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    魚腥藻脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性提高的分子動(dòng)力學(xué)模擬

    2017-02-08 07:42:29陸兆新別小妹趙海珍呂鳳霞
    食品科學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:熱穩(wěn)定性突變體活力

    錢 輝,陸兆新,張 充,別小妹,趙海珍,呂鳳霞*

    魚腥藻脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性提高的分子動(dòng)力學(xué)模擬

    錢 輝,陸兆新,張 充,別小妹,趙海珍,呂鳳霞*

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

    為提高魚腥藻脂肪氧合酶(Anabaena sp. PCC 7160 lipoxygenase,Ana-LOX)的熱穩(wěn)定性,探索其熱穩(wěn)定性機(jī)制。通過(guò)同源建模預(yù)測(cè)了Ana-LOX的三維結(jié)構(gòu),并通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)手段分別模擬了Ana-LOX于298 K和320 K條件下在水溶液中的運(yùn)動(dòng)軌跡,計(jì)算均方根偏移與均方根漲落后,以均方根漲落為熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合作用力分析,預(yù)測(cè)不穩(wěn)定區(qū)域。結(jié)果表明:Ana-LOX的T94、I96、A325~Q327區(qū)域柔性較大,是導(dǎo)致Ana-LOX熱不穩(wěn)定的關(guān)鍵區(qū)域。通過(guò)I96V定點(diǎn)突變后,半衰期提高到野生型的2.5 倍,驗(yàn)證了原預(yù)測(cè)結(jié)果的有效性,從而為脂肪氧合酶分子的熱穩(wěn)定性改造提供了理論依據(jù)。

    脂肪氧合酶;同源建模;分子動(dòng)力學(xué)模擬;熱穩(wěn)定性

    脂肪氧合酶(Lipoxygenase,LOX,EC1.13.1.13)屬于氧化還原酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、藻類、真菌以及少數(shù)細(xì)菌中[1]。LOX能夠?qū)R淮呋趸许?順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸,形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過(guò)氧化物[2],這些氫過(guò)氧化物性質(zhì)活潑,在食品加工中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。此外,許多不飽和脂肪酸的氫過(guò)氧化物是食品風(fēng)味物質(zhì)的前體,能夠通過(guò)酶解進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酮、醛和醇類,較化學(xué)合成香料具有更高的商業(yè)價(jià)值[4]。

    目前市場(chǎng)上商品級(jí)LOX產(chǎn)品大多數(shù)以富含LOX的大豆粉作為酶源。大豆中存在多種LOX同工酶,導(dǎo)致LOX的產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[5]。因此,構(gòu)建高產(chǎn)重組菌成為發(fā)酵法生產(chǎn)LOX的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室前期已克隆了魚腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)LOX基因,并在Escherichia coli和Bacillus subtilis中獲得了表達(dá)[6-7];后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其在面粉加工中有著重要的應(yīng)用價(jià)值[8],并進(jìn)一步闡釋了其強(qiáng)筋漂白機(jī)理[9-10]。但魚腥藻脂肪氧合酶(Anabaena sp. PCC 7120 lipoxygenase,Ana-LOX)熱穩(wěn)定性較差,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此,需要對(duì)其熱穩(wěn)定性機(jī)制進(jìn)行解析,從而制定出相應(yīng)的策略來(lái)提高其熱穩(wěn)定性,如loop環(huán)的改造[11]、定點(diǎn)突變[12]、融合自組裝雙親短肽[13]等。

    近年來(lái),大量蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)被解析及同源建模算法的不斷完善,使得利用計(jì)算機(jī)模擬來(lái)完成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的分析工作、更高效地研究熱穩(wěn)定性機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行分子改造成為可能。Ana-LOX的晶體結(jié)構(gòu)尚無(wú)報(bào)道,不宜采用基于晶體結(jié)構(gòu)解析來(lái)分析其熱穩(wěn)定性。因此,應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù),采取同源建模、分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics,MD)模擬等方法,以均方根偏移(root mean square deviation,RMSD)與均方根漲落(root mean square fluctuation,RMSF)值來(lái)評(píng)估酶分子局部空間結(jié)構(gòu)的改變,探索其熱不穩(wěn)定區(qū)域[14]及酶熱穩(wěn)定性機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將MD用于LOX的研究,鎖定Ana-LOX的熱不穩(wěn)定區(qū)域,探索酶熱穩(wěn)定性機(jī)制,為L(zhǎng)OX的熱穩(wěn)定性改造提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    pET32a-Ana-LOX重組質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

    LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、pH 7.0,121 ℃條件下滅菌20 min。

    限制性內(nèi)切酶Dnp Ⅰ、primeSTAR聚合酶 寶生物工程(大連)有限公司;氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG) 生工生物工程(上海)股份有限公司;亞油酸 美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JY91ⅡDN超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 Ana-LOX蛋白三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建

    將Ana-LOX基因序列提交phyre2[15]數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2),與晶體結(jié)構(gòu)獲得解析的同源蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì),將一致性最高的序列作為同源建模的模板,構(gòu)建目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。將構(gòu)建好的模型提交PSVS服務(wù)器(http://psvs-1_5-dev.nesg.org/),用Procheck[16]程序進(jìn)行模型評(píng)估,借助Pymol軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[17]。

    1.3.2 Amber 12軟件分子動(dòng)力學(xué)模擬步驟及參數(shù)設(shè)置

    1.3.2.1 模擬體系構(gòu)建

    利用Amber[18]程序包和ff99SB[19]力場(chǎng),加載小分子gaff力場(chǎng)與金屬離子參數(shù),使用Leap模塊添加氫原子,選用TIP3P八面體水分子盒模型,蛋白質(zhì)分子置于10 ?的水溶劑箱內(nèi),加入Na+平衡電荷。

    1.3.2.2 能量最小化

    用sander模塊進(jìn)行3 000步能量最小化,執(zhí)行最陡下降法500 步后轉(zhuǎn)為共軛梯度法,以消除不合理的能量勢(shì)壘。

    1.3.2.3 加熱

    對(duì)系統(tǒng)加熱使其從0 K升溫至298 K或320 K,并在保持體積不變的狀態(tài)下運(yùn)行50 ps帶有位置限制的動(dòng)力學(xué),將非鍵相互作用閾值設(shè)為8 ?,使用弱耦合的算法來(lái)控制溫度。

    1.3.2.4 平衡

    在常壓條件下系統(tǒng)分別處在298 K和320 K條件下,進(jìn)行500 ps的分子動(dòng)力學(xué)模擬,以平衡系統(tǒng)。

    1.3.2.5 動(dòng)力學(xué)模擬

    恒溫恒壓系統(tǒng)下進(jìn)行MD模擬,所用步長(zhǎng)為2 fs,以每1 000 步采集一次能量與坐標(biāo)信息。分析動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中RMSD值變化,再選擇RMSD值平衡階段的數(shù)據(jù),計(jì)算RMSF值,形成軌跡文件,最后通過(guò)VMD軟件分析動(dòng)力學(xué)模擬軌跡。

    1.3.3 定點(diǎn)突變

    為了檢驗(yàn)MD預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,針對(duì)模擬預(yù)測(cè)位點(diǎn),采取質(zhì)粒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)突變法進(jìn)行定點(diǎn)突變。引物為I96V-f(5’-ACCGAT GTTCCTGACAGCTACTTTTTAG-3’)和I96V-r(5’-TGT CAGGAACATCGGTGGGATCAGTA-3’)。PCR程序?yàn)椋?6 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)25 次;72 ℃延伸5 min。全質(zhì)粒PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化后轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)。

    1.3.4 LOX活力測(cè)定

    采用紫外-分光光度法測(cè)酶活力,反應(yīng)體系3 mL:取pH 9.0的Tris-HCl緩沖液2.79 mL、酶液10 μL、1.733 mmol/L亞油酸鈉底物200 μL混合均勻后放入30℃水浴中并開始計(jì)時(shí),以1 min內(nèi)3 mL反應(yīng)體系在234 nm波長(zhǎng)處的吸光度增加0.001為一個(gè)酶活力單位(U)。

    1.3.5 酶學(xué)性質(zhì)表征

    1.3.5.1 半衰期測(cè)定

    IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,經(jīng)鎳柱親和層析純化后透析去除咪唑。將突變酶與野生型酶液調(diào)整至相同質(zhì)量濃度,在50 ℃條件下保溫,每隔5 min取樣,然后置于冰上冷卻10 min,按照1.3.4節(jié)測(cè)定LOX酶的殘余活力。再以ln(殘余活力)對(duì)時(shí)間作圖,并進(jìn)行線性擬合,所得斜率即為酶在該溫度條件下的一級(jí)失活常數(shù)(kd)。酶在一定溫度條件下的半衰期(t1/2)按以下公式計(jì)算。

