ℃，對(duì)應(yīng)的酶比活力為4 501.08 U/mg。ApkAds于90 ℃的半衰期約為5 h，突變體ApkAdsA180K于90 ℃的半衰期約為7 h。通過(guò)同源模建得到的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，突變體ApkAdsA180K中氨基酸殘基K180與D212間形成離子鍵。本研究結(jié)果表明ApkAdsA180K中K180與D212間離子鍵有利于其維持其高溫活性和熱穩(wěn)定性。

極端嗜熱α-淀粉酶；離子鍵；定點(diǎn)突變；高溫活性；熱穩(wěn)定性

淀粉是α-D-葡萄糖苷通過(guò)α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵連接而成的高分子量聚合物，是除纖維素之外的數(shù)量分布最廣的多糖之一[1-2]。淀粉作為一種基本原材料，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥、造紙、紡織、飼料等領(lǐng)域，并且淀粉是發(fā)酵、制糖等工業(yè)中最重要的原料之一[3-4]。α-淀粉酶是一類作用于淀粉分子，從其分子內(nèi)部隨機(jī)切斷α-1,4糖苷鍵，生成葡萄糖、還原糖、極限糊精和含4 個(gè)以上葡萄糖殘基的低聚糖的水解酶[5-7]。α-淀粉酶常被應(yīng)用于淀粉液化工藝，將淀粉水解成低分子質(zhì)量的糊精，以制造各種糖漿，是最重要的工業(yè)酶制劑之一，占全球工業(yè)用酶份額的30%[8]。因此，α-淀粉酶的研究和開發(fā)具有重要意義。

目前淀粉液化工藝存在較多不足[9-10]，例如110 ℃液化條件下，玉米、小麥等蛋白質(zhì)含量較高的粗原料的液化效果不夠理想；目前工業(yè)上廣泛使用的α-淀粉酶BLA的耐熱性與淀粉液化工藝的要求存在一定的差距。針對(duì)這些不足，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋求更適用于淀粉液化工藝的耐高溫α-淀粉酶。已報(bào)道的文獻(xiàn)表明極端嗜熱微生物來(lái)源的極端嗜熱α-淀粉酶具有較好的高溫活性和熱穩(wěn)定性[11-13]，因此在淀粉液化工藝中具有巨大的應(yīng)用潛力，有關(guān)該類α-淀粉酶的熱穩(wěn)定機(jī)制研究可以為現(xiàn)有α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性改造提供理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。

由極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1所產(chǎn)生的胞外α-淀粉酶ApkA具有較好的高溫活性和熱穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)溫度為90 ℃，100 ℃條件下可保持80%的酶活性，110 ℃仍有20%的酶活性[14]。ApkA的最適反應(yīng)pH值為5～6.5，于pH 4.5保持40%的酶活性[14]。該酶在未補(bǔ)加Ca2＋的條件下于90 ℃保溫1 h后保持90%的剩余活性，在2 mmol/L Ca2＋的條件下于100 ℃保溫1 h后仍有40%的剩余活性[14]。ApkA具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，并且耐酸性強(qiáng)，綜合性質(zhì)優(yōu)于其他α-淀粉酶，在淀粉液化工藝中具有較大的應(yīng)用潛力。為了滿足淀粉液化工藝的要求，需要進(jìn)一步提高ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性。本研究擬通過(guò)對(duì)ApkA以及其他已知的極端嗜熱α-淀粉酶進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析，選定待突變的氨基酸位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并驗(yàn)證突變體的高溫活性和熱穩(wěn)定性，從而為ApkA的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、大腸桿菌克隆載體pUC57、大腸桿菌表達(dá)載體pET28a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基采用含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker美國(guó)Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A. 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler gradient PCR儀 美國(guó)Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

