• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紫外誘變選育米曲霉氨肽酶高產(chǎn)菌株

    2017-02-08 06:21:23李鵬張艷芳王軍韓玉婷王選年
    中國調(diào)味品 2017年1期
    關(guān)鍵詞:制曲孢子中性

    李鵬,張艷芳,王軍,2,韓玉婷,王選年*

    (1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450000)

    紫外誘變選育米曲霉氨肽酶高產(chǎn)菌株

    李鵬1,2,張艷芳1,王軍1,2,韓玉婷1,王選年1*

    (1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450000)

    以米曲霉CICC2066菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變,經(jīng)過多次篩選后得到3株氨肽酶活力顯著提高且遺傳性較穩(wěn)定的誘變株UY-15,UY-17和UY-20。將3株誘變株與出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)性能比較,結(jié)果表明:米曲霉UY-15,UY-17和UY-20培養(yǎng)42 h后制曲中氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24,1.38,1.54倍,且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。3株誘變株的孢子量較出發(fā)菌株具有優(yōu)勢(shì)。

    米曲霉;紫外誘變;氨肽酶

    氨肽酶不僅能夠水解多肽,還能水解完整的蛋白酶[1]。在食品工業(yè)上通常與其他蛋白酶復(fù)合使用來進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)[2]。米曲霉是氨肽酶的重要來源菌之一[3]。目前亮氨酸氨肽酶(LAPs)已經(jīng)成為最被關(guān)注的氨肽酶之一,LAPs通過對(duì)蛋白水解產(chǎn)物中苦味肽的水解并釋放游離氨基酸,達(dá)到改善蛋白水解物的風(fēng)味、縮短加工周期、提高營養(yǎng)價(jià)值的目的[4-6]。

    傳統(tǒng)醬油的發(fā)酵生產(chǎn)是利用米曲霉生長過程中產(chǎn)生的豐富酶系水解蛋白質(zhì)、淀粉產(chǎn)生氨基酸、葡萄糖等物質(zhì),從而形成醬油產(chǎn)品獨(dú)特的色、香、味、體[7],所以在醬油釀造過程中菌種的優(yōu)劣決定了產(chǎn)品的品質(zhì)。當(dāng)前各生產(chǎn)單位所使用的高產(chǎn)菌株,幾乎都是通過誘變育種來提高產(chǎn)量、擴(kuò)大品種、改善產(chǎn)品質(zhì)量、簡化生產(chǎn)工藝[8]。司曉光等[9]對(duì)米曲霉3.042菌株進(jìn)行了常壓室溫等離子體(ARTP)誘變,使酸性蛋白酶的活性提高了39.9%;吳冬梅等[10]通過對(duì)一株米曲霉出發(fā)菌進(jìn)行紫外誘變,使中性蛋白酶的的酶活力提高了1倍。但是這些研究多集中在對(duì)中性蛋白酶及酸性蛋白酶方面,對(duì)氨肽酶活性進(jìn)行考察的比較少。本研究以購買的CICC2066米曲霉菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變,以期提高目標(biāo)菌株制曲42 h后產(chǎn)氨肽酶量與中性蛋白酶活性在42 h達(dá)到峰值保持一致,從而更好地應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)中。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株CICC2066:購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 斜面培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基。

    1.2.2 蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基

    制曲培養(yǎng)基。

    1.2.3 氨肽酶活力篩選培養(yǎng)基

    蔗糖30 g/L,LNA 0.5 g/L,MgSO4·7H2O0.5 g/L,KH2PO410.0 g/L,瓊脂粉17 g/L,無菌水1000 mL,pH 6.4,121 ℃滅菌20 min。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 粗酶液的提取方法

    1.3.1.1 中性蛋白酶粗酶液

    取1 g于30 ℃培養(yǎng)后的固體干曲,按照1∶20(g/mL)加入0.1 mol/L pH 7.2 磷酸緩沖液,于40 ℃水浴中浸提1 h,間歇攪拌,用4層紗布過濾即得粗酶液。

    1.3.1.2 氨肽酶粗酶液

    取1 g于30 ℃培養(yǎng)后的固體干曲,按照1∶20(g/mL)加入0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液,放置4 ℃過夜,4層紗布過濾得粗酶液。

