抗蛇毒IgY對尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒主要活性的中和作用研究

劉錦花，李 恒，2, 和七一,張迎鋒,陳典成,羅 聰,余曉東

(1. 重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市動物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心,重慶 4000472.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021)

抗蛇毒IgY對尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒主要活性的中和作用研究

劉錦花1，李 恒1，2, 和七一1,張迎鋒1,陳典成1,羅 聰1,余曉東1

(1. 重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市動物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心,重慶 4000472.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021)

目的 評價抗尖吻蝮蛇(D．a(chǎn)cutus)毒IgY對該蛇毒主要活性的中和能力。方法 通過不同濃度IgY與該蛇毒混合孵育后，再用生化方法檢測該蛇毒的多種活性。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)表明，IgY能明顯地中和該蛇毒的PLA2、 5′-核苷酸酶、透明質(zhì)酸酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶(纖維蛋白酶)等酶活性；小鼠實(shí)驗(yàn)表明，IgY對小鼠的半有效保護(hù)劑量(ED50)為1 131.09 μg。結(jié)論 該抗尖吻蝮蛇毒IgY 具有很好的中和活性，且IgY無明顯的毒性。

抗尖吻蝮蛇毒 IgY; PLA2; 5′-核苷酸酶; 透明質(zhì)酸酶; 絲氨酸蛋白酶(纖維蛋白酶); 金屬蛋白酶; ED50; 中和作用

尖吻蝮蛇(Deinagkistrodonacutus)，又俗稱五步蛇，是我國獨(dú)有的蛇種，其每年咬傷率在我國十大毒蛇中是較高的。其毒液主要由功能多樣化的各種多肽或蛋白質(zhì)(包括磷脂酶A2、5′-核苷酸酶、透明質(zhì)酸酶、金屬蛋白水解酶、絲氨酸蛋白水解酶等) 構(gòu)成，并主要作用于血液系統(tǒng)，致使患者發(fā)病，或因搶救不及時或不當(dāng)而致殘甚至死亡，故其毒液屬于典型的血液毒素[1-3]。

目前，雖然抗蛇毒血清是治療毒蛇咬傷的首選有效藥物，但是，它存在諸多不足，包括臨床使用中出現(xiàn)的副作用(過敏性休克、致熱反應(yīng)及血清病等)，以及其生產(chǎn)周期長、純化成本高與價格昂貴、不易保存等缺點(diǎn)[4]。為此，尋找價格便宜、方便使用、保存容易及安全性好的治療蛇傷的藥物是非常必要而迫切的。

已有研究表明，用各種抗原(如致病原)免疫雞產(chǎn)生的卵黃抗體(即IgY)具有很高的效價，而且擁有毒副作用低、生產(chǎn)成本低、使用方便等優(yōu)勢[4-5]。近年來，國內(nèi)外開展了用蛇毒(包括響尾蛇、圓斑蝰、眼鏡蛇、眼鏡王蛇、鋸鱗蝰、銀環(huán)蛇、珊瑚蛇)免疫雞的實(shí)驗(yàn)研究，并從其蛋黃制備出效價高的IgY[6-8]，但是，至今這些IgY還未在臨床上使用。我們已經(jīng)首次用我國特有的尖吻蝮蛇毒來免疫雞，從其卵黃中制備和分離純化得到了抗尖吻蝮蛇毒的抗體IgY。本研究就該IgY對尖吻蝮蛇毒中的主要活性成分的中和作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究與評估，為下一步開發(fā)IgY成為抗蛇毒藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備 Infinite ?200Pro多功能酶標(biāo)儀(Tecan)；恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；TG16-W微量高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；冰箱(SIEMENS)；電磁爐(SUPOR)。

1.2 主要材料與試劑 抗尖吻蝮蛇毒IgY(本實(shí)驗(yàn)室自備)；尖吻蝮蛇毒(本實(shí)驗(yàn)室保存)；18 g～20 g健康的昆明種♀鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)；未免雞蛋；5′-核苷酸酶活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；透明質(zhì)酸鈉(上海伊卡生物)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，廈門市先端科技)；牛血纖維蛋白原(瑞楚生物)；瓊脂糖(Invitrogen)；三氯乙酸(成都科龍化工)；鹽酸(重慶川東化工)；Folin試劑(北京鼎國昌盛技術(shù)責(zé)任有限公司)；乙醚(揚(yáng)州三和化工)；醋酸(成都科龍化工)；Tris(genview)；酪蛋白(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；NaOH(北京紅星化工)；醋酸鈉、CaCl2(重慶博藝化學(xué)試劑)。

