人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)(2016)

中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì) 第一屆實(shí)驗(yàn)室學(xué)組

·專家共識(shí)·

人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)(2016)

中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì) 第一屆實(shí)驗(yàn)室學(xué)組

自從1988年中國(guó)大陸第一例試管嬰兒出生以來，我國(guó)300多家生殖中心已經(jīng)使近百萬的不育婦女獲得妊娠。眾所周知，胚胎學(xué)家對(duì)于輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的正常運(yùn)行非常重要，他們的任務(wù)是在體外操作人的配子和胚胎，這些操作過程是輔助生殖中心的核心工作。為了在IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系中改善醫(yī)療治療和安全性，中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組編纂了本共識(shí)，以保障實(shí)驗(yàn)室工作的良好運(yùn)行。

輔助生殖技術(shù)； 實(shí)驗(yàn)室安全性； 質(zhì)量保證

(JReprodMed2017，26(1)：1-8)

指南概述

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)已在我國(guó)大陸地區(qū)發(fā)展27年，近15年來，該項(xiàng)技術(shù)迅速成長(zhǎng)，大批生殖中心在各地陸續(xù)建成。2001～2003年，衛(wèi)生部主管部門頒布了一系列針對(duì)輔助生育技術(shù)的技術(shù)規(guī)范及管理辦法，使得該項(xiàng)技術(shù)走向規(guī)范化，得到健康發(fā)展。2005年12月，中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)(CSRM)成立，進(jìn)一步促進(jìn)了該學(xué)科的學(xué)術(shù)發(fā)展。近些年來，中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)各方面專家在臨床、實(shí)驗(yàn)室方面均積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，形成了獨(dú)特的見解。為了進(jìn)一步規(guī)范IVF實(shí)驗(yàn)室操作，為患者提供更優(yōu)質(zhì)的臨床醫(yī)療服務(wù)，學(xué)組根據(jù)國(guó)內(nèi)外發(fā)表的文獻(xiàn)和國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室專家意見，并參考了美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)和歐洲生殖醫(yī)學(xué)會(huì)的相關(guān)指南[1]，制定本指南。由于專業(yè)的特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外的臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指南大量觀點(diǎn)證據(jù)級(jí)別均較低，或者無循證證據(jù)。因此按照CSRM指南共識(shí)編寫手冊(cè)的分類，本指南為正式的專家共識(shí)指南。

本指南的適用范圍為我國(guó)已經(jīng)正式實(shí)施IVF-ET技術(shù)的生殖中心，在為不育患者實(shí)施IVF-ET治療中，臨床胚胎學(xué)家進(jìn)行的人類配子和胚胎操作。制定本指南的目標(biāo)是協(xié)助各個(gè)實(shí)驗(yàn)室制定自己的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，從而獲得更加穩(wěn)定的臨床結(jié)局，減少差錯(cuò)發(fā)生。

IVE-ET實(shí)驗(yàn)室操作的關(guān)鍵問題

一、配子與胚胎的總體操作原則

IVF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)責(zé)管理工作的臨床胚胎學(xué)家，應(yīng)該針對(duì)所有配子或胚胎進(jìn)行的操作制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并應(yīng)該按照該標(biāo)準(zhǔn)操作程序培訓(xùn)下級(jí)臨床胚胎學(xué)家。

所有操作方法應(yīng)該簡(jiǎn)便、安全、可靠。胚胎培養(yǎng)室還應(yīng)遵循無菌、無毒、無味、無塵的原則。

新裝修胚胎培養(yǎng)室啟用前需要做鼠胚試驗(yàn)，鼠胚試驗(yàn)合格后才能投入使用。胚胎培養(yǎng)室還應(yīng)該有UPS電源，以保障24 h不間斷供電。

除冷凍復(fù)蘇等特定操作外，操作與觀察過程應(yīng)該保持配子或胚胎處于37℃的溫度、40%～60%濕度的環(huán)境下。

IVF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的空氣質(zhì)量情況會(huì)明顯影響胚胎的發(fā)育潛能，建議采取適當(dāng)?shù)拇胧└纳茖?shí)驗(yàn)室的空氣質(zhì)量，特別是能夠去除空氣中VOC的凈化系統(tǒng)[2]。

所有操作應(yīng)該符合無菌原則；所有配子或胚胎操作應(yīng)該在百級(jí)潔凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。

所有配子或胚胎的培養(yǎng)皿、試管等應(yīng)該在放入配子或胚胎前標(biāo)注患者姓名。不應(yīng)該在同一操作區(qū)域內(nèi)同時(shí)操作兩位或多位患者的配子或胚胎。應(yīng)該將一位患者的樣本完全處理完并放置入培養(yǎng)箱或液氮容器后再處理下一位患者的樣本。不同的容器間轉(zhuǎn)移配子或胚胎前，應(yīng)該核對(duì)兩個(gè)容器上的患者姓名標(biāo)識(shí)。