    1.3.2 酶活性的測(cè)定方法

    1.3.2.1 中性蛋白酶測(cè)定

    采用福林-酚法,參考GB/T 23527-2009蛋白酶活力測(cè)定法。中性蛋白酶的測(cè)定pH值為7.2。

    酶活定義:1 g干曲在40 ℃,pH 7.2條件下,1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位。

    酶活力計(jì)算公式:U=A×K×4/10×n。

    式中:A為平均吸光度值;K為吸光常數(shù);4為反應(yīng)試劑的總體積;10為反應(yīng)時(shí)間;n為酶液稀釋倍數(shù)。

    1.3.2.2 氨肽酶測(cè)定

    采用亮氨酸對(duì)硝基苯胺法。酶活定義:在40 ℃,pH 7.2的條件下,每1 min水解亮氨酸對(duì)硝基苯胺生成1 μg對(duì)硝基苯胺(pNA)所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

    酶活力計(jì)算公式:U= A×V1×D/(k×t×V2)。

    式中:A為平均吸光度值;V1為反應(yīng)總體積;V2為酶液體積;D為酶液的稀釋倍數(shù);k為消光系數(shù);t為恒溫反應(yīng)時(shí)間。

    1.3.3 菌種誘變

    1.3.3.1 致死率確定

    將5 mL菌懸液(1.28×107個(gè)孢子/mL)置于6 cm的無菌培養(yǎng)皿中,距離30 W 紫外燈的距離為30 cm左右,分別處理0,2,4,6,8,10 min;取0.5 mL處理后的菌液進(jìn)行10-1~ 10-5梯度稀釋分離,取其中的10-3,10-4,10-53個(gè)稀釋度各200 μL菌液涂布平板,設(shè)置3組重復(fù),30 ℃倒置培養(yǎng)(避光培養(yǎng))。培養(yǎng)3天后,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),計(jì)算致死率。

    1.3.3.2 紫外誘變初篩

    經(jīng)氨肽酶水解LNA后對(duì)硝基苯胺在篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃色,根據(jù)黃色水解圈的大小采用LNA篩選平板法進(jìn)行初篩;分別測(cè)定HE值(HE值=水解圈直徑/菌落直徑),選擇HE值較對(duì)照大者移入PDA斜面,30 ℃培養(yǎng)4天,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.3 紫外誘變復(fù)篩

    將經(jīng)過初篩后所得菌株制成孢子懸液,吸取1 mL孢子懸液(1.28×107個(gè)孢子/mL) 接種于蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基三角瓶中,于30 ℃ 培養(yǎng),制曲42 h,測(cè)定其氨肽酶和中性蛋白酶活力。

    1.3.3.4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

    將復(fù)篩得到的菌株在PDA斜面上連續(xù)傳代5次,每次傳代后在蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測(cè)定其氨肽酶和中性蛋白酶活力。

    1.3.3.5 性能測(cè)定

    米曲霉UY-15,UY-17和UY-20菌株與出發(fā)菌株的性能比較:氨肽酶和中性蛋白酶活力測(cè)定方法同上,生長速度的測(cè)定采用直線生長法,孢子數(shù)測(cè)定采用懸滴法(ZBX 66028-87)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 CICC2066菌株中性蛋白酶和氨肽酶活性檢測(cè)結(jié)果

    CICC2066菌株制曲過程中性蛋白酶活性變化見圖1,中性蛋白酶活性在42 h達(dá)到最高的830.8 U/g(干曲)。

    圖1 CICC2066菌株曲中性蛋白酶活性

    CICC2066菌株制曲過程中氨肽酶活性變化見圖2,其氨肽酶活性在60 h達(dá)到201.4 U/mL。雖然菌株氨肽酶活性較高,但氨肽酶產(chǎn)量在60 h才達(dá)到峰值,不能與中性蛋白酶在42 h的最高產(chǎn)酶量保持一致,從而不能有效地水解多肽和提高醬油釀造過程中游離氨基酸的生成率,所以提高菌株制曲42 h的產(chǎn)氨肽酶量是有必要的。