1.3 方法

1.3.1 IgY中和蛇毒PLA2活性實(shí)驗(yàn) 蛇毒PLA2活性測定按照Habermann等瓊脂糖平板法進(jìn)行[9]。在平板每孔中分別加入相同體積(10 μL)不同濃度的蛇毒(0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 7 g·L-1)，37 ℃孵育24 h后，測量透明圈直徑。以生理鹽水為陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取直徑11 cm的透明圈所作對應(yīng)的蛇毒濃度作為IgY中和實(shí)驗(yàn)的蛇毒基礎(chǔ)濃度。分別將不同濃度的抗尖吻蝮蛇毒 IgY (0、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75、0.85、0.95 g·L-1)與以上所選蛇毒濃度混合(總體積10 μL)。37 ℃下水浴 45 min , 再離心5 min(1 737×g)，取上清液加入平板孔中， 37 ℃孵育24 h后，測量透明圈直徑。以生理鹽水為陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 IgY中和蛇毒5′-核苷酸酶活性 按照廠家試劑盒說明書測定不同濃度(0、0.01 、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g·L-1)的尖吻蝮蛇毒中的5′-核苷酸酶活性，選取其中酶活力最強(qiáng)的蛇毒濃度作為IgY中和能力測定的蛇毒基礎(chǔ)濃度，再將其與不同濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、3 g·L-1) 的IgY混和孵育(37 ℃)45 min，再離心5 min(1 737×g)，取上清液進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 IgY中和蛇毒透明質(zhì)酸酶活性 按照Singer等[10-11]方法進(jìn)行。在平板每孔中分別加入等體積(10 μL)不同濃度(0、0.5、1、2、3、4、6、8、10 g·L-1)的蛇毒，37 ℃孵育12 h后，再加入0.75%的CTAB溶液，反應(yīng)1 h后，倒掉CTAB溶液。再將平板孵育12 h(4 ℃)，測透明圈直徑。用生理鹽水為陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取直徑11 cm的透明圈所對應(yīng)的蛇毒濃度作為IgY中和實(shí)驗(yàn)的蛇毒基礎(chǔ)濃度。分別將不同濃度的(0、5、10、15、30、45、60、75、90、105 g·L-1)IgY與所選濃度的蛇毒混合(總體積10 μL)，37 ℃水浴45 min, 再離心5 min(1 737×g)。取上清液再進(jìn)行透明質(zhì)酸酶酶活性實(shí)驗(yàn)。以生理鹽水為陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 IgY中和蛇毒蛋白水解酶活性實(shí)驗(yàn) 按照Molander 等[12]方法進(jìn)行。將等體積(10 μL)不同濃度(0、0.1、0.5、1、2、4、6 g·L-1)的尖吻蝮蛇毒溶液分別與30 μL 1.0%的酪蛋白溶液混合， 37 ℃水浴40 min后，分別加入90 μL 0.44 mol·L-1三氯乙酸，終止反應(yīng)，再離心5 min(1 737×g)，取50 μL上清液至96孔板中。再加入50 μL以1 ∶4稀釋的Folin試劑及250 μL 0.4 mol·L-1碳酸鈉溶液，混勻。溶液變藍(lán)，室溫放置20 min后，雙蒸水調(diào)零，于630 nm讀取吸光值。選取較高吸光度所對應(yīng)的尖吻蝮蛇毒劑量作為IgY中和實(shí)驗(yàn)的蛇毒基礎(chǔ)用量。分別將不同量的IgY (0、37.5、75、150、225、250) g·L-1與該蛇毒混合， 37 ℃水浴45 min后, 再離心5 min(1 737×g)，取30 μL上清液進(jìn)行蛋白水解酶活性測定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 IgY中和蛇毒纖維蛋白水解活性 按照Astrup等[13]纖維蛋白平板法進(jìn)行 。在平板每孔中分別加入等體積(15 μL)不同濃度(1.33、2.66、4.00、5.33、6.66 g·L-1)的蛇毒，37 ℃孵育12 h后，測量透明圈環(huán)直徑。以生理鹽水為陰性對照組。選取能產(chǎn)生直徑為11 cm的透明圈所對應(yīng)的蛇毒量作為IgY中和實(shí)驗(yàn)的蛇毒基礎(chǔ)用量。分別將15 μL不同濃度(0、60、80、100、120、140 g·L-1)的IgY與該蛇毒基礎(chǔ)用量混合， 37 ℃水浴45 min后, 再離心5 min(1 737×g)，取上清液進(jìn)行纖維蛋白水解活性測定。以生理鹽水為陰性對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 IgY中和蛇毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 按照Paul等[14]所述法，取健康的昆明♀鼠( 18～20 g)，隨機(jī)分成7組，每組10只。100 μL不同濃度的IgY(0、2、4、8、16、32、64 g·L-1)與一定劑量(3×LD50，LD50=0.00 293 mg·g-1)的尖吻蝮蛇毒混合, 37 ℃下水浴45 min后, 再離心5 min(1 737×g)，取上清液進(jìn)行腹腔注射，24 h后記錄小鼠存活情況。