分子克隆技術(shù)和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[15-16]進(jìn)行。

1.3.2 重組質(zhì)粒pET28a-ApkAds的構(gòu)建及鑒定

α-淀粉酶ApkA基因ApkA由上海博益生物科技有限公司合成，將基因ApkA連接至載體pUC57構(gòu)建質(zhì)粒pUC57-ApkA。設(shè)計(jì)引物ApkAds-F、ApkAds-R擴(kuò)增基因ApkA不含信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基因ApkAds。以質(zhì)粒pUC57-ApkA為模板，以ApkAds-F、ApkAds-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，74 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；74 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連接至載體pET28a，構(gòu)建亞克隆pET28a-ApkAds。采用NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table1 Primer sequences used for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 重組質(zhì)粒pET28a-ApkAdsA180K的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)QuikChange?點(diǎn)突變?cè)噭┖械脑?，結(jié)合α-淀粉酶ApkA基因ApkA和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物A180K-F、A180K-R。以pET28a-ApkAds為模板，采用引物A180K-F和A180K-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到包含載體序列和基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸4 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ酶處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測(cè)序鑒定是否為突變基因ApkAdsA180K。

1.3.4 重組α-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將pET28a-ApkAds和pET28a-ApkAdsA180K質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL。從新鮮的轉(zhuǎn)化平板上挑取重組大腸桿菌單菌落，分別接種于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物以1%接種量轉(zhuǎn)接至含有卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液A600nm達(dá)到0.5左右。加入IPTG至其終濃度為0.25 mmol/L，繼續(xù)于16 ℃培養(yǎng)20 h， 12 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀。

采用5 0 m m o l/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES），pH 6.5緩沖液重懸并洗滌菌體沉淀，再加入適量50 mmol/L MES，pH 6.5緩沖液重懸菌體沉淀，置于冰上用超聲波破碎細(xì)胞。超聲波細(xì)胞破碎儀的參數(shù)設(shè)置如下：超聲波功率25%、超聲波破碎時(shí)間3 s、間歇6 s。超聲波處理菌體細(xì)胞至菌體懸液變?yōu)榫坏娜芤?，采用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

采用Ni2＋親和層析柱對(duì)細(xì)胞可溶成分中目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsA180K。利用SDS-PAGE檢測(cè)重組α-淀粉酶的純度，并采用Bradford法測(cè)定重組α-淀粉酶的質(zhì)量濃度。

1.3.5 α-淀粉酶活力測(cè)定

將10 μL酶液與490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉的50 mmol/L MES，pH 6.5緩沖液混合，于90 ℃反應(yīng)30 min后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，然后采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[17]測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖量。酶活力單位定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

將酶液與不同pH值的1%可溶性淀粉溶液混合，于90 ℃條件下進(jìn)行酶比活力測(cè)定。采用不同緩沖液配制不同pH值的1%可溶性淀粉溶液：50 mmol/L MES（pH 4.0～7.0）、50 mmol/L 3-（N-瑪琳代）丙磺酸緩沖液（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）（pH 7.0～9.0）。

按照上述反應(yīng)體系混合酶液和底物，分別于40～110 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定不同溫度條件下酶比活力，并以酶比活力對(duì)時(shí)間作圖，確定其最適反應(yīng)溫度。其中，40～95 ℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于水浴中進(jìn)行，100～110 ℃范圍內(nèi)的反應(yīng)于甘油浴中進(jìn)行。高溫條件下測(cè)定α-淀粉酶比活力時(shí)，反應(yīng)樣品置于O型環(huán)螺旋蓋密封管內(nèi)，以防止水分蒸發(fā)。

用50 mmol/L MES（pH 6.5）緩沖液配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性淀粉溶液（0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%），分別向可溶性淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計(jì)算以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和反應(yīng)常數(shù)kcat。

將酶液分別于90、100 ℃保溫，分時(shí)間梯度取出部分樣品，根據(jù)如上反應(yīng)體系測(cè)定酶比活力。將未處理酶液的酶比活力定義為100%，并以相對(duì)酶活（%）對(duì)時(shí)間作圖，評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.7 氨基酸序列分析和同源模建