    圖2 CICC2066菌株曲氨肽酶活性

    2.2 紫外誘變

    2.2.1 誘變條件的確定

    本研究采用紫外誘變的方式進(jìn)行菌種選育,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可知,當(dāng)致死率達(dá)到75%左右時(shí)正突變率最高[11],因此選擇75%左右致死率的致死劑量。

    表1 不同紫外照射時(shí)間及稀釋倍數(shù)的誘變結(jié)果

    由表1可知,誘變后稀釋倍數(shù)為103時(shí),由于原始孢子液濃度為1.28×107個(gè)孢子/mL,所以很難計(jì)算菌落數(shù)。當(dāng)誘變后稀釋倍數(shù)為104時(shí),雖然可以計(jì)算,但菌落緊貼無法看清水解圈,所以選擇稀釋倍數(shù)最佳的105。因此,最佳誘變條件是30 W照射燈,距離30 cm,照射時(shí)間6 min,誘變后稀釋倍數(shù)105。

    2.2.2 初篩

    氨肽酶篩選平板培養(yǎng)3天后,測(cè)定單菌落的水解圈直徑與菌落直徑,計(jì)算HE值,HE值=透明圈直徑/菌落直徑,選擇HE值增大的20株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

    2.2.3 復(fù)篩

    將初篩獲得的20株誘變株進(jìn)行PDA斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng),培養(yǎng)4天后將孢子液(1.28×107個(gè)孢子/mL)接入蛋白酶復(fù)篩培養(yǎng)基,檢測(cè)其氨肽酶和中性蛋白酶制曲42 h酶活性,檢測(cè)結(jié)果見圖3和圖4。

    圖3 各誘變菌株第一次復(fù)篩時(shí)氨肽酶活性

    由圖3可知,誘變菌株第1次復(fù)篩氨肽酶活性在120~184.3 U/mL,經(jīng)比較其中UY-5,UY-7,UY-15,UY-17和UY-20的氨肽酶活性較高。

    圖4 各誘變菌株第一次復(fù)篩時(shí)中性蛋白酶活性

    由圖4可知,20株誘變菌株中性蛋白酶活性在787.4~889.04 U/g(干曲),CICC2066菌株活性為830.8 U/g(干曲)。其中UY-1,UY-15,UY-17,UY-18,UY-19和UY-20的中性蛋白酶活性高于原始菌株,但UY-17,UY-18,UY-19提高得很不明顯。結(jié)合圖3中各菌株氨肽酶活性,選擇UY-1,UY-15,UY-17,UY-20 4株 誘變株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    2.2.4 高產(chǎn)突變株的確定和遺傳穩(wěn)定性研究

    將UY-1,UY-15,UY-17,UY-20菌株分別經(jīng)過3輪發(fā)酵產(chǎn)酶能力測(cè)試,在不低于出發(fā)菌株中性蛋白酶活性的基礎(chǔ)下,最終篩選出3株具有產(chǎn)酶優(yōu)勢(shì)的突變株UY-15,UY-17,UY-20。將UY-15,UY-17和UY-20分別傳代5次做遺傳穩(wěn)定性考察,結(jié)果見表2。

    表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    由表2可知,以均值作對(duì)照,氨肽酶與中性蛋白酶活性的變化范圍不大,表明這3株突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。其中,UY-15,UY-17和UY-20制曲中氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24,1.38,1.54倍,且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。

    2.2.5 3株米曲霉突變株與米曲霉CICC2066菌株的性能比較

    米曲霉UY-15,UY-17和UY-20菌株與米曲霉CICC2066菌株的性能比較:由表3可知,米曲霉UY-15,UY-17,UY-20菌株的氨肽酶活性明顯高于出發(fā)菌株CICC2066,且UY-20中性蛋白酶活性高于出發(fā)菌株7%,在蛋白質(zhì)水解過程中可以發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì),并且孢子數(shù)大于出發(fā)菌株。