    1.3.5.2 酶相對(duì)活力對(duì)溫度的變化曲線

    將緩沖液加熱至15、20、30、35、40、45、50、55、60 ℃,然后在各溫度條件下加入10 μL待測(cè)酶液,測(cè)定酶活力。以最適反應(yīng)溫度條件下的酶活力為100%,以不同溫度條件下酶的相對(duì)活力作圖,從而獲得該酶相對(duì)活力對(duì)溫度的變化曲線。

    1.3.5.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

    在3 mL反應(yīng)體系中以亞油酸為底物,以濃度梯度0.047、0.023、0.019、0.014、0.009 mmol/L添加底物,進(jìn)行酶活力測(cè)定。以摩爾消光系數(shù)ε234nm為2.5×104(mol/L·cm)-1,計(jì)算產(chǎn)物生成量。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)[20]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛋白模型建立與評(píng)估

    圖1 Ana-LOX結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig. 1 Comparison between Ana-LOX and template structure

    采用同源建模技術(shù)預(yù)測(cè)Ana-LOX三維結(jié)構(gòu)。Ana-LOX序列提交phyre2,選擇藍(lán)桿藻(Cyanothece sp.)PCC 8801脂肪氧合酶晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:5EK8)為模板[21],構(gòu)建成如圖1所示的三維空間主體圖。將模板與Ana-LOX在pymol中比對(duì),定位出鐵離子活性中心。在建模過(guò)程中,Ana-LOX與模板序列一致性為20%,低于30%,因此選擇phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)建模,phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)采取隱馬可夫模型比對(duì),并結(jié)合了從頭折疊模擬,使得即使在序列一致性較低(15%~25%)的情況下,依然可以提供精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)信息[15]。

    圖2 Ana-LOX拉氏構(gòu)象圖Fig. 2 Ramachandran plot of Ana-LOX

    表1 Procheck的拉氏構(gòu)象圖概要Table1 Ramachandran plot summary from Procheck

    采用Procheck對(duì)建好的模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估,檢查最終模型的二面角構(gòu)象和立體化學(xué)參數(shù),獲得其拉氏構(gòu)象圖(圖2)。結(jié)果表明,僅有1.9%的氨基酸位于不合理區(qū)域(表1),由此可以判斷模型質(zhì)量較高,該模型可以用于下一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)。

    2.2 RMSD與RMSF值計(jì)算

    RMSD值是蛋白質(zhì)每個(gè)原子運(yùn)動(dòng)偏移的均值,反映蛋白質(zhì)整體的運(yùn)動(dòng)狀況。RMSD值平衡,反映蛋白質(zhì)此時(shí)運(yùn)動(dòng)處于平衡狀態(tài),此時(shí)即可抽取這一時(shí)間段來(lái)計(jì)算RMSF值。298 K條件下MD 1 ns后Ana-LOX就迅速進(jìn)入了平衡狀態(tài)(圖3a),取3~8 ns計(jì)算RMSF值。320 K條件下15 ns的MD過(guò)程中發(fā)現(xiàn)6~9 ns時(shí)RMSD值發(fā)生了躍遷,躍遷后又下降到達(dá)平衡狀態(tài)(圖3b)。RMSD值的躍遷說(shuō)明在6~9 ns時(shí),蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了較大的改變,然后又恢復(fù)平衡狀態(tài),在這一過(guò)程中發(fā)生構(gòu)象較大變化的位置可能是潛在的不穩(wěn)定的臨界位點(diǎn),分別取6~9 ns和10~15 ns計(jì)算RMSF值。

    圖4 Ana-LOX在298 K(3~8 ns )(a)與320 K(b)條件下RMSF值Fig. 4 RMSF values for Ana-LOX at 298 (a) and 320 K (b)