通過(guò)BLASTP搜索比對(duì)，找出與ApkA在氨基酸序列上高度相似的蛋白質(zhì)。采用ClustalW2程序?qū)@些蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。采用 Swiss-Model（http:// swissmodel.expasy.org）對(duì)α-淀粉酶ApkAds和突變體ApkAdsA180K進(jìn)行三維模建，采用三維圖像軟件PyMOL v0.99顯示蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行氨基酸殘基之間相互作用分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 11.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

采用BLASTP分析ApkA的氨基酸序列，結(jié)果表明ApkA與來(lái)源于不同極端嗜熱古生菌的α-淀粉酶PFA、TH_amy1、TO_amy1分別具有89%、86%、86%的氨基酸序列相似性。其中PFA具有最強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)溫度高達(dá)100 ℃，于98 ℃的半衰期長(zhǎng)達(dá)13 h[18]。PFA中位于酶分子的保守區(qū)域Ⅰ和保守區(qū)域Ⅱ之間的Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于PFA維持高溫活性和熱穩(wěn)定性非常重要[19-20]。該Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)在ApkA中是保守的，并且Tachibana等[14]發(fā)現(xiàn)額外補(bǔ)加的Ca2＋有利于提高ApkA的熱穩(wěn)定性，因此ApkA含有可能的Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)。PFA的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示位于該Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸殘基K180與D212間離子鍵有利于維持其結(jié)構(gòu)的緊密性和穩(wěn)定性[19]。本研究設(shè)計(jì)ApkA中氨基酸殘基A180為突變位點(diǎn)，構(gòu)建點(diǎn)突變體ApkAdsA180K，探討A180K點(diǎn)突變對(duì)ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性的影響。

圖1 ApkA與其他α-淀粉酶的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Amino acid sequence comparison between ApkA and other three α-amylases

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

采用化學(xué)合成法合成極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的基因ApkA，將基因ApkA連接至載體pUC57構(gòu)建質(zhì)粒pUC57-ApkA。以質(zhì)粒pUC57-ApkA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)片段ApkAds，連接至載體pET28a，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ApkAds。在質(zhì)粒pET28a-ApkAds的基礎(chǔ)上，采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ApkAdsA180K。采用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和EcoRⅠ酶切質(zhì)粒pET28a-ApkAds和pET28a-ApkAdsA180K，得到大小分別約為5.4 kb和1.3 kb的兩個(gè)片段（圖2）。分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，獲得重組大腸桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞后，對(duì)重組α-淀粉酶進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。如圖3所示，目的蛋白質(zhì)ApkAds和ApkAdsA180K的分子質(zhì)量均約為45 kD，大小與理論值一致。采用Ni2＋親和層析柱純化位于重組大腸桿菌的細(xì)胞可溶成分中的目的蛋白質(zhì)，得到純化后的重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsA180K。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme digestion pattern of recombinant plasmid vectors

圖3 重組α-淀粉酶的SDS-PAGE檢測(cè)圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylases

2.4 ApkAds和ApkAdsA180K的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.4.1 pH值對(duì)重組α-淀粉酶相對(duì)酶活的影響

圖4 pH值對(duì)相對(duì)酶活的影響Fig. 4 pH dependence of α-amylase activity

以1%可溶性淀粉為底物，于不同pH值條件下測(cè)定重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsA180K的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖4所示。ApkAds與突變體ApkAdsA180K的最適反應(yīng)pH值均約為6.5，于pH 4.5～8之間可保持40%以上的相對(duì)酶活，即ApkA中A180K點(diǎn)突變未導(dǎo)致其反應(yīng)pH值發(fā)生明顯改變。

2.4.2 溫度對(duì)重組α-淀粉酶比活力的影響

以1%可溶性淀粉為底物，于不同溫度條件下測(cè)定重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsA180K的酶比活力，結(jié)果如圖5所示。ApkAds的最適反應(yīng)溫度為90 ℃，在此溫度條件下的酶比活力為2 946.75 U/mg，并且在60～100 ℃間ApkAds可保持60%以上的相對(duì)酶活；突變體ApkAdsA180K的最適反應(yīng)溫度為100 ℃，在此溫度條件下的酶比活力為4 501.08 U/mg，并且在40～110 ℃間其酶比活力均明顯高于野生型ApkAds。即與ApkAds相比，突變體ApkAdsA180K的最適反應(yīng)溫度和酶比活力均明顯提高。