    表3 突變菌株與CICC2066的性能比較

    3 結(jié)論

    通過對(duì)米曲霉CICC2066菌株進(jìn)行紫外誘變,篩選出3株高產(chǎn)氨肽酶且遺傳穩(wěn)定的突變株UY-15,UY-17,UY-20。其中,米曲霉UY-15,UY-17和UY-20制曲42 h后其氨肽酶活力分別是出發(fā)菌株的1.24,1.38,1.54倍,且UY-20中性蛋白酶活力較出發(fā)菌株提高了7%。通過直線生長法和懸滴法,考察了原始菌株與誘變菌株生長速率和孢子量,3株誘變株孢子量較出發(fā)菌株具有較大優(yōu)勢(shì)。本研究用誘變育種方式提高了CICC2066菌株制曲42 h的氨肽酶活性,目前已有研究人員通過組合培養(yǎng)的方式來提高蛋白酶活力,結(jié)合此類研究成果,通過不同米曲霉菌株組合制曲來提高氨肽酶產(chǎn)量會(huì)有很大的可能性。

    [1]吳慶勛.氨肽酶高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[D].無錫:江南大學(xué),2006:1-5.

    [2]段剛,趙振鋒,錢瑩.酶制劑在蛋白質(zhì)加工行業(yè)的應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2005,24(4):104-110.

    [3]Elegans A.A.oryzae和R.oligosporus肽酶系統(tǒng)及其脫苦機(jī)理的比較研究[D].上海:華東理工大學(xué),2011.

    [4]Rao M B, Tanksale A M, Ghatge M S,et al. Molecular, biotechnological aspects of microbial protease[J].Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:597-635.

    [5]Barry C M, O'cuinn G. Debittering of a tryptic digest of bovine β-casein using porcine kidney general aminopeptidase and X-prolydiptptidyl aminopeptidase fromLactococcuslactissubsp.cremoris AM2[J].Journal of Food Science,2000,65(7):1145-1150.

    [6]Raji Rahulan, Kiran S Dhar,K Madhavan Nampoothiri,et al.Characterization of leucine amino peptidase fromStreptomycesgedanensisand its applications for proteinhydrolysis[J].Process Biochemistry,2012,47:234-242.

    [7]姚開,呂遠(yuǎn)平,何強(qiáng),等.高活力酸性蛋白酶醬油菌種的選育[J].中國調(diào)味品,2002(5):16-18.

    [8]韋革宏,楊祥.發(fā)酵工程[M].北京:科學(xué)出版社,2008:54.

    [9]司曉光,鄭博,王小霞,等.米曲霉3.042突變株高產(chǎn)酸性蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科技,2014,39(9):12-17.

    [10]吳冬梅, 劉琨毅,李進(jìn),等.基于物理誘變的米曲霉高產(chǎn)菌株的選育及應(yīng)用[J].中國調(diào)味品,2014,39(6):38-42.

    [11]張克旭,陳寧,張蓓,等.代謝控制發(fā)酵[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,1998.

    Breeding ofAspergillusoryzaeAminopeptidase-producing Strains by Ultraviolet Induced Mutation

    LI Peng1, 2,ZHANG Yan-fang1,WANG Jun1,2,HAN Yu-ting1,WANG Xuan-nian1*

    (1.Biotechnology Research Center,College of Life Science and Technology,Xinxiang University, Xinxiang 453003,China;2.College of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,China)

    One strain ofAspergillusoryzaeCICC2066 is screened by UV induced mutagenesis. With screening for several times, three mutants UY-15, UY-17 and UY-20 with higher, stable aminopeptidase activity are obtained. Compared with CICC2066 on fermentation performance, the aminopeptidase activity of mutants UY-15, UY-17 and UY-20 of culturing for 42 h is 1.24, 1.38,1.54 times that of the starting strain. The neutral protease activity of UY-20 is increased by 7% than that of the starting strain. The number of spores of three induced strains is higher than that of CICC2066.

