發(fā)酵菌株GQ3-2的酶活及形態(tài)學研究

溫斯淇，孫曉東，楊紅，簡文丹，盧萌萌，郭穎

(大連民族大學 環(huán)境與資源學院，遼寧 大連 116600)

發(fā)酵菌株GQ3-2的酶活及形態(tài)學研究

溫斯淇，孫曉東*，楊紅，簡文丹，盧萌萌，郭穎

(大連民族大學 環(huán)境與資源學院，遼寧 大連 116600)

豆醬是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，在天然發(fā)酵過程中其表面附著了大量真菌類群。有些種類具有α-淀粉酶活性，能水解淀粉產生葡萄糖、糊精、麥芽糖和低聚糖等；有的則產生蛋白酶，分解大豆蛋白為可被人體吸收、利用的小肽。從東三省254份家庭自制豆醬中分離發(fā)酵功能菌株，利用可溶性淀粉平板獲得具有α-淀粉酶活性的菌株34株，利用酪蛋白平板獲得具有蛋白酶活性的菌株35株。其中菌株GQ3-2同時具有很高的淀粉酶和蛋白酶活性，經標準培養(yǎng)、形態(tài)學鑒定，確定菌株GQ3-2為赭曲霉。

豆醬；α-淀粉酶活性；蛋白酶活性；赭曲霉

豆醬[1]與醬油相似，具有獨特的色、香、味、形，是人們生活中不可或缺的調味品，也是傳統(tǒng)的佐餐品。家庭自制的豆醬是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，其中蛋白質和碳水化合物的含量占有很高的比重，營養(yǎng)豐富，口味獨特，易于消化吸收。家庭自制豆醬時，利用空氣中微生物自然發(fā)酵而形成，因此豆醬表面附著了大量真菌，真菌通過代謝可以產生α-淀粉酶[2]和蛋白酶[3]。α-淀粉酶屬于內切型淀粉酶，是可對支鏈淀粉、直鏈淀粉或其他α-1,4-葡聚糖分子內部的α-1,4-糖苷鍵以隨機的方式進行水解， 生成長度不等的直鏈和支鏈寡糖的一類酶的總稱[4]。α-淀粉酶普遍分布在植物界、動物界和微生物中，它能水解[5]淀粉產生葡萄糖、糊精、麥芽糖和低聚糖等，在實際應用中主要集中在食品應用領域；蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱，按其降解多肽的方式分成內肽酶和端肽酶兩類。前者可把大分子量的多肽鏈從中間切斷，形成分子量較小的朊和胨；后者又可分為羧肽酶和氨肽酶，它們分別從多肽的游離羧基末端或游離氨基末端逐一將肽鏈水解成氨基酸[6]。目前，蛋白酶常被應用于干酪生產、肉類嫩化和植物蛋白改性等方面。本實驗從我國東三省采集到254份樣品，獲得純培養(yǎng)真菌菌株389份，對這些菌株進行α-淀粉酶和蛋白酶的篩選，為α-淀粉酶和蛋白酶的生產與實際應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵豆醬 東三省各地的農戶自產；三氯乙酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、福林酚試劑 上海索萊寶生物科技有限公司；酪氨酸 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其余試劑(均為分析純) 天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

奧林帕斯CX21顯微鏡 日本奧林帕斯公司； HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司； XFH-75CA電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產α-淀粉酶菌株的篩選

采用可溶性淀粉培養(yǎng)基[7]進行菌株初篩。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL可溶性淀粉培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取單菌落接種于平板上，置于25 ℃黑暗處培養(yǎng)5 天。產孢后，在平板上滴加碘液， 觀察菌落周圍有無透明圈出現，如形成了透明圈[8]，說明該菌株產生α-淀粉酶，將淀粉分解。

1.3.2 產蛋白酶菌株的篩選

采用酪蛋白平板進行初篩。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，注入15 mL酪蛋白培養(yǎng)基，待凝固成平板后，挑取菌落接種于平板上，置于25 ℃黑暗處培養(yǎng)5天。產孢后，觀察菌落周圍有無透明圈出現，如形成了透明圈，說明該菌株產生蛋白酶，將酪蛋白分解。

1.3.3 發(fā)酵復篩

采用具有天然成分的麥麩[9]固體培養(yǎng)基，以麥麩∶豆餅粉∶水為4∶1∶3的比例配制，滅菌后將菌株接入，于25 ℃黑暗處培養(yǎng)5天后產孢。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50 mL無菌的去離子水，分散均勻，30 ℃震蕩培養(yǎng)4 h，靜置。濾液在4200 r/min下離心20 min，取上清液作為粗酶液測定。

1.3.4 酶活測定

通過3,5-二硝基水楊酸法測定α-淀粉酶活性，通過福林酚法測定蛋白酶活性。

α-淀粉酶酶活定義：在55 ℃、一定pH條件下，以單位重量樣品在單位時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。每個樣品需做3個平行試驗，酶活力的計算取平均值。

式中：U 為樣品α-淀粉酶活力，mg/(g·min)；M為根據樣品的吸光度值在標準曲線上查得的麥芽糖的含量，mg；N為酶液的稀釋倍數；L 為淀粉酶原液總體積的倍數；G 為樣品的質量，g；5為反應時間，min。

蛋白酶酶活定義：在一定pH值和40 ℃條件下，每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個蛋白酶活力單位。每個樣品做3個平行試驗，取平均值計算酶活力。