1.3.7 統(tǒng)計分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(計量資料)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，進(jìn)行線性回歸。

2 結(jié)果

Fig 1 Neutralization of anti-D. acutus venom IgY against activity of PLA2 in snake venom

As demonstrated by the highr2value, IgY dose-dependently decreases the area of transparent circle cased by PLA2hydrolyzing the substrate

Fig 2 Neutralization of anti-D. acutus venom IgY against 5′-nucleotidase activity in snake venom

The activity of 5′ nucleotidase amongD． acutus vemon decreased with the increase of specific IgY dose . It almost completely neutralized the activity of 5′ nucleotidase when Specific IgY up to 300 μg.

Fig 3 Neutralization of anti-D. acutus venom IgY against hyaluronidase in snake venom

IgY dose-dependently decreased the area of transparent circle caused by hyaluronidase hydrolyzing sodium hyaluronate, which had remarkable linear correlation.

2.4 IgY對蛇毒金屬蛋白水解酶活性的中和作用 不同量的尖吻蝮蛇毒的蛋白水解酶活性與吸光度值呈量效關(guān)系，但無線性相關(guān)性。選取與陰性對照表現(xiàn)出明顯的吸光度差異的蛇毒濃度(1 g·L-1)作為基礎(chǔ)濃度。中和實(shí)驗(yàn)表明，IgY在0～250 g·L-1之間隨著濃度增加，蛇毒蛋白水解酶活性降低，IgY濃度與蛇毒蛋白水解酶活力降低之間呈現(xiàn)量效關(guān)系。10 μg尖吻蝮蛇毒的蛋白水解酶活性幾乎可被250 g·L-1IgY完全中和，而IgY自身無蛋白水解酶活性(Fig 4)。

Fig 4 Neutralization of anti-D. acutus venom IgY against metalloprotease in snake venom

IgY dose-dependently decreased the absorbance value of the solution spectrophotometrically monitored at λ=630 nm. As demonstrated by the dose-effect relationship, it showed that the activity of protease of 10 μg venom was almost totally inhibited by 5 000 ug specific IgY.

Fig 5 Neutralization of anti-D. acutus venom IgY against serine proteinase ( fibrinogenase) in snake venom

IgY dose-dependently decreases the relative area hydrolyzing fibrinogen from bovine plasma. It showed linearity in the area of transparent circle for the range of IgY. The ED50value was calculated as described in methods section.

2.6 保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 采用蛇毒挑戰(zhàn)劑量(3×LD50, LD50=2.93 mg·kg-1)進(jìn)行IgY的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 1。 采用WHO推薦的方法[15]，最后計算出IgY對小鼠的半有效保護(hù)劑量(ED50)為1 131.09 μg。

Tab 1 Records of mouse death in IgY’s protection experiments

3 討論

采用現(xiàn)代轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法的匹配，人們對尖吻蝮蛇毒腺細(xì)胞的毒素基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜和毒液蛋白質(zhì)組進(jìn)行了較多分析研究，目前基本搞清了尖吻蝮蛇毒中的蛋白質(zhì)組分構(gòu)成情況[16]。尖吻蝮蛇毒發(fā)揮致傷致毒的主要活性成分包括PLA2、5′-核苷酸酶、透明質(zhì)酸酶、金屬蛋白水解酶、絲氨酸蛋白水解酶等，它們在毒理上主要扮演血液毒素和肌肉毒素的作用，給毒蛇咬傷患者帶來致傷甚或致死的效應(yīng)[1-3 ]。

