新型锍類化合物的合成及其DNA復(fù)合性能

吳春陽, 吳晨悅, 張 瑩, 余麗蕓, 李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

·研究論文·

新型锍類化合物的合成及其DNA復(fù)合性能

吳春陽, 吳晨悅, 張 瑩, 余麗蕓, 李 婧*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

報(bào)道了一類新型的以锍離子提供正電荷的陽離子脂質(zhì)體的合成。以四氫噻吩和四氫噻喃為原料，在四氟硼酸銀體系中與鏈狀碘代脂肪烷烴經(jīng)取代反應(yīng)制得硫正離子化合物，產(chǎn)物用氯離子交換樹脂交換得陰離子為氯離子的8種新型的鏈狀锍類鎓氯鹽脂質(zhì)體化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR, FT-IR和HR-MS(ESI)表征。凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)表明該類锍化合物具有和DNA聚合并形成復(fù)合物的能力，隨著脂肪鏈的增長，復(fù)合能力增強(qiáng)。

四氫噻吩; 四氫噻喃; 碘代烷; 锍類化合物; 陽離子脂質(zhì)體; DNA復(fù)合物; 合成; DNA復(fù)合性能

陽離子脂質(zhì)體作為非病毒載體被廣泛應(yīng)用于基因療法的研究中，其易于制備、可自然降解和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)使其成為最有發(fā)展前景的載體[1-4]。已報(bào)道的陽離子脂質(zhì)體多數(shù)建立在可質(zhì)子化的氮原子基礎(chǔ)上，包含疏水長鏈和季銨鹽陽離子頭部。常用的基團(tuán)有一級胺、二級胺、三級胺、大環(huán)多胺、咪唑及脒等[5-7]，脂質(zhì)體碳鏈的長度為C8～C16，隨著碳鏈增長，對DNA的鍵合能力增強(qiáng)。如溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基銨(DOTAP)是常用的脂質(zhì)體載體，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是基因轉(zhuǎn)染的輔助脂質(zhì)，溴化三甲基十六烷基銨(CTAB)，能溶解細(xì)胞膜，被用作陽離子洗滌劑[8-9]。帶有正電荷的锍類化合物在分子設(shè)計(jì)中日益受到研究人員的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道Salacino及其同類物具有治療II型糖尿病的潛力[10-11]；生物體內(nèi)的S-腺苷甲硫氨酸以及S-甲基蛋氨酸是生物相關(guān)的锍類化合物；锍類化合物用于模擬糖基轉(zhuǎn)移中的羰基碳鎓過渡態(tài)[12]。對锍類化合物功能的研究逐漸擴(kuò)展開來，然而利用其正電性在復(fù)合DNA，以及作為基因載體的研究還未有報(bào)道。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BrukerAscend 600M AVANCEⅢ HD型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Thermo Nanodrop 2000C型分光光度計(jì)；NICOLET 380型紅外光譜儀(KBr壓片)；Thermo Finnigan型質(zhì)譜儀；Univeral Hood II型凝膠成像儀；Power PacTMUniversal Power Supply型電泳儀。

四氫呋喃和1-碘十六烷，Alfa Aesar公司；四氫噻吩，阿拉丁公司；四氟硼酸銀，百靈威公司；碘代正丁烷，Macklin公司；1-碘壬烷和1-碘十二烷，TCI公司；二氯甲烷、甲醇和乙腈，分析純，泉瑞試劑;薄層層析硅膠板(GF254)，青島裕民源硅膠廠；柱層析硅膠(100～200目)，國藥集團(tuán)；溴化鉀窗片(Φ25×4)，天津博天勝達(dá)公司；瓊脂糖，Biowest Agarose公司；溴化乙錠，TRIS·HCl和Agar， Biotoped 公司；Na2EDTA·12H2O， Sigma公司；胰蛋白胨、酵母粉和NaCl， Oxoid公司；卡那霉素，Biosharp公司；DH-5α， TIANGEN公司；質(zhì)粒gWiz-GFP， Aldevron公司；EndoFree Plasmid mega kit, Qiagen公司；λ DNA/EcoR I+Hind III Markers 3， Fermentas公司。

1.2 合成

(1) 3和5的合成通法

將四氫噻吩或四氫噻喃5 mmol溶于無水乙腈(3 mL)中，依次加入1 5 mmol和四氟硼酸銀0.974 g (5 mmol)，用鋁箔包裹避光，置于油浴中升溫至65 ℃冷凝回流，反應(yīng)24 h(TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完全)。減壓蒸除溶劑，加入甲醇5 mL和離子交換大孔樹脂(Cl-交換)50 mg，攪拌2 h，過濾，濾液減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(甲醇)∶V(二氯甲烷)]純化得3和5。

