父方年齡及精子來源對ICSI周期臨床結局的影響

倪曉蓓，王珊珊，徐志鵬，陳林君，張寧媛，孫海翔

(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，南京 210008)

父方年齡及精子來源對ICSI周期臨床結局的影響

倪曉蓓，王珊珊，徐志鵬，陳林君，張寧媛，孫海翔*

(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，南京 210008)

目的 分析ICSI周期中父方年齡及精子來源與臨床結局的關系。 方法 回顧性分析2012年1月至2015年12月在本中心進行ICSI且女方年齡在30～34歲的患者，總例數(shù)為489例。將患者按是否臨床妊娠分組，分析父方年齡(<30歲、30～40歲、>40歲)和精子來源(精液精子、附睪精子、睪丸精子)對于臨床妊娠結局的影響。 結果 臨床妊娠組有348例，未臨床妊娠組有141例；臨床妊娠組與未妊娠組一般情況如女方年齡、基礎FSH、體重指數(shù)、內膜厚度、可利用胚胎率等均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；以是否臨床妊娠作為因變量，精子來源和父方年齡作為自變量，進行回歸分析，結果顯示精子來源與臨床妊娠無統(tǒng)計學相關性(P>0.05)，而父方年齡與臨床妊娠相關(P<0.05)；不同父方年齡組的一般情況均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而隨著父方年齡的增長，種植率和臨床妊娠率呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(P<0.05)。 結論 在ICSI周期中，隨著父方年齡的增長，ICSI的臨床妊娠率下降，而精子來源并不影響臨床結局。

ICSI； 父方年齡； 精子來源； 臨床妊娠率

(JReprodMed2017，26(1)：29-33)

卵胞漿內單精子注射(ICSI)不同于常規(guī)的體外受精，主要適用于嚴重的少弱畸精子癥患者、不可逆的梗阻性無精子患者、排除遺傳缺陷疾病所致生精功能障礙患者、免疫性不孕、常規(guī)體外受精失敗、精子頂體異?；蛐栊兄踩肭芭咛ミz傳學檢查的患者，它通過有創(chuàng)的手段將人為挑選的精子注入卵母細胞，規(guī)避了自然受精過程中卵母細胞對精子的選擇[1]。實施ICSI 的原因、精子來源、處理過程等情況各不相同，因而其術后的受精狀況、胚胎發(fā)育、妊娠結局等受多方面因素的影響[2-3]。接受ICSI周期治療的患者精液來源通常有3種：精液精子、附睪精子和睪丸精子，那么究竟何種來源的精子有更好的臨床結局呢？目前還存在爭議[4-6]。母源性因素與輔助生殖技術的相關性已廣泛達成共識，而父源性因素比如父親年齡等對臨床結局的影響還有待進一步研究。本文旨在探尋精子來源、父方年齡與ICSI結局的相關性，以期為臨床實踐提供有效的參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2012年1月至2015年12月在本院生殖醫(yī)學中心行ICSI周期的患者。

納入/排除標準：在本中心行 ICSI 助孕，女方年齡30～34歲且為常規(guī)促排新鮮周期移植分裂胚者；夫妻雙方染色體核型分析正常；排除中重度子宮內膜異位癥、子宮畸形、子宮多發(fā)性息肉患者。

共納入489例病例。根據(jù)臨床妊娠與否分組，分析男方年齡(<30歲、30～40歲、>40歲)和精子來源(精液精子、附睪精子、睪丸精子)對ICSI周期臨床結局的影響。

二、治療回顧

1促排卵治療：用本中心常規(guī)促排卵方案進行卵巢刺激，B超監(jiān)測卵泡生長發(fā)育，待主導卵泡直徑達18～20 mm當晚注射HCG 250 μg(默克雪蘭諾，德國)或HCG 10 000 U (麗珠制藥)，間隔 36 h左右在B超引導下嚴格按照無菌要求穿刺取卵。