    如圖4所示,RMSF值高的區(qū)域振幅較大,可能是潛在柔性較大的不穩(wěn)定區(qū)域。N端的氨基酸RMSF值最高,但這是因N端位于蛋白質(zhì)末端的一側(cè)處于游離狀態(tài),導(dǎo)致天然振幅較大,不將其視為不穩(wěn)定區(qū)域。320 K條件下6~9 ns RMSD發(fā)生了躍遷,表明在MD過(guò)程中,存在部分位置氨基酸發(fā)生較大的位置偏移,使得RMSD發(fā)生躍遷。比較320 K條件下6~9 ns與平衡后的RMSF,選擇發(fā)生較大偏移的位點(diǎn)。選擇圖4a中出現(xiàn)RMSF峰值的氨基酸殘基位點(diǎn)與圖4b中6~9 ns條件下出現(xiàn)RMSF值躍遷的殘基位點(diǎn)作為候選,逐一分析各氨基酸與周圍氨基酸氫鍵、離子鍵、π鍵堆積等相互作用,確定T94、I96、A325~Q327區(qū)域(箭頭所示)為Ana-LOX不穩(wěn)定區(qū)域(圖5)。

    圖5 Ana-LOX不穩(wěn)定區(qū)域的位置Fig. 5 Location of the unstable regions of Ana-LOX

    2.3 突變體性質(zhì)鑒定

    圖6 Ana-LOX與I96V突變熱失活動(dòng)力學(xué)Fig. 6 Thermal inactivation kinetics of Ana-LOX and I96V mutant

    為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,選擇MD預(yù)測(cè)的I96號(hào)位點(diǎn)突變成纈氨酸。突變體I96V經(jīng)純化,酶熱處理每隔5 min取樣測(cè)酶活力,以ln(殘余活力)(y)對(duì)時(shí)間(x)作圖,并進(jìn)行線性擬合(圖6)。野生型為y=-0.298 7x+4.515,R2=0.995 6;突變體I96V為y=-0.121 7x+4.686 6,R2=0.993。

    經(jīng)計(jì)算,野生型t1/2為2.3 min,突變體t1/2為5.7 min,是野生型的2.5 倍。由此判斷MD模擬對(duì)酶熱敏感區(qū)域的預(yù)測(cè)有效,可進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)出的T94、I96、A325~Q327區(qū)域進(jìn)行局部的剛性增強(qiáng),如定點(diǎn)突變引入更多的作用力或刪除柔性部分,以提高Ana-LOX的熱穩(wěn)定性。

    圖7 溫度對(duì)AAnnaa-LOX與I96V酶相對(duì)活力的影響Fig. 7 Effect of temperature on the activity of Ana-LOX and I96V mutant

    由圖7可知,I96位發(fā)生突變后,溫度對(duì)酶相對(duì)活力的影響發(fā)生了較大改變,在25~55 ℃范圍內(nèi)突變體可以保持80%以上的活力,而野生型對(duì)溫度的變化較為敏感,僅在33~37 ℃范圍內(nèi)酶相對(duì)活力可以維持80%以上。說(shuō)明定點(diǎn)突變拓寬了突變體I96V對(duì)溫度的適應(yīng)范圍。

    表2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定Table2 Kinetic parameters of AAnnaa-LOX and I96V mutant

    與野生型相比,突變體I96V在熱穩(wěn)定性提高的同時(shí),酶的比活力也得到了提高,發(fā)生了活力與穩(wěn)定性的共進(jìn)化。如表2所示,突變體I96V的米氏常數(shù)(Km)相對(duì)野生型顯著降低,因此突變體I96V與底物更具有親和力,同時(shí)催化速率(kcat)均與kcat/Km高于野生型,比活力達(dá)到了野生型的2.48 倍。

    3 討 論

    影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素有疏水相互作用、氫鍵、離子鍵、芳香環(huán)的相互作用、二硫鍵、金屬離子、氨基酸組成和外界因素等[22]。但酶的熱穩(wěn)定性往往受到諸多因素的協(xié)同影響,因此對(duì)于酶熱穩(wěn)定性的改造和機(jī)制研究一直是生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)。MD提供了在原子水平上探索蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)特性的有力方法,作為一種計(jì)算機(jī)輔助手段,已被用于鑒定蛋白質(zhì)中可以作為增強(qiáng)穩(wěn)定性靶點(diǎn)的柔性區(qū)域?,F(xiàn)研究已表明,將分子動(dòng)力學(xué)模擬應(yīng)用到蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究中,可以明顯提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[23]。Pikkemaat等[24]通過(guò)MD鑒定出脫鹵素酶的一段helix-loop-helix的高柔性區(qū)域,引入二硫鍵后使熱穩(wěn)定性及尿素變性都產(chǎn)生了巨大改變。高新星等[25]鑒定出枯草芽孢桿菌氨肽酶存在非催化的loop區(qū)域,并對(duì)其刪除,使半失活溫度(T50)從71 ℃提高到77 ℃。而有關(guān)魚腥藻脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性提高的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