2.4.3 重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2 90 ℃重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table2 Kinetic parameters of recombinant α-amylases at 900 ℃

以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的可溶性淀粉溶液為底物，于90 ℃測(cè)定重組α-淀粉酶的酶比活力。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶比活力的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax。根據(jù)得到的斜率和截距以及重組α-淀粉酶的酶質(zhì)量濃度，即可計(jì)算出以可溶性淀粉為底物時(shí)的米氏常數(shù)Km和反應(yīng)常數(shù)kcat。如表2所示，與野生型ApkAds相比，90 ℃突變體ApkAdsA180K的Km未明顯改變，其kcat值提高約1.52 倍。即突變體ApkAdsA180K的底物結(jié)合能力未明顯改變，以可溶性淀粉為底物時(shí)的反應(yīng)速率明顯提高。

2.4.4 重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性

將重組α-淀粉酶于90 ℃或100 ℃分別保溫不同的時(shí)間，測(cè)定其相對(duì)酶活，比較重組α-淀粉酶ApkAds和ApkAdsA180K的熱穩(wěn)定性。如圖6所示，在90 ℃和100 ℃的條件下，突變體ApkAdsA180K的熱穩(wěn)定性均高于野生型ApkAds的熱穩(wěn)定性。其中ApkAds于90 ℃的半衰期約為5 h，ApkAdsA180K于90 ℃的半衰期約為7 h。于90 ℃保溫7 h后，ApkAdsA180K的相對(duì)酶活約為51.50%，ApkAds的相對(duì)酶活僅為26.71%；此外，于100 ℃保溫10 min后，ApkAds保持約29.04%的相對(duì)酶活，ApkAdsA180K的相對(duì)酶活為66.99%。

圖6 90 ℃（A）和100 ℃（B）重組α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of α-amylases at 90 and 100 ℃

2.4.5 α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)的同源模建

圖7 重組α-淀粉酶ApkAds（a）和ApkAdsA1800KK（bb）三維結(jié)構(gòu)模建后突變位點(diǎn)的比較Fig. 7 Comparison of 3D structures of ApkAds and ApkAdsA180K

經(jīng)BLASTP分析ApkA的氨基酸序列得知，ApkA與PFA具有89%的氨基酸序列相似性。以PFA的三級(jí)結(jié)構(gòu)（1MWO）為模板，采用 Swiss-Model對(duì)α-淀粉酶ApkAds和突變體ApkAdsA180K進(jìn)行三維模建，得到這兩種α-淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7所示。ApkAds和突變體ApkAdsA180K的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本相同，在突變體ApkAdsA180K中，第180位氨基酸殘基由Ala突變?yōu)長(zhǎng)ys。采用PyMOL v0.99分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基A180（或K180）與D212之間相互作用，結(jié)果顯示突變體ApkAdsA180K中K180與D212間存在離子鍵。