    Aspergillusoryzae; ultraviolet induced mutation; aminopeptidase

    2016-07-15 *通訊作者

    河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2011C550002)

    李鵬(1988-),男,碩士,研究方向:食品與微生物發(fā)酵; 王選年(1969-),男,河南靈寶人,教授,碩士生導(dǎo)師,博士,研究方向:微生物學(xué)與免疫學(xué)。

    TS201.25

    A

    10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.014

    1000-9973(2017)01-0061-04

    猜你喜歡
    制曲孢子中性
    制曲方式對(duì)豉香型白酒酒曲理化因子及細(xì)菌群落的影響
    基于模糊數(shù)學(xué)評(píng)定與響應(yīng)面法優(yōu)化毛霉型豆豉制曲工藝
    《中國酒曲制作技藝研究與應(yīng)用》出版發(fā)行
    釀酒科技(2020年7期)2020-12-19 01:53:51
    英文的中性TA
    鯽魚黏孢子蟲病的診斷與防治
    高橋愛中性風(fēng)格小配飾讓自然相連
    FREAKISH WATCH極簡中性腕表設(shè)計(jì)
    制作孢子印
    北蟲草培養(yǎng)基添加量對(duì)醬油制曲及酶活性的影響
    無所不在的小孢子
    美女视频免费永久观看网站| 97超视频在线观看视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色配什么色好看| 人妻一区二区av| 精品酒店卫生间| 三级国产精品欧美在线观看| 美女主播在线视频| 欧美精品国产亚洲| 久久99热这里只频精品6学生| 日本欧美国产在线视频| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲不卡免费看| 熟女av电影| 亚洲色图av天堂| 国产在视频线精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 精品少妇久久久久久888优播| 久久青草综合色| 国精品久久久久久国模美| av国产久精品久网站免费入址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 91精品伊人久久大香线蕉| 能在线免费看毛片的网站| 性色avwww在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产一级毛片在线| videos熟女内射| 亚洲第一av免费看| a级一级毛片免费在线观看| 内射极品少妇av片p| 波野结衣二区三区在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产人妻一区二区三区在| 晚上一个人看的免费电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产av新网站| 亚州av有码| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91狼人影院| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕av成人在线电影| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国国产精品蜜臀av免费| 大片免费播放器 马上看| 男人狂女人下面高潮的视频| 蜜桃在线观看..| 全区人妻精品视频| 国产精品成人在线| 成人影院久久| 大香蕉97超碰在线| 中文字幕制服av| 少妇的逼水好多| 看十八女毛片水多多多| 午夜日本视频在线| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费观看性生交大片5| 五月天丁香电影| 久热久热在线精品观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 一级毛片久久久久久久久女| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品国产三级专区第一集| 十分钟在线观看高清视频www | 国产亚洲欧美精品永久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 中国国产av一级| 男男h啪啪无遮挡| 成人无遮挡网站| 日韩一区二区三区影片| 国产欧美日韩精品一区二区| av天堂中文字幕网| av国产免费在线观看| 日韩强制内射视频| av不卡在线播放| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 深夜a级毛片| 97在线视频观看| 亚洲四区av| 高清在线视频一区二区三区| 色综合色国产| 一区在线观看完整版| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费观看的影片在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 干丝袜人妻中文字幕| 国产片特级美女逼逼视频| 免费观看性生交大片5| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美97在线视频| 国产成人免费无遮挡视频| av卡一久久| 国产人妻一区二区三区在| 水蜜桃什么品种好| 五月天丁香电影| 啦啦啦啦在线视频资源| 99久久精品一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 观看av在线不卡| 一级a做视频免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 色视频www国产| 久久婷婷青草| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 2022亚洲国产成人精品| 91久久精品电影网| 少妇丰满av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 精品一区二区三卡| 久久鲁丝午夜福利片| 老司机影院毛片| 日本vs欧美在线观看视频 | 1000部很黄的大片| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲国产av新网站| 国产在线男女| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲不卡免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 色网站视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品人妻熟女av久视频| 一个人免费看片子| 久久国产精品大桥未久av | 国产高潮美女av| 久久99精品国语久久久| 黑人高潮一二区| 日日撸夜夜添| 欧美一区二区亚洲| 国产高清国产精品国产三级 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲综合色惰| 久久综合国产亚洲精品| 国产男女内射视频| 久久精品人妻少妇| 日韩一本色道免费dvd| 国产在线男女| 岛国毛片在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| av免费观看日本| 久久久成人免费电影| 色视频在线一区二区三区| 久久久色成人| 伊人久久国产一区二区| 国产毛片在线视频| 亚洲av中文av极速乱| 黑人猛操日本美女一级片| 毛片女人毛片| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 美女中出高潮动态图| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久久久久电影网| 色哟哟·www| 国产淫片久久久久久久久| 久久久久网色| 少妇熟女欧美另类| 免费人成在线观看视频色| 国产 一区 欧美 日韩| 人妻一区二区av| 日韩人妻高清精品专区| 日日撸夜夜添| 性色avwww在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 男女免费视频国产| 在线观看三级黄色| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| h日本视频在线播放| 欧美日韩在线观看h| 免费av中文字幕在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 