實(shí)驗(yàn)表明，抗尖吻蝮蛇毒IgY能顯著地中和該蛇毒主要活性成分的活性。IgY中和PLA2活性呈現(xiàn)量效關(guān)系，其ED50為4.568 μg；IgY中和5′-核苷酸酶活性呈現(xiàn)量效關(guān)系，而且當(dāng)IgY達(dá)到300 μg，蛇毒5′-核苷酸酶活力幾乎完全被中和；IgY中和透明質(zhì)酸酶活性呈現(xiàn)量效關(guān)系，其ED50為276.57 μg；IgY中和金屬蛋白水解酶活性呈現(xiàn)量效關(guān)系(Fig 4)；IgY中和絲氨酸蛋白水解酶(如纖維蛋白水解酶)活性呈現(xiàn)量效關(guān)系，其ED50為1 045 μg；這些結(jié)果表明IgY完全能中和尖吻蝮蛇毒中的血液毒素(5′-核苷酸酶、金屬蛋白水解酶、透明質(zhì)酸酶和絲氨酸蛋白水解酶)和肌肉毒素(PLA2)的活性，從而阻止這些毒素引起尖吻蝮蛇咬傷患者的血液系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)紊亂。采用小白鼠活體保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，IgY的保護(hù)效果非常好，自身沒有毒性，其半有效保護(hù)劑量(ED50)為1 131.09 μg。

當(dāng)前，我國治療尖吻蝮蛇咬傷的主要藥物仍是通過蛇毒免疫馬而制備出的抗蛇毒血清。由于抗蛇毒血清自身存在較多不足，再加之制備成本高，使用價格昂貴，而我國的實(shí)際情況是被毒蛇咬傷的患者一般是邊遠(yuǎn)山區(qū)的貧窮村民，他們很難承擔(dān)使用該抗蛇毒血清的費(fèi)用。因此，本研究首次采用尖吻蝮蛇毒免疫雞來制備抗尖吻蝮蛇毒的抗體即IgY, 不僅大大降低了IgY制備成本，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗尖吻蝮蛇毒IgY對該蛇毒活性的中和能力非常理想，這些結(jié)果為開發(fā)抗尖吻蝮蛇毒IgY藥物提供了前期基礎(chǔ)。

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Neutralization of anti-venom IgY against main activities of Deinagkistrodon acutus venom

LIU Jin-hua1, LI Heng1,2, HE Qi-yi1, ZHANG Ying-feng1, CHEN Dian-cheng1, LUO Cong1, YU Xiao-dong1

(1.SchoolofBiologicalScience,ChongqingNormalUniversity,ChongqingKeyLaboratoryofAnimalBiology,ChongqingEngineeringCenterofBioactiveSubstance,Chongqing400047,China; 2.InstituteofForensicScience,CriminalPoliceCropsofChongqingPublicSecurityBureau,Chongqing400021,China)

Aim To evaluate the potency of anti-D.acutusvenom IgY neutralizing the main activities ofD.acutusvenom. Methods After mixing the different amounts of IgY with snake venom and incubating together, the main activities of snake venom were assayed by biochemical methods. Results Theinvitroassays indicated that anti-D.acutusvenom IgY obviously neutralized the activities of PLA2, 5′-nucleotidase, hyaluronidase, metalloprotease and serine proteinase (fibrinogenase) inD.acutusvenom. Mouse experiments showed that the ED50value of IgY for mouse was 1 131.09 μg. Conclusion Anti-D.acutusvenom IgY antibodies have good effects in neutralizingD.acutusvenom without the toxicities themselves.

anti-D.acutusvemon IgY; PLA2; 5′-nucleotidase; hyaluronidase; Serine proteinase (fibrinogenase); metalloprotease; ED50Neutralization

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.022.html

2016-08-29,

2016-11-30

重慶市林業(yè)局渝林科研項目(No 2015-5);重慶市自然科學(xué)基金(No CSTC2016jacyjA0224、CSTC2015shmszx)

劉錦花(1992- )，女，碩士，研究方向：生物毒素與藥物開發(fā)，E-mail:491449569@qq.cm； 余曉東(1964- )，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物毒素與藥物開發(fā)，通訊作者，Tel:023-65307142, E-mail: yxd@cqnu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.011

A

1001-1978(2017)01-0058-05

R-332；R392.11；R977.3；R996.3