3 討 論

目前淀粉液化工藝的幾個(gè)主要缺點(diǎn)是105 ℃條件下淀粉酶活的喪失、pH值的反復(fù)調(diào)節(jié)、Ca2＋的添加，以及隨之而產(chǎn)生的溫度和pH值的調(diào)節(jié)、Ca2＋的添加和排除等復(fù)雜的后續(xù)處理工藝[8-9]。針對(duì)目前淀粉液化工藝中所存在的問(wèn)題，特別是常用α-淀粉酶所存在的不足，國(guó)內(nèi)外對(duì)α-淀粉酶的研究和開發(fā)的主要目標(biāo)是獲得耐高溫、低pH值并且不依賴于Ca2＋的高溫酸性α-淀粉酶。國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要是通過(guò)以下兩種途徑以求獲得更適用于淀粉液化工藝的α-淀粉酶[11-12]：1）對(duì)現(xiàn)有的α-淀粉酶進(jìn)行有關(guān)提高酶分子熱穩(wěn)定性的分子改造；2）尋找新的熱穩(wěn)定性較好的α-淀粉酶。針對(duì)極端嗜熱α-淀粉酶的開發(fā)及應(yīng)用研究，不僅可以為淀粉工業(yè)提供具有優(yōu)良性質(zhì)的α-淀粉酶，而且有關(guān)其高溫適應(yīng)機(jī)制的研究也將為構(gòu)建具有優(yōu)良高溫活性和熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶提供新的理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。

極端嗜熱α-淀粉酶的高溫適應(yīng)性機(jī)制符合極端嗜熱蛋白質(zhì)高溫適應(yīng)性機(jī)制的一般規(guī)律，包括增強(qiáng)非共價(jià)作用力、提高二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、減少溶劑可及的疏水表面、提高酶分子結(jié)構(gòu)的緊湊性、結(jié)合金屬離子等因素[21]。Linden等[22]通過(guò)對(duì)比極端嗜熱α-淀粉酶PFA與其他低溫、中溫微生物來(lái)源的α-淀粉酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PFA分子結(jié)構(gòu)的緊湊性、離子鍵、Ca2＋-Zn2＋雙金屬離子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于其維持熱穩(wěn)定性非常重要。其中位于PFA中Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)附近的K180-D212離子鍵有利于維持其結(jié)構(gòu)緊密性和穩(wěn)定性。大多數(shù)α-淀粉酶屬于糖苷水解酶類的第13家族[3]，具有第13家族酶分子結(jié)構(gòu)上的共同特征，這有利于參照其他α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)特征對(duì)某些α-淀粉酶進(jìn)行分子改造。例如，Ghollasi等[23]通過(guò)分析來(lái)源于Bacillus megaterium WHO的α-淀粉酶氨基酸序列，對(duì)其Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行改造，獲得了最適反應(yīng)溫度提高5 ℃的突變體H77E。姚婷等[24]通過(guò)對(duì)比來(lái)源于極端嗜熱古生菌Thermococcus siculi HJ21的α-淀粉酶TSAM及與其同源性較高的α-淀粉酶的氨基酸序列，對(duì)TSAM進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了催化活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的突變體TSAM-23?？聺萚25]向高溫酸性α-淀粉酶BD5088中引入一對(duì)二硫鍵，獲得了100 ℃酶活力和酶活力半衰期均提高約1倍的突變體BD5088C2。

本研究通過(guò)對(duì)比ApkA和與其同源性較高的極端嗜熱α-淀粉酶的氨基酸序列，選取第180位丙氨酸為突變位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了突變體ApkAdsA180K。通過(guò)比較突變體與野生型的高溫活性和熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)影響到ApkAds的高溫活性和熱穩(wěn)定性。突變體ApkAdsA180K的高溫活性和穩(wěn)定性均得到提高，其最適反應(yīng)溫度由90 ℃提高至100 ℃，90 ℃的酶比活力提高約1.41 倍，100 ℃的酶比活力提高約2.10倍，于90 ℃的半衰期由5 h延長(zhǎng)至7 h。此外，重組α-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析顯示，突變體ApkAdsA180K結(jié)合可溶性淀粉的能力未發(fā)生明顯變化，其降解可溶性淀粉的反應(yīng)速率明顯提高。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，ApkAdsA180K中K180與D212之間形成了離子鍵。離子鍵K180-D212可能影響了該區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征，從而使得突變體ApkAdsA180K的反應(yīng)速率和熱穩(wěn)定性都有所提高。本研究構(gòu)建得到的突變體ApkAdsA180K的高溫活性和穩(wěn)定性達(dá)到了淀粉液化工藝對(duì)α-淀粉酶耐熱性的要求，有利于α-淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用。接下來(lái)的研究可在該突變體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇突變位點(diǎn)，來(lái)提高其低pH值的酶活等酶學(xué)性質(zhì)，從而逐步達(dá)到淀粉液化工藝的要求。

[1] RANA N, WALIA A, GAUR A. α-Amylases from microbial sources and its potential applications in various industries[J]. National Academy Science Letters, 2013, 36(1): 9-17. DOI:10.1007/s40009-012-0104-0.