下体分泌物呈黄色| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 男的添女的下面高潮视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 男女下面进入的视频免费午夜| av国产精品久久久久影院| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成色77777| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产亚洲欧美精品永久| 久久97久久精品| 亚洲av综合色区一区| 国产午夜精品一二区理论片| 精品久久久久久久久av| 丝袜脚勾引网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费观看无遮挡的男女| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品一区二区在线观看99| 免费播放大片免费观看视频在线观看| av卡一久久| 亚洲人成网站高清观看| 男女免费视频国产| 九色成人免费人妻av| 国产人妻一区二区三区在| 99久久精品一区二区三区| 男人舔奶头视频| 久久久成人免费电影| 一本久久精品| 一个人免费看片子| 插逼视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 精品一区二区三区视频在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产男女超爽视频在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 国内精品宾馆在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 精品久久久久久久末码| 国产亚洲一区二区精品| 日韩成人伦理影院| 亚洲国产av新网站| 日本一二三区视频观看| 成人一区二区视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 一级a做视频免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久欧美国产精品| 国产高潮美女av| 丰满迷人的少妇在线观看| 一本久久精品| 久久久a久久爽久久v久久| 高清午夜精品一区二区三区| www.色视频.com| 国产av国产精品国产| 国产v大片淫在线免费观看| tube8黄色片| 久久久久久久久久久免费av| 婷婷色综合大香蕉| 国产综合精华液| 观看美女的网站| 99久国产av精品国产电影| 99热这里只有是精品在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产男女内射视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 成人美女网站在线观看视频| 精品熟女少妇av免费看| 久久久国产一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 99久久精品一区二区三区| 日本黄大片高清| 久久久精品94久久精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 蜜桃在线观看..| 久久99蜜桃精品久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 九九爱精品视频在线观看| av福利片在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品久久久久久av不卡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久国产一区二区| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 毛片一级片免费看久久久久| 伊人久久国产一区二区| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产av新网站| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲美女搞黄在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 美女内射精品一级片tv| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美最新免费一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 美女内射精品一级片tv| 国产成人精品一,二区| 久久热精品热| 国产亚洲最大av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 成人一区二区视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品蜜桃在线观看| 岛国毛片在线播放| 久久久久久伊人网av| 在线免费十八禁| 内射极品少妇av片p| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 免费看av在线观看网站| 蜜臀久久99精品久久宅男| 老司机影院成人| 成人免费观看视频高清| 青青草视频在线视频观看| 精品久久久噜噜| 日本午夜av视频| a级毛色黄片| 国产精品一区二区性色av| 天堂8中文在线网| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久国产网址| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产片特级美女逼逼视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩精品有码人妻一区| 国产在视频线精品| 免费人成在线观看视频色| 免费看av在线观看网站| 最近手机中文字幕大全| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 少妇丰满av| 亚洲国产精品成人久久小说| 尾随美女入室| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久久久久久成人| 七月丁香在线播放| 国产精品一区www在线观看| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品自拍成人| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 秋霞伦理黄片| 久久99蜜桃精品久久| 插阴视频在线观看视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲美女黄色视频免费看| av国产久精品久网站免费入址| 日韩一区二区视频免费看| 国产极品天堂在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产精品国产精品| 中文字幕av成人在线电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产 一区 欧美 日韩| 91久久精品电影网| 深爱激情五月婷婷| 国产在线一区二区三区精| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 嫩草影院新地址| 联通29元200g的流量卡| 深夜a级毛片| 日韩亚洲欧美综合| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产亚洲网站| h日本视频在线播放| 欧美另类一区| 亚洲av在线观看美女高潮| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av日韩在线播放| 久久青草综合色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品国产三级普通话版| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲av.av天堂| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久久久成人| 精品午夜福利在线看| 国产 精品1| 久久久久久久久久人人人人人人| 有码 亚洲区| 国产深夜福利视频在线观看| 只有这里有精品99| 亚洲四区av| 久久久久国产网址| 欧美另类一区| 日日啪夜夜爽| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品免费大片| 人妻系列 视频| 