    本研究為了比較298 K和370 K運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下的構(gòu)象差異,分別在298 K和370 K條件下進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬;在MD過(guò)程中,當(dāng)活性中心缺少鐵離子時(shí),RMSD無(wú)法平衡,蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生崩塌(數(shù)據(jù)未給出),表明LOX活性中心的鐵離子對(duì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、發(fā)揮催化活性不可缺少。而同源建模構(gòu)建的模型并沒有給出鐵離子信息,因此需要將模板與Ana-LOX模型比對(duì),定位出鐵離子位置。同時(shí),在MD過(guò)程中需要添加小分子力場(chǎng)與金屬離子參數(shù)。結(jié)果顯示,在298 K條件下1 ns后RMSD值就達(dá)到平衡,而320 K條件下6~9 ns之間RMSD值發(fā)生了躍遷后又恢復(fù)平衡(圖3)。整體上320 K條件下的RMSD高于298 K條件下的RMSD,RMSD變化較大證明在320 K 較高溫度下,主鏈Cα變化較為劇烈,分子柔性變大。比較兩個(gè)溫度下的RMSF,以及320K條件下6~9 ns和平衡時(shí)的RMSF,選取RMSF較大的氨基酸,并逐一結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與作用力分析,預(yù)測(cè)出T94、I96、A3~Q327區(qū)域?yàn)锳na-LOX不穩(wěn)定區(qū)域(圖5),均位于Loop環(huán),且位于蛋白質(zhì)表面。研究已表明,影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的氨基酸也主要位于蛋白質(zhì)表面[26],Loop環(huán)在蛋白質(zhì)中未形成有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的部分,是柔性較大的區(qū)域,不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[27]。另外,從氨基酸組成角度分析,5 個(gè)氨基酸(T94、I96、A3、I326、Q327)中有4 個(gè)屬于疏水氨基酸,而疏水氨基酸一般分布于蛋白質(zhì)內(nèi)部,蛋白表面的疏水氨基酸不利于其穩(wěn)定性[28]。其中蘇氨酸(threonine,Thr)與谷氨酰胺(glutamine,Gln)也屬于熱不穩(wěn)定氨基酸,Thr可以和蛋白質(zhì)周圍的水分子發(fā)生相互作用,但在高溫條件下結(jié)合的水分子會(huì)釋放出來(lái),從而破壞了蛋白質(zhì)和水分子結(jié)合部位的局部結(jié)構(gòu),導(dǎo)致整個(gè)蛋白質(zhì)的失穩(wěn)[29]。而暴露狀態(tài)的Gln,在高溫條件下容易產(chǎn)生脫酰氨基反應(yīng),也不利于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象保持穩(wěn)定[30]。

    綜上所述,本研究運(yùn)用Amber 12軟件,對(duì)Ana-LOX進(jìn)行了MD模擬,計(jì)算了蛋白質(zhì)分子在水溶液中的運(yùn)動(dòng)軌跡,發(fā)現(xiàn)Ana-LOX的T94、I96、A3~Q327區(qū)域柔性較大,為Ana-LOX不穩(wěn)定區(qū)域,并對(duì)I96號(hào)位進(jìn)行了突變,驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的有效性,探索了增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性的機(jī)制,結(jié)果表明通過(guò)蛋白質(zhì)工程分子改造手段,可以增強(qiáng)上述區(qū)域的剛性,提高Ana-LOX熱穩(wěn)定性。

    [1] HANSEN J, GARRETA A, BENINCASA M, et al. Bacterial lipoxygenases, a new subfamily of enzymes? a phylogenetic approach[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(11): 4737-4747. DOI:10.1007/s003-013-4887-9.

    [2] ALBERTI J C, MARIANI M, de CARAFFA V B B, et al. A functional role identif ed for conserved charged residues at the active site entrance of lipoxygenase with double specificity[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2016, 123: 167-173. DOI:10.1016/ j.molcatb.2015.10.011.

    [3] ZHANG Chong, ZHANG Shuang, LU Zhaoxin, et al. Effects of recombinant lipoxygenase on wheat flour, dough and bread properties[J]. Food Research International, 2013, 54(1): 26-32. DOI:10.1016/j.foodres.2013.05.0.

    [4] GOUNARIS Y. Biotechnology for the production of essential oils, flavours and volatile isolates. a review[J]. Flavour and Fragrance Journal, 2010, 25(5): 367-386. DOI:10.1002/ffj.1996.