S-正丁烷基-四氫噻吩鎓氯鹽(3a): A=1 ∶49,黃色粉末，產(chǎn)率52%,Rf= 0.37;1H NMRδ: 3.65(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.40(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.23(t,J=7.6 Hz, 2H, SCH2), 2.43(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.6 Hz, 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.52(tq,J=7.3 Hz, 7.6 Hz, 2H, CH2), 0.99(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.24(2C), 42.08, 28.55(2C), 27.27, 21.52, 13.40; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H17S{[M-Cl-]+}145.288 6, found 145.288 7。

S-壬烷基-四氫噻吩鎓氯鹽(3b): A=1 ∶19,白色粉末,產(chǎn)率96%,Rf=0.32;1H NMRδ: 3.66(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.39(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.20 (t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.41(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.47(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.25(m, 10H, 5CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMR(150 MHz)δ: 43.24(2C), 42.22, 31.83, 29.24, 29.14, 28.97, 28.39, 24.08(2C), 22.63, 22.47, 22.52, 14.09; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H27S{[M-Cl-]+}215.421 5, found 215.421 6。

S-十二烷基-四氫噻吩鎓氯鹽(3c): A=1 ∶19，白色粉末，產(chǎn)率83%，Rf=0.61;1H NMRδ: 3.66(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.39(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.20(t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.41(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J= 7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.25(m, 16H, 8CH2), 0.97(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.25(2C), 42.33, 31.93, 29.64(2C), 29.54, 29.37, 29.33, 29.05, 28.54(2C), 28.30, 25.46, 22.71, 14.15; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H33S{[M-Cl-]+}257.501 2, found 257.501 0。

S-十六烷基-四氫噻吩鎓氯鹽(3d): A=1 ∶13，白色粉末，產(chǎn)率85%，Rf=0.62;1H NMRδ: 3.65(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.40(dt,J=5.72 Hz, 12.8 Hz, 2H, SCH2), 3.21(t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.42(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.47(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.26(m, 24H, 12CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.24(2C), 42.30, 31.94, 29.73(3C), 29.70, 29.69, 29.66, 29.56, 29.38, 29.34, 29.06, 28.53, 28.2, 25.44, 22.71, 14.14; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H41S{[M-Cl-]+}313.607 5, found 313.607 7。

1.3 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

(1) 質(zhì)粒擴(kuò)增

質(zhì)粒gWiz-GFP含有5757 bp，在感受態(tài)DH-5α大腸桿菌細(xì)胞(E.coli)按照TIANGEN感受態(tài)細(xì)胞操作步驟重組質(zhì)粒與大腸桿菌。將重組后的E.coli在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，將生長好的菌液于10 000 r·min-1離心30 min，棄去上清液，所得菌體按照Qiagen EndoFree Plasmid Kit試劑盒操作步驟提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用TE溶解，用Nano drop測定質(zhì)粒濃度，于-20 ℃保存，待用。

(2) 陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備

將合成的8種硫陽離子化合物分別用甲醇配制成濃度為7.7 nmol·μL-1和30.8 nmol·μL-1的溶液待用。將質(zhì)粒gWiz-GFP配制成0.2 ug·μL-1的水溶液待用。

取不同量的陽離子脂質(zhì)體溶液7.7 nmol·μL-1(0.3 μL， 1.0 μL， 3.4 μL)， 30.8 nmol·μL-1(1.1 μL， 1.6 μL， 2.7 μL， 3.0 μL)分別與0.2 ug·μL-1的DNA溶液3.0 μL混合，渦旋震蕩10 s后于室溫下放置15 min，得到硫磷比(S/P)分別為1/1， 9/1， 14/1， 18/1， 27/1， 45/1， 50/1的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。

(3) 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

稱取0.35 g瓊脂糖于100 mL燒杯中，加入35 mL三羥甲基氨基甲烷醋酸緩沖液(TAE)，配制成1%的瓊脂糖凝膠。加熱使瓊脂糖完全融化，在室溫下冷卻至60 ℃，加入0.3 μL溴化乙錠(EB， 1 mg·mL-1)，搖勻后倒入有機(jī)玻璃槽中，插好梳子，待凝膠完全凝固后，取下梳子，將制好的凝膠放入電泳槽中。

將0.2 ug·μL-1的DNA(3.0 μL)和配置好的陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，與相應(yīng)體積的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPE)緩沖溶液(5 mmol·L-1, pH為7.5)混合，形成總體積為8.0 μL樣品，其中裸DNA為參照樣品。將樣品分別加入2.0 uL的溴酚藍(lán)緩沖液，然后加到瓊脂糖凝膠的孔中，在120 V電壓下電泳20 min。最終使用凝膠成像儀對DNA在凝膠中的遷移進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

本實(shí)驗(yàn)選用四氫噻吩、四氫噻喃為原料，通過SN2反應(yīng)與碘代烷取代，合成含有正電荷的锍類化合物，產(chǎn)物通過氯離子交換樹脂，使锍化合物結(jié)合氯離子為陰離子對照離子。