2.精液處理：(1)精液精子：密度梯度離心后用RINSE(Vitrolife，瑞典)洗滌，IVF(Vitrolife，瑞典)上游備用；(2)附睪精子：將抽吸的附睪液用RINSE(Vitrolife，瑞典)洗滌，離心取沉渣涂皿備用；(3)睪丸精子：在顯微鏡下將睪丸組織的曲精小管分離研磨，用RINSE(Vitrolife，瑞典)洗滌，離心取沉渣涂皿備用。

3.ICSI：按本中心方案[7]。將卵丘卵母細胞復合物經(jīng)培養(yǎng)液充分洗滌后置 IVF序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中預培養(yǎng)3 h，然后用透明質酸酶消化顆粒細胞，將去除顆粒細胞的卵母細胞置IVF培養(yǎng)液中預培養(yǎng)1 h，精子制動后行ICSI術。

4.受精/卵裂的觀察和移植胚胎的篩選：受精后置于G1序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)，16～18 h觀察原核形成；取卵后48 h觀察卵裂情況，于72 h選擇優(yōu)質胚胎移植。

5.妊娠結局判定：胚胎移植后14 d檢測血HCG陽性，4～6周B超檢查見孕囊視為臨床妊娠。

三、觀察指標

患者一般資料包括年齡、體重指數(shù)、基礎內分泌水平、移植日內膜厚度；

ICSI相關指標及妊娠結局：可利用胚胎率(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/總胚胎數(shù)、植入率(植入胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù))、臨床妊娠率(臨床妊娠人數(shù)/移植人數(shù))、多胎率(臨床多胎妊娠人數(shù)/臨床妊娠人數(shù))、流產(chǎn)率(流產(chǎn)人數(shù)/臨床妊娠人數(shù))、異位妊娠率(異位妊娠人數(shù)/臨床妊娠人數(shù))。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般資料

將患者按是否臨床妊娠分為兩組，其中未臨床妊娠組有141例，臨床妊娠組有348例。兩組患者一般情況如女方年齡、基礎FSH、體重指數(shù)、內膜厚度、可利用胚胎率等均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

組別例數(shù)女方年齡(歲)基礎FSH(U/L)體重指數(shù)(kg/m2)內膜厚度(mm)可利用胚胎率(%)未臨床妊娠組1413199±121700±1972250±3411101±2094703臨床妊娠組3483179±135732±2492242±2941127±2024674

二、精子來源、父方年齡與臨床妊娠的關系

以是否臨床妊娠作為因變量，精子來源(精液精子、附睪精子和睪丸精子)和父方年齡(<30歲、30～40歲、>40歲)作為自變量，進行回歸分析。結果顯示，精子來源與臨床妊娠無統(tǒng)計學相關性(P>0.05)，而父方年齡與臨床妊娠相關(P<0.05)(表2)。

三、不同父方年齡移植組患者一般資料與臨床妊娠結局比較

1.不同父方年齡組的一般資料比較：回歸分析顯示了父方年齡與臨床妊娠結局相關(P<0.05)，為了排除這種關聯(lián)是由于不同父方年齡組的的基礎值差異所致，因此按父方年齡分組作了患者一般資料對比，發(fā)現(xiàn)不同父方年齡組的一般資料均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)，說明父方年齡與臨床妊娠結局的確存在相關性。

2.不同父方年齡組的臨床結局指標比較：隨著父方年齡的增長，種植率和臨床妊娠率呈現(xiàn)下降的趨勢(P<0.05)(表4)。

表2 精子來源、父方年齡對ICSI周期臨床妊娠影響的Logistic分析

相關因素BSEWalsdfPExp(B)EXP(B)的95%CI下限上限精子來源-01770126197110160083806551073父方年齡06060247602210014183411302976

父方年齡組例數(shù)女方年齡(歲)基礎FSH(U/L)體重指數(shù)(kg/m2)內膜厚度(mm)可利用胚胎率(%)<30歲703119±109735±1762265±3451144±170456230～40歲3943191±131717±2462249±3051114±2064718>40歲253264±125784±2002110±2151144±2594722