免费观看av网站的网址| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热这里只有是精品50| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久性生活片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久九九精品二区国产| 免费观看无遮挡的男女| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本wwww免费看| 久久人人爽人人片av| 国产av精品麻豆| 免费大片18禁| 一级毛片aaaaaa免费看小| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 色视频www国产| 日韩欧美 国产精品| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩成人伦理影院| av又黄又爽大尺度在线免费看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 嫩草影院入口| 欧美+日韩+精品| 有码 亚洲区| tube8黄色片| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美3d第一页| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产亚洲精品久久久com| 岛国毛片在线播放| 一级二级三级毛片免费看| 日韩一区二区视频免费看| 97超视频在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品久久久久久久电影| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费看不卡的av| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲欧洲国产日韩| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品.久久久| 免费大片18禁| 秋霞伦理黄片| 永久网站在线| 各种免费的搞黄视频| 国产69精品久久久久777片| 大话2 男鬼变身卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 尾随美女入室| 欧美国产精品一级二级三级 | 欧美极品一区二区三区四区| 日本av免费视频播放| 国产精品一二三区在线看| 欧美三级亚洲精品| 久久午夜福利片| 欧美+日韩+精品| 国产91av在线免费观看| 久久久久久久精品精品| 国产久久久一区二区三区| 日韩中字成人| 欧美3d第一页| tube8黄色片| 亚洲性久久影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 日日啪夜夜撸| 在线 av 中文字幕| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品少妇黑人巨大在线播放| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人妻一区二区av| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一本久久精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 国精品久久久久久国模美| 国产精品不卡视频一区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美日韩视频精品一区| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 精品久久久久久久久亚洲| 免费看av在线观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一边亲一边摸免费视频| tube8黄色片| 十分钟在线观看高清视频www | 久久午夜福利片| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 国产精品.久久久| 久久综合国产亚洲精品| 人人妻人人看人人澡| 十分钟在线观看高清视频www | 国产精品久久久久久精品古装| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人aa在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲成人av在线免费| 久久久精品94久久精品| 亚洲三级黄色毛片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久人妻| 日韩一本色道免费dvd| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品成人在线| 在线 av 中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| av福利片在线观看| av不卡在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 大片免费播放器 马上看| 亚洲久久久国产精品| av国产免费在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人91sexporn| 91精品国产九色| 国产高潮美女av| 欧美日韩精品成人综合77777| 性色av一级| 一区在线观看完整版| 秋霞在线观看毛片| 国产永久视频网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本色播在线视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 五月玫瑰六月丁香| 99久久精品一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 高清欧美精品videossex| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品无大码| 国产久久久一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 免费黄频网站在线观看国产| 精品久久久久久久久av| 国产伦理片在线播放av一区| 男女国产视频网站| 亚洲在久久综合| av国产久精品久网站免费入址| 男女免费视频国产| 在线免费十八禁| 欧美精品一区二区免费开放| 香蕉精品网在线| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 有码 亚洲区| 欧美人与善性xxx| 嫩草影院入口| 在线看a的网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 免费观看在线日韩| 国产成人aa在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美精品专区久久| 国产免费视频播放在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 少妇高潮的动态图| 六月丁香七月| 国产男女超爽视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品福利在线免费观看| 老熟女久久久| 亚洲av福利一区| 国产毛片在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品一二三区在线看| 精品久久久久久电影网| 99久久精品一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久久久人人人人人人| 插阴视频在线观看视频| 国产免费一级a男人的天堂| 51国产日韩欧美| 日韩电影二区| 草草在线视频免费看| 中文字幕久久专区| 天堂8中文在线网| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜老司机福利剧场| 久久精品人妻少妇| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人91sexporn| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| 大香蕉久久网| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品人妻少妇| 中文字幕制服av| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美另类一区| 亚洲欧美日韩东京热| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av不卡在线观看| 精品午夜福利在线看| 精品少妇黑人巨大在线播放|