[2] SHARMA A, SATYANARAYANA T. Microbial acid-stable α-amylases: characteristics, genetic engineering and applications[J]. Process Biochemistry, 2013, 48(2): 201-211. DOI:10.1016/ j.procbio.2012.12.018.

[3] JANE?EK ?, SVENSSON B, MACGREGOR E A. α-Amylase: an enzyme specificity found in various families of glycoside hydrolases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2014, 71(7): 1149-1170. DOI:10.1007/s00018-013-1388-z.

[4] SOUZA P M. Application of microbial α-amylase in industry: a review[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2010, 41(4): 850-861. DOI:10.1590/S1517-83822010000400004.

[5] KUMARI A, SINGH K, M KAYASTHA A. α-Amylase: general properties, mechanism and biotechnological applications-a review[J]. Current Biotechnology, 2012, 1(1): 98-107. DOI:10.2174/221155 1X11201010098.

[6] ATOMI H, SATO T, KANAI T. Application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22(5): 618-626. DOI:10.1016/j.copbio.2011.06.010.

[7] GUPTA R, GIGRAS P, MOHAPATRA H, et al. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(11): 1599-1616. DOI:10.1016/S0032-9592(03)00053-0.

[8] PRAKASH O, JAISWAL N. α-Amylase: an ideal representative of thermostable enzymes[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 160(8): 2401-2414. DOI:10.1007/s12010-009-8735-4.

[9] KONSOULA Z, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES M. Co-production of α-amylase and β-galactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(1): 150-157. DOI:10.1016/j.biort ech.2005.11.001.

[10] ZHOU W, YOU C, MA H, et al. One-pot biosynthesis of highconcentration α-glucose 1-phosphate from starch by sequential addition of three hyperthermophilic enzymes[J]. Journal of Agri cultural and Food Chemistry, 2016, 64(8): 1777-1783. DOI:10.1021/acs. jafc.5b05648.

[11] DALMASO G Z L, FERREIRA D, VERMELHO A B. Marine extremophiles: a source of hydrolases for biotechnological applications[J]. Marine Drugs, 2015, 13(4): 1925-1965. DOI:10.3390/ md13041925.

[12] UNSWORTH L D, van der OOST J, KOUTSOPOULOS S. Hyperthermophilic enzymes-stability, activity and implementation strategies for high temperature applications[J]. FEBS Journal, 2007, 274(16): 4044-4056. DOI:10.1111/j.1742-4658.2007.05954.x.

[13] 曾靜, 郭建軍, 邱小忠, 等. 極端嗜熱微生物及其高溫適應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015(9): 30-37. DOI:10.13560/j.cnki. biotech.bull.1985.2015.09.005.

[14] TACHIBANA Y, LECLERE M M, FUJIWARA S, et al. Cloning and expression of the α-amylase gene from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp. KOD1, and characterization of the enzyme[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1996, 82(3): 224-232. DOI:10.1016/0922-338X(96)88812-X.

[15] GREEN M R, SAMBROOK J. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012. [16] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685. DOI:10.1038/227680a0.

[17] BERNFELD P. Amylases, α and β[J]. Methods in Enzymology, 1955, 1: 149-158.

[18] J?RGENSEN S, VORGIAS C E, ANTRANIKIAN G. Cloning, sequencing, characterization, and expression of an extracellular α-amylase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus in Escherichia coli and Bacillus subtilis[J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(26): 16335-16342. DOI:10.1074/ jbc.272.26.16335.