    [5] HUGHES R K, WU Z C, ROBINSON D S, et al. Characterization of authentic recombinant pea-seed lipoxygenases with distinct properties and reaction mechanisms[J]. Biochemical Journal, 1998, 333: 33-43.

    [6] 張充, 周孝偉, 呂鳳霞, 等. 重組魚腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表達(dá)、分離純化及活性分析[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(4): 440-456. DOI:10.13345/j.cj b.2012.04.006.

    [7] ZHANG C, TAO T, YING Q, et al. Extracellular production of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 in Bacillus subtilis and its effect on wheat protein[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 201 2, 94(4): 949-958. DOI:10.1007/s003-012-3895-5.

    [8] 任娣, 謝亞娟, 陸兆新, 等. 重組脂肪氧合酶對(duì)面團(tuán)流變性質(zhì)及面包品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(13): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201513001.

    [9] WANG X M, LU F X, ZHANG C, et al. Peroxidation radical formation and regiospecif city of recombinated Anabaena sp. lipoxygenas e and its effect on modifying wheat proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(7): 1713-1719. DOI:10.1021/jf503238h.

    [10] WANG X M, LU F X, ZHANG C, et al. Effects of recombinated Anabaena sp. lipoxygenase on the protein component and dough property of wheat f our[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(40): 9885-9892. DOI:10.1021/jf503238h.

    [11] LU X, LIU S, FENG Y, et al. Enhanced thermal stability of Pseudomonas aeruginosa lipoxygenase through modif cation of two highly f exible regions[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(4): 1663-1669. DOI:10.1007/s00253-013-5039-y.

    [12] GUO F F, ZHANG C F, BIE X M, et al. Improving the thermostability and activity of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 by d irected evolution and site-directed mutagenesis[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 107: 23-30. DOI:10.1016/ j.molcatb.2014.05.016.

    [13] LU X, LIU S, ZHANG D, et al. Enhanced thermal stability and specif c activity of Pseudomonas aer uginosa lipoxygenase by fusing with self-assembling amphipathic peptides[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(21): 9419-9427. DOI:10.1007/s00253-013-4751-y.

    [14] CHRISTENSEN N J, KEPP K P. Stability mechanisms of a thermophilic laccase probed by molecular dynamics[J]. PLoS ONE, 2013, 8(4): e61985. DOI:10.1371/journal.pone.0061985.

    [15] KELLEY L A, MEZULIS S, YATES C M, et al. The Phyre2 web porta l for protein modeling, prediction and analysis[J]. Nature Protocols, 2015, 10(6): 845-858. DOI:10.1038/nprot.2015.053.

    [16] LASKOWSKI R A, MACARTHUR M W, MOSS D S, et al. Procheck-a program to check the stereochemical quality of protein struct ures[J]. Journal of Applied Crystallography, 1993, 26(2): 26283-26291. DOI:10.1107/S0021889892009944.

    [17] SEELIGER D, de GROOT B L. Ligand docking and binding site analysis with PyMOL and Autodock/Vina[J]. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 2010, 24(5): 417-422. DOI:10.1007/s10822-010-9352-6.

    [18] SALOMON-FERRER R, CASE D A, WALKER R C. An overview of the Amber biomolecular simulation package[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews-Computational Molecular Science, 2013, 3(2): 198-210. DOI:10.1002/wcms.1121.

    [19] L INDORFF-LARSEN K, PIANA S, PALMO K, et al. Improved sidechain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field[J]. Proteins-Structure Function and Bioinformatics, 2010, 78(8): 1950-1958. DOI:10.1002/prot.22711.

    [20] BRODHUN F, CRISTOBAL-SARRAMIAN A, ZABEL S, et al. An iron 13S-lipoxygenase with an α-linolenic acid specific hydroperoxidase activity from Fusarium oxysporum[J]. PLoS ONE, 2013, 8(5): e64919-e64919. DOI:10.1371/journal.pon e.0064919.

    [21] NEWIE J, ANDREOU A, NEUMANN P, et al. Crystal structure of a lipoxygenase from Cyanothece sp. may reveal novel features for substrate acquisition[J]. Journal of Lipid Res earch, 2016, 57(2): 276-287. DOI:10.1194/jlr.M064980.