所有接觸患者配子或胚胎的耗材、試劑需要經(jīng)過精子存活實(shí)驗(yàn)后方可使用，有條件者建議進(jìn)行鼠胚試驗(yàn)。

所有接觸患者配子或胚胎的耗材(培養(yǎng)皿、巴斯特管、吸管、加樣器頭、取卵針、移植管等)，只能一次性使用，使用后按醫(yī)用垃圾處理。

對(duì)配子或胚胎進(jìn)行的操作時(shí)應(yīng)該進(jìn)行雙人復(fù)核。

具體的每一步操作過程，應(yīng)該有紙質(zhì)和電子記錄保存，以備日后查驗(yàn)。

詳細(xì)記錄每個(gè)病人所用的試劑、耗材批號(hào)。

二、取卵及撿卵

IVF實(shí)驗(yàn)室的胚胎學(xué)家在取卵前應(yīng)與臨床醫(yī)生核對(duì)患者信息，在臨床醫(yī)師對(duì)患者實(shí)施取卵術(shù)時(shí)，應(yīng)該同步進(jìn)行撿卵操作。

由于卵母細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間處于低于體溫的環(huán)境下受精能力將下降，非整倍體幾率增加[3]，因此，在取卵過程中，應(yīng)從患者卵巢內(nèi)抽出的卵泡液應(yīng)由負(fù)壓吸引器直接吸入37℃恒溫試管架上的無菌試管中。取出的卵泡液應(yīng)該保持在37℃左右的環(huán)境下，盡快在體視鏡下識(shí)別卵冠丘復(fù)合物，通過輕柔吹打、洗滌的方法去除卵冠丘復(fù)合物周圍的血液、血凝塊和卵泡液成分。以盡可能減少開啟培養(yǎng)箱次數(shù)、盡可能縮短在培養(yǎng)箱外停留時(shí)間為原則，將卵冠丘復(fù)合體移至培養(yǎng)箱，記錄所用培養(yǎng)液批號(hào)、取卵者及揀卵者姓名、培養(yǎng)箱號(hào)、卵冠丘復(fù)合物形態(tài)評(píng)估情況以及撿卵核對(duì)者的姓名等。

三、精液處理

所有患者夫婦在進(jìn)行IVF治療之前，應(yīng)該進(jìn)行精液常規(guī)分析，分析推薦采用WHO第5版的標(biāo)準(zhǔn)。

除特殊情況外，男性配偶應(yīng)該在取卵前2～7 d排精一次。精液收集在無菌、無毒性的取精杯中，并在取精杯上注明患者夫婦姓名及編號(hào)。取精后盡快將取精杯送入精液處理室，建議在1 h內(nèi)開始處理[4]。

精液處理應(yīng)該在室溫下進(jìn)行[5]。精液處理的目的是去除精漿以及精液中的污染物、雜質(zhì)和異常精子，并使精子獲能。精液處理過程中應(yīng)該記錄取精方法、精液的量、顏色、液化情況等基本參數(shù)。如院外取精，或者在采集精液過程中發(fā)生特殊情況，應(yīng)該予詳細(xì)記錄。

目前暫無統(tǒng)一的精液處理方法，可根據(jù)各中心經(jīng)驗(yàn)和精液樣本質(zhì)量選擇優(yōu)選方法。不管采用何種方法，反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間離心可能會(huì)導(dǎo)致精子的損傷[6]。處理過程(每步時(shí)間、操作者等)及處理后的精子濃度、活率，應(yīng)該記錄備案。

常用精液處理方法為密度梯度離心法或上游法，但對(duì)濃度極低的精液樣本，建議僅洗滌1～2次后備用，以卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)方式授精。

1.液化不良精液處理：對(duì)液化不良的精液，建議在離心前，用無菌注射器吹吸混勻，或巴氏吸管反復(fù)吹打混勻，混勻后讓未液化團(tuán)塊自然沉淀后棄去，再對(duì)樣本進(jìn)行密度梯度離心。

2.上游法：上游法處理精液，推薦直接將原精液樣本置于培養(yǎng)基下層，收集上層懸液。不建議先與培養(yǎng)基混勻離心后再上游的處理方式。

3.密度梯度離心法：相對(duì)上游法處理精液，密度梯度離心處理后精子的回收率較高。

上游法和密度梯度離心法都會(huì)顯著降低凋亡精子的比例[7]。

四、自然受精

1. 自然受精的加精時(shí)間：HCG注射后38～40 h加精，受精率較為理想。加精時(shí)應(yīng)該雙人核對(duì)并記錄時(shí)間、加精量。