[19] LINDEN A, MAYANS O, MEYER-KLAUCKE W, et al. Differential regulation of a hyperthermophilic α-amylase with a novel (Ca, Zn) two-metal center by zinc[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(11): 9875-9884. DOI:10.1074/jbc.M211339200.

[20] SAVCHENKO A, VIEILLE C, KANG S, et al. Pyrococcus furiosus α-amylase is stabilized by calcium and zinc[J]. Biochemistry, 2002, 41(19): 6193-6201. DOI:10.1021/bi012106s.

[21] HITESHI K, GUPTA R. Thermal adaptation of α-amylases: a review[J]. Extremophiles, 2014, 18(6): 937-944. DOI:10.1007/s00792-014-0674-5.

[22] LINDEN A, WILMANNS M. Adaptation of class-13 α-amylases to diverse living conditions[J]. ChemBioChem, 2004, 5(2): 231-239. DOI:10.1002/cbic.200300734.

[23] GHOLLASI M, GHANBARI-SAFARI M, KHAJEH K. Improvement of thermal stability of a mutagenised α-amylase by manipulation of the calcium-binding site[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53(6): 406-413. DOI:10.1016/j.enzmictec.2013.09.001.

[24] 姚婷, 李華鐘, 房耀維, 等. 定點(diǎn)突變提高Thermococcus siculi HJ21高溫酸性α-淀粉酶的催化活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(15): 148-152.

[25] 柯濤, 劉征, 楊建偉, 等. A154C/G155C雙點(diǎn)突變對(duì)嗜熱耐酸淀粉酶酶活性及熱穩(wěn)定性的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3): 207-211.

Improvement of the Thermal Activity and Stability of Hyperthermophilic α-Amylase ApkA by Site-Directed Mutagenesis

ZENG Jing, GUO Jianjun, YUAN Lin*
(Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China)

Hyperthermophilic α-amylases, which are active and stable at high temperatures, are of great interest for researchers studying starch liquefaction. Research into the molecular basis of thermal adaptation of hyperthermophilic α-amylase can provide theoretical guidance to improve the thermal activity and thermal stability of α-amylases. Based on the sequence analysis of hyperthermophilic α-amylase ApkA from Thermococcus kodakarensis KOD1, a signal peptide deleted mutant (ApkAds) and an A180K site mutant (ApkAdsA180K) were constructed. Compared with ApkAds, the mutant ApkAdsA180K exhibited a sharp increase in thermal activity and stability. The optimal temperature of ApkA was 90 ℃ and the corresponding specif c activity was 2 946.75 U/mg, while the optimal temperature of the mutant was 100 ℃ and the corresponding specif c activity was 4 501.08 U/mg. When incubated at 90 ℃, ApkAds and the mutant exhibited half-lives of 5 h and 7 h, respectively. The tertiary structure of ApkAdsA180K obtained by homologous modeling indicated that K180 and D212 are involved in salt bridge formation. These results suggest that the salt bridge between K180 and D212 plays an important role in maintaining the thermal activity and stability of ApkAdsA180K.

hyperthermophilic α-amylase; salt bridge; site-directed mutagenesis; thermal activity; thermal stability

10.7506/spkx1002-6630-201702004

Q814

A

1002-6630（2017）02-0020-07

曾靜, 郭建軍, 袁林. 定點(diǎn)突變提高極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 20-26. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702004. http://www.spkx.net.cn

ZENG Jing, GUO Jianjun, YUAN Lin. Improvement of the thermal activity and stability of hyperthermophilic α-amylase ApkA by site-directed mutagenesis[J]. Food Science, 2017, 38(2): 20-26. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702004. http://www.spkx.net.cn

2016-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31501422）；江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20151BAB214001）；江西省科學(xué)院資助項(xiàng)目（2014-YYB-08；2014-XTPH1-08）

曾靜（1986—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)闃O端嗜熱酶的開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：zengjingwhu@126.com

*通信作者：袁林（1980—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物的應(yīng)用。E-mail：yuanlincn2003@aliyun.com