2.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒中電負(fù)性的磷酸根會使核酸在瓊脂糖凝膠電場中向著正極方向移動，與陽離子脂質(zhì)體復(fù)合后，電負(fù)性減弱，在凝膠電泳中移動減弱或阻滯。實(shí)驗(yàn)用瓊脂糖凝膠電泳表征硫離子脂質(zhì)體與DNA的結(jié)合能力。圖1為四氫噻吩和四氫噻喃衍生物與gWiz-GFP復(fù)合后的凝膠電泳圖。

圖1 锍化合物與gWiz-GFP以不同比例復(fù)合后的阻滯實(shí)驗(yàn)的凝膠電泳圖*

*a：S-丁烷基-四氫噻吩鎓氯鹽；b：S-壬烷基-四氫噻吩鎓氯鹽；c：S-十二烷基-四氫噻吩鎓氯鹽；d：S-十六烷基-四氫噻吩鎓氯鹽；e：S-丁烷基-四氫噻喃鎓氯鹽；f：S-壬烷基-四氫噻喃鎓氯鹽；g：S-十二烷基-四氫噻喃鎓氯鹽；h：S-十六烷基-四氫噻喃鎓氯鹽。M為Marker，1為裸DNA， 2～8為脂質(zhì)體與gWiz-GFP混合物，比例分別為1/1， 9/1， 14/1， 18/1， 27/1， 45/1， 50/1。

由圖1可以看出，S-丁烷基-四氫噻吩鎓氯鹽(圖1a)和S-丁烷基-四氫噻喃鎓氯鹽(圖1e)與DNA沒有顯示結(jié)合能力，質(zhì)粒顯示為游離質(zhì)粒；其他脂質(zhì)體化合物與DNA能形成復(fù)合物，且每個化合物隨著脂質(zhì)體/DNA比例增大，與脂質(zhì)體結(jié)合的DNA增加，延滯現(xiàn)象明顯增強(qiáng)。

脂鏈的長度對DNA的復(fù)合能力影響較大，碳鏈增長，與DNA復(fù)合能力增強(qiáng)、需要的摩爾比逐漸縮小。最短的丁基化合物沒有顯現(xiàn)復(fù)合能力，壬烷基在45 ∶1時開始表現(xiàn)復(fù)合能力，十二烷基符合能力較強(qiáng)，在14 ∶1時表現(xiàn)復(fù)合能力，十六烷基的復(fù)合能力較弱，主要原因是十六烷基的疏水性降低化合物的溶解度，在化合物加入到DNA水溶液中時，部分十六烷基化合物沉降析出，因此無法有效復(fù)合DNA。

比較四氫噻吩環(huán)和四氫噻喃環(huán)對DNA的復(fù)合能力，從圖1中顯示五元環(huán)和六元環(huán)沒有明顯差別。

首次合成以硫正離子為主體的陽離子脂質(zhì)體，用于復(fù)合DNA?；衔锏暮铣蛇x用四氫噻吩和四氫噻喃與不同碳鏈的碘代物反應(yīng)制備，反應(yīng)直接、產(chǎn)率較高。用凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)初步表征，該類化合物能有效復(fù)合DNA，四氫噻吩環(huán)和四氫噻喃環(huán)對復(fù)合能力影響不大，碳鏈的長度對復(fù)合能力影響明顯，碳鏈越長，復(fù)合能力越強(qiáng)。以硫正離子來構(gòu)建陽離子脂質(zhì)體，用于DNA復(fù)合，可以用于基因轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)測試即將開展。

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Synthesis and DNA Condensing Properties of Novel Sulfonium Compounds

WU Chun-yang, WU Chen-yue, ZHANG Ying, YU Li-yun, LI Jing*

(College of Life Science and Biotechnology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

A new type of cationic lipid composed with sulfonium as the positive charge was reported. The sulfonium compounds were synthesized starting from tetrahedrothiophene and tetrahedrothiopyran by reaction with lipid iodides in the presence of silver tetrafluoro borate. The products were treated with chloro type anion exchange resin to give eight novel sulfonium chloride compounds. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR, FT-IR and HR-MS(ESI). Gel retardation experiments showed that the sulfonium compounds can condense DNA and form the lipopolyplex effectively. The results revealed that compound with longer lipid chain have stronger condensing effect.

tetrahedrothiophene; tetrahedrothiopyran; lipid iodide; sulfonium compound; cationic lipid; DNA complex; synthesis； DNA condensing property

2016-10-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400660)； 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2011310028)

吳春陽(1991-)，女，漢族，黑龍江大慶人，碩士研究生，主要從事分子合成及藥物研究。 E-mail: anjingyang@outlook.com

李婧，副教授， E-mail: lijingroea@sina.com.cn

O624.7; O622.7

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.01.16267