表4 不同父方年齡組患者臨床妊娠結局比較[n(%)]

父方年齡組例數(shù)植入率?臨床妊娠率?多胎率流產(chǎn)率異位妊娠率<30歲7082/139(5900)58/70(8286)24/58(4138)4/58(690)1/58(172)30～40歲394377/763(4941)275/394(6980)103/275(3745)28/275(1018)5/275(182)>40歲2519/47(4043)15/25(6000)8/15(5333)0/15(0)0/15(0)

注：不同年齡組間比較，*P<0.05

討 論

ICSI技術的誕生是輔助生殖技術領域的里程碑[1， 8]，該技術利用精液精子、附睪精子或睪丸精子使成熟卵母細胞正常受精、形成優(yōu)質胚胎并獲得臨床妊娠和分娩。精子的質量與卵母細胞的受精、早期胚胎發(fā)育及后期的發(fā)育潛能密切相關，而不同來源的精子其成熟度、形態(tài)、質量等存在差異，那么究竟何種來源的精子有更好的臨床結局呢？男性生殖力是否隨著年齡增加而降低？現(xiàn)有的文獻報道還存有爭議，值得進一步研究。

有文獻提示男性的Leydig細胞(主要生成睪酮的細胞)功能呈年齡相關性[9-10]，在30歲時開始衰減[11]，同時伴有其他生殖相關的功能障礙[11-13]。此外，隨著男性年齡的增長對生殖細胞和組織也產(chǎn)生不利的影響，無論是睪丸體積，還是體內的激素[10， 14]，這種變化在>40歲的男性中尤為顯著，伴隨著生育力的明顯下降[15-16]。在健康男性中，30歲和40歲是兩個節(jié)點，我們依據(jù)健康男性中這一自然生理趨勢進行了相關分組，選擇了3個年齡梯度：<30歲、30～40歲、>40歲。結果顯示，父方年齡與臨床妊娠結局有統(tǒng)計學相關性，隨著父方年齡的增高，ICSI周期的植入率和臨床妊娠率呈顯著下降趨勢。

有文獻報道附睪來源的精子有更高的活產(chǎn)率[4]。Meijerink等[5]發(fā)現(xiàn)附睪來源的精子與睪丸精子相比會增加出生兒的缺陷。也有文獻提示睪丸精子和精液精子對ICSI結局的影響無統(tǒng)計學差異[6， 17-18]；附睪來源精子和睪丸來源精子對ICSI的臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率均無顯著影響[19]。我們的結果提示不同來源的精子對臨床結局無顯著影響，ICSI可應用不同來源的精子。

隨著生命周期的延長、婚姻模式的改變，再婚重組家庭、晚婚晚育家庭使得生育孩子的年齡呈現(xiàn)增長的趨勢，不孕不育患者中高齡患者也越發(fā)增多。Ford等[20]發(fā)現(xiàn)隨著男方年齡的增長，配偶的懷孕幾率呈明顯的下降趨勢。為了研究父方年齡對輔助生殖技術的影響，F(xiàn)rattarelli等[21]利用供卵的體外受精研究，發(fā)現(xiàn)隨著男方年齡的增加，囊胚形成率、妊娠率均下降。Hazout等[22]研究表明，反復ICSI失敗周期與精子DNA損傷相關聯(lián)，而父方年齡與精子DNA損傷相關[23]，隨著年齡的增長精子的DNA甲基化水平升高[24]，同時使得精子氧化應激增加[25-27]，從而加劇DNA的損傷[26]。我們通過對本中心2012～2015年接受ICSI治療并實施新鮮周期移植的患者進行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，隨著父方年齡的增長，植入率和臨床妊娠率均呈現(xiàn)下降的趨勢，提示我們男方年齡對精子質量的影響不可忽視，在行ICSI治療時， 應關注男方的年齡，對于適應證患者應盡早行ICSI治療，改善妊娠結局。