式中：U 為樣品α-淀粉酶活力，mg/(g·min)；C為標準曲線得到的酪氨酸溶液的質量濃度，μg/mL；N為酶液的稀釋倍數；4為反應試劑總體積，mL；10為反應時間，min；V為酶液總體積，mL。

1.3.5 菌株的形態(tài)學鑒定

在查氏瓊脂、查氏酵母膏瓊脂、麥芽浸汁中25 ℃培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察顯微形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 產α-淀粉酶菌株的篩選結果

通過可溶性淀粉平板法共獲得34株具有α-淀粉酶活性的菌株，包括曲霉(Aspergillus)，青霉(Penicillium)，毛霉(Mucor)，犁頭霉(Absidia)，鐮孢菌(Fusarium)，木霉(Trichoderma)和帚霉屬(Scopulariopsis)等屬的真菌。

2.2 產蛋白酶菌株的篩選結果

通過酪蛋白平板的篩選，有35株表現出蛋白酶活性，培養(yǎng)7天后出現透明圈，其中包括曲霉菌(Aspergillus)，青霉菌(Penicillium)，毛霉(Mucor)，鐮孢菌(Fusarium)，帚霉(Scopulariopsis)，芽枝孢(Cladosporium)，犁頭霉(Absidia)等屬。

2.3 兩種酶活的測定

菌株GQ3-2在可溶性淀粉培養(yǎng)基和酪蛋白平板中均形成透明圈，證明此菌同時具有α-淀粉酶活性和蛋白酶活性。發(fā)酵復篩后的粗酶液經 3,5-二硝基水楊酸法和福林酚法[10]分別測定GQ3-2的α-淀粉酶和蛋白酶活性大小，見表1。

表1 GQ3-2的α-淀粉酶活性和蛋白酶活性

GQ3-2在豆醬樣品中分離頻率很高，并且表現出較高的α-淀粉酶和蛋白酶活性。通過標準培養(yǎng)、顯微觀察，確定GQ3-2為赭曲霉，其形態(tài)見圖1。

圖1 赭曲霉

注：1為分生孢子頭；2為瓶梗與?；?為分生孢子。

赭曲霉[11]菌落在查氏瓊脂培養(yǎng)基上25 ℃條件下生長相對較慢，7天直徑為25 mm，絲絨狀，淡黃褐色，分生孢子頭稠密，菌落反面無色；分生孢子頭球形，直徑100～170 μm，分生孢子梗生于基質，壁粗糙，壁厚0.7～2 μm；頂囊球形，直徑25～50 μm，表面全可育，產孢結構雙層，梗基7～15 μm×2～5 μm，瓶梗6～15 μm×2～3 μm；分生孢子多呈球形，直徑2.5～4 μm，光滑或稍粗糙。

3 討論

自然發(fā)酵的豆醬表面著生了大量與發(fā)酵相關的真菌類群，其中一部分具有α-淀粉酶活性，能水解淀粉產生葡萄糖、糊精、麥芽糖和低聚糖等；有的種類則產生蛋白酶，分解大豆蛋白為可被人體吸收、利用的小肽。本研究從眾多菌株中篩選出同時具有α-淀粉酶活性和蛋白酶活性的菌株GQ3-2。將其接種于查氏瓊脂中標準培養(yǎng)，經形態(tài)學鑒定，確定菌株GQ3-2為赭曲霉。赭曲霉是常見的曲霉屬真菌，具有很高的蛋白酶、脂肪酶[12]和果膠酶活性，但有的種類可產生赭曲霉毒素，這種毒素對動物和人類的毒性主要有腎臟毒、肝毒[13]、致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用。赭曲霉毒素A[14]進入體內在肝微粒體[15]混合功能氧化酶的作用下，轉化為4-羥基赭曲霉毒素A和8-羥基赭曲霉毒素A，其中以4-羥基赭曲霉毒素A為主。因此，從食品安全的角度，應對此類真菌發(fā)酵的豆醬樣品進行免疫親和柱與高效液相色譜法相結合的毒素檢測，以確定菌種安全及發(fā)酵豆醬的食品安全。

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Research on the Enzyme Activity and Morphology of Fermented Strain GQ3-2

WEN Si-qi, SUN Xiao-dong*, YANG Hong, JIAN Wen-dan, LU Meng-meng, GUO Ying

(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600,China)

Soybean paste is a traditional fermented food in China. There are so many fungi colonies on soybean brick surface. Some functional strains could hydrolyze starch and generate dextrin, glucose maltose and oligosaccharides; some functional strains could produce extracellular protease to decompose soybean protein into small peptide for absorption and utilization of human body. In this paper, 254 samples are collected from different places in northeast of China, using the method of 3,5-dinitrosalicylic acid to select 34 strains with higher α-amylase activity and using casein plate to select 35 strains with protein activity. In the selected strains, GQ3-2 is the one with α-amylase and protein activity simultaneously; GQ3-2 is identified asAspergillusochraceusthrough the standard cultivating and morphological authenticating

soybean paste; alpha-amylase activity; protease activity;Aspergillusochraceus

2016-07-24 *通訊作者

國家自然基金青年基金項目(31200014)；中央高校自主基金項目(DC201501012)；大連民族大學大學生創(chuàng)新訓練項目(S201512026065)

孫曉東(1979-)，女，山東掖縣人，工程師，博士，研究方向：真菌分類與真菌毒素的檢測。

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.003

1000-9973(2017)01-0010-03