    [22] 田健, 王平, 伍寧豐, 等. 理性設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2012, 2(4): 233-239. DOI:10.3969/ j.issn.2095-2341.2012.04.01.

    [23] ZHANG C, ZHANG L, ZHANG Y, et al. Study on the stabil ity and enzymatic property improvement of porcine pancreas lipase modif ed by ionic liquids using molecular simulation[J]. Acta Chimica Sinica, 2016, 74(1): 74-80. DOI:10.6023/a15070496.

    [24] PIKKEMAAT M G, LINSSEN A B, BERENDSEN H J, et al. Molecular dynamics simulations as a tool for improving protein stability[J]. Protein Engineering, 2002, 15(3): 185-192. DOI:10.1093/ protein/15.3.185.

    [25] GAO X X, LIU Z M, CU I W J, et al. Enhanced thermal stability and hydrolytic ability of Bacillus subtilis aminopeptidase by removing the thermal sensitive domain in the non-catalytic region[J]. PLoS ONE, 2014, 9(3): e92357. DOI:10.1371/journal.pone.0092357.

    [26] MORLEY K L, KAZLAUSKAS R J. Improving enzyme properties: when are closer mutations better?[J]. Trends in Biotechnology, 2005, 23(5): 231-237. DOI:10.1016/j.tibtech.2005.03.005.

    [27] LI B C, YANG G Y, WU L, et al. Role of the N C-Loop in catalytic activity and stability in lipase from Fervidobacterium changbaicum[J]. PLoS ONE, 2012, 7(10): e46881. DOI:10.1371/journal.pone.0046881.

    [28] SCHWEHM J M, KRISTYANNE E S, BIGGERS C C, et al. Stability effects of increasing the hydrophobicity of solvent-exposed side chains in staphylococcal nuclease[J]. Biochemistry, 1998, 37(19): 6939-6948. DOI:10.1021/b i9725069.

    [29] NAGENDRA H G, SUKUMAR N, VIJAYAN M. Role of water in plasticity, stability, and action of proteins: the crystal structures of lysozyme at very low levels of hydration[J]. Proteins-Structure Function and Bioinformatics, 1998, 32(2): 229-240. DOI:10.1002/ (SICI)1097-0134(19980801)32:2<229::AID-PROT9>3.0.CO;2-F.

    [30] KANEKO H, MINAGAWA H, SHIMADA J. Rational design of thermostable lactate oxidase by analyzing quaternary structure and p revention of deamidation[J]. Biotechnology Letters, 2005, 27(22): 1777-1784. DOI:10.1007/s10529-005-3555-2.

    Molecular Dynamics Simulation of Thermal Stability Improvement of Lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7160

    QIAN Hui, LU Zhaoxin, ZHANG Chong, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, L? Fengxia*
    (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

    Homology modeling was used to predict the 3D structure of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7160 (Ana-LOX) and to simulate its motion trajectory in aqueous solution by molecular dynamics simulation at 298 and 320 K, respectively. After root mean square deviation (RMSD) and root mean square f uctuation (RMSF) values were calculated, thermal stability was evaluated based on the RMSF value. Force analysis was also performed to predict the unstable region. Results indicated that the T94, I96, and A325 to Q327 areas of Ana-LOX were f exible and they played a crucial role in the thermal instability of Ana-LOX. The half-life of I96V mutant constructed by site-directed mutagenesis increased 2.5 folds compared with that of the wild-type enzyme, conf rming the validity of the prediction. Our research can provide a theoretical basis for the improvement of the thermal stability of lipoxygenase.

    lipoxygenase; homology modeling; molecular dynamics simulation; thermal stability

    10.7506/spkx1002-6630-201702001

    TS202.3

    A

    1002-6630(2017)02-0001-06

    錢輝, 陸兆新, 張充, 等. 魚腥藻脂肪氧合酶熱穩(wěn)定性提高的分子動(dòng)力學(xué)模擬[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702001. http://www.spkx.net.cn

    QIAN Hui, LU Zhaoxin, ZHANG Chong, et al. Molecular dynamics simulation of thermal stability improvement of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7160[J]. Food Science, 2017, 38(2): 1-6. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201702001. http://www.spkx.net.cn

    2016-03-30

    國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31470095)

    錢輝(1990—),男,碩士研究生,主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail:2013108028@njau.edu.cn

    *通信作者:呂鳳霞(1963—),女,教授,博士,主要從事酶工程研究。E-mail:lufengxia@njau.edu.cn

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