綜上所述， ICSI可應用不同來源的精子，鑒于男方年齡對精子質量的影響，在嚴格掌握ICSI指征的基礎上對于適應證患者應盡早行ICSI治療。但是由于本研究是小樣本的回顧性研究，此外有關精子來源、父方年齡與成功生育后代的隨訪數(shù)據(jù)還有待完善，結果還存在局限性，有待后續(xù)研究完善。

[1] Nyboe AA， Carlsen E， Loft A. Trends in the use of intracytoplasmatic sperm injection marked variability between countries[J]. Hum Reprod Update， 2008，14： 593-604.

[2] Rubino P， Viganò P， Luddi A， et al. The ICSI procedure from past to future： a systematic review of the more controversial aspects[J]. Hum Reprod Update， 2015，22：1-34.

[3] Jawed S， Rehman R， Ali MA， et al. Fertilization rate and its determinants in intracytoplasmic sperm injection[J]. Pak J Med Sci， 2016， 32： 3-7.

[4] Madelon VW， Natalie B， Andreas M， et al. Live birth rates after MESA or TESE in men with obstructive azoospermia： is there a difference?[J]. Hum Reprod， 2015. 30： 761-766.

[5] Meijerink AM， Oomen RE， Fleischer K， et al. Effect of maternal and treatment-related factors on the prevalence of birth defects after PESA-ICSI and TESE-ICSI： a retrospective cohort study[J]. Acta Obstet Gynecol Scand， 2015， 94： 1245-1253.

[6] Abhyankar N， Kathrins M， Niederberger C. Use of testicular versus ejaculated sperm for intracytoplasmic sperm injection among men with cryptozoospermia： a meta-analysis[J]. Fertil Steril，2016，104： e244-e245.

[7] 徐志鵬，孫海翔，胡婭莉，等. ICSI術改善前次IVF周期中多精受精的有效性研究[J]. 中華男科學雜志，2011，17： 973-976.

[8] 李蓉，莊廣倫. 卵漿內單精子顯微注射[J]. 生殖醫(yī)學雜志， 1997，2： 125.

[9] Harman SM， Metter EJ， Tobin JD， et al. Longitudinal effects of aging on serum total and free testosterone levels in healthy men. Baltimore Longitudinal Study of Aging[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2001，86： 724-731.

[10] Baccarelli A， Morpurgo PS， Corsi A， et al. Activin A serum levels and aging of the pituitary-gonadal axis： a cross-sectional study in middle-aged and elderly healthy subjects[J]. Exp Gerontol， 2001，36： 1403-1412.

[11] Amaral S，Ramalho-Santos J. Aging， mitochondria and male reproductive function[J]. Curr Aging Sci， 2009，2： 165-173.

[12] Sampson N， Untergasser G， Plas E， et al. The ageing male reproductive tract[J]. J Pathol， 2007，211： 206-218.

[13] Mirone V， Ricci E， Gentile V， et al. Determinants of erectile dysfunction risk in a large series of Italian men attending andrology clinics[J]. Eur Urol， 2004，45： 87-91.

[14] Mahmoud AM， Goemaere S， El-Garem Y， et al. Testicular volume in relation to hormonal indices of gonadal function in community-dwelling elderly men[J]. J Clin Endocrinol Metab 2003， 88：179-184.

[15] De La Rochebrochard E，Thonneau P. Paternal age>or=40 years： an important risk factor for infertility[J]. Am J Obstet Gynecol， 2003， 189： 901-905.

[16] De La Rochebrochard E， de Mouzon J， Thepot F， et al. Fathers over 40 and increased failure to conceive： the lessons of in vitro fertilization in France[J]. Fertil Steril， 2006，85：1420-1424.

[17] 劉俊山，黃黧，吳曉茜，等. 不同來源精子行卵胞漿內單精子注射臨床結局的分析[J]. 生殖醫(yī)學雜志， 2012， 21： 584-587.