加精濃度在很大的一個(gè)范圍內(nèi)，獲得的受精率類似，在30～50 μl的液滴內(nèi)加精5 000～10 000條，或在1 ml的培養(yǎng)液內(nèi)加精15萬～30萬條。但過高的加精濃度可能導(dǎo)致多精受精率升高和培養(yǎng)體系生化環(huán)境下降，因此可能有害。

2. 精卵共培養(yǎng)時(shí)間：常規(guī)受精：將精卵共培養(yǎng)18～20 h；短時(shí)受精：縮短精卵共培養(yǎng)至1～6 h(短時(shí)受精僅指縮短共培養(yǎng)時(shí)間，不包括剝除卵冠丘復(fù)合物的顆粒細(xì)胞)。

短時(shí)受精縮短了精子與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)的時(shí)間，能夠改善臨床妊娠率[8]。短時(shí)受精周期中，多原核發(fā)生可能與患者年齡有關(guān)[9]。短時(shí)受精周期中，多原核發(fā)生率對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響尚不明確[10]。與常規(guī)受精相比，短時(shí)受精的可移植胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎率更高[11]。

五、ICSI

ICSI適應(yīng)癥：除了原衛(wèi)生部頒布的《衛(wèi)生部關(guān)于修訂人類輔助生殖技術(shù)與人類精子庫(kù)相關(guān)技術(shù)規(guī)范、基本標(biāo)準(zhǔn)和倫理原則的通知》中的適應(yīng)癥之外，對(duì)于前次IVF多精受精比例較高、沒有獲得足夠可移植胚胎的患者，再次治療可以考慮ICSI[12]。

解凍睪丸精子行ICSI，能得到與新鮮睪丸精子類似的受精結(jié)局[13]。

ICSI之前需要用透明質(zhì)酸酶和機(jī)械的方法去除顆粒細(xì)胞，在此過程中，應(yīng)該盡量減少卵子接觸酶的時(shí)間，機(jī)械去除顆粒細(xì)胞的過程中應(yīng)該使用適當(dāng)口徑的巴斯特管，盡量減少吹吸次數(shù)，從而減少機(jī)械刺激的應(yīng)激。

透明帶明顯異常的卵母細(xì)胞自然受精能力下降，采用ICSI方式授精能明顯改善受精結(jié)局[14]。

在經(jīng)過常規(guī)卵巢刺激后，獲得的未成熟卵母細(xì)胞常常存在染色體異常，未表明對(duì)這些卵進(jìn)行ICSI能改善結(jié)局[15]。如經(jīng)過卵巢刺激獲卵均為MI期停滯的卵細(xì)胞，行體外成熟培養(yǎng)(IVM)結(jié)局不良[16]。

Half ICSI：部分卵子ICSI(Half ICSI)作為可疑受精困難者的備選，在一定程度上預(yù)防IVF完全受精失敗[17]。

ICSI操作過程中，可以考慮采用PVP等液體來降低操作難度，但要盡量減少注入卵母細(xì)胞的PVP的量。

影響ICSI受精率的最重要的因素包括：卵母細(xì)胞的質(zhì)量和成熟度、精子質(zhì)量及制動(dòng)情況、破膜的情況。在操作人員技術(shù)熟練的基礎(chǔ)上，受精率低或卵母細(xì)胞退化率高的最可能原因是卵母細(xì)胞的質(zhì)量差或成熟度不良[18]。應(yīng)該盡一切可能選擇活動(dòng)精子制動(dòng)后注射，制動(dòng)過程如果不充分(未劃破精子尾部細(xì)胞膜)將影響受精率。如全部精子均為不動(dòng)精子，可以考慮在ICSI操作中使用睪丸精子、經(jīng)低滲處理的精子或者在精子中加入精子激動(dòng)劑[19]

ICSI后應(yīng)該在記錄中記錄卵母細(xì)胞和精子的情況、操作過程、操作者、所用培養(yǎng)液及耗材詳情。

六、早期補(bǔ)救性ICSI

短時(shí)受精結(jié)合早剝除卵冠丘復(fù)合物顆粒細(xì)胞(早拆卵)，以極體排出(卵子激活)判斷受精發(fā)生，如卵子激活完全失敗或卵子激活發(fā)生率低于一定比例時(shí)，在加精時(shí)間短于8 h行補(bǔ)救ICSI稱早期補(bǔ)救ICSI。

短時(shí)受精(早拆卵)聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI對(duì)常規(guī)IVF周期完全受精失敗患者的臨床結(jié)局有明顯改善[20]，早期補(bǔ)救ICSI后妊娠的出生結(jié)局及新生兒狀況與采用射精精液的ICSI后出生結(jié)局無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[21]。早期補(bǔ)救性ICSI周期出生嬰兒的性別比無偏差，出生體重正常，無嚴(yán)重出生缺陷[22]。但目前還缺乏長(zhǎng)時(shí)間的隨訪的結(jié)