[18] 曹金鳳，杜元杰，趙志明，等.不同來源精子行卵胞漿內單精子注射臨床妊娠結局分析[J]. 生殖醫(yī)學雜志， 2015， 24： 129-133.

[19] 馮雙苗，蘇迎春，孫瑩璞，等. 附睪和睪丸精子活力對卵胞漿內單精子注射結局的影響[J]. 生殖醫(yī)學雜志， 2009，18： 29-32.

[20] Ford W， North KH， Farrow A， et al. Increasing paternal age is associated with delayed conception in a large population of fertile couples： evidence for declining fecundity in older men. The ALSPAC Study Team (Avon Longitudinal Study of Pregnancy and Childhood)[J]. Hum Reprod， 2000， 15： 1703-1708.

[21] Frattarelli JL， Miller KA， Miller BT， et al. Male age negatively impacts embryo development and reproductive outcome in donor oocyte assisted reproductive technology cycles[J]. Fertil Steril， 2008， 90： 97-103.

[22] Hazout A， Dumont-Hassan M， Junca AM， et al. High-magnification ICSI overcomes paternal effect resistant to conventional ICSI[J/OL]. Reprod Biomed Online， 2006， 12：19-25.

[23] Abbeel EVD， Balaban B， Ziebe S， et al. Association between blastocyst morphology and outcome of single-blastocyst transfer[J/OL]. Reprod Biomed Online， 2013， 27： 353-361.

[24] Jenkins TG， Aston KI， Cairns BR， et al. Paternal aging and associated intraindividual alterations of global sperm 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine levels[J]. Fertil Steril， 2013， 100： 945-951.

[25] Cocuzza M， Athayde KS， Agarwal A， et al. Age-related increase of reactive oxygen species in neat semen in healthy fertile men[J]. Urology， 2008，71： 490-494.

[26] Muratori M， Tamburrino L， Marchiani S， et al. Investigation on the origin of sperm DNA fragmentation： role of apoptosis， immaturity and oxidative stress[J]. Mol Med， 2015，21： 109-122.

[27] Aitken RJ， Baker MA， Sawyer D. Oxidative stress in the male germ line and its role in the aetiology of male infertility and genetic disease[J/OL]. Reprod Biomed Online， 2003，7： 65-70.

[編輯：羅宏志]

Effect of paternal age and sperm source on outcomes of ICSI

NI Xiao-bei， WANG Shan-shan， XU Zhi-peng， CHEN Lin-jun， ZHANG Ning-yuan， SUN Hai-xiang*

CenterofReproductiveMedicine，DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210008

Objective： To investigate the effect of paternal age and sperm source on outcomes of ICSI.Methods： The data of 489 ICSI cycles in our center from January 2012 to December 2015 were respectively analyzed. The maternal age was between 30-34 years. The patients were grouped according to whether clinical pregnancy happened in order to analyze the effect of the paternal age (<30 years， 30 to 40 years，>40 years) and sperm source (semen sperm， epididymal sperm， testicular sperm) on clinical outcomes.Results： There were 348 patients in pregnancy group and 141 patients in non-pregnancy group. There were no significant differences in age， body mass index， baseline hormone levels， endometrial thickness and available embryo rate between the two groups (P>0.05). Then regression analysis was performed using the clinical pregnancy as the dependent variable and sperm source and paternal age as independent variables. The results of regression analysis showed that sperm source and clinical pregnancy had no significant correlation (P>0.05)， while the paternal age was significantly associated with clinical pregnancy (P<0.05).Conclusions： In the ICSI cycle， the clinical pregnancy rate decreases along with increasing paternal age， while sperm source does not affect clinical outcomes.

ICSI； Paternal age； Sperm source； Clinical outcomes

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.006

2016-06-09；

2016-07-11

倪曉蓓，女，江蘇南通人，碩士，研究實習員，生殖醫(yī)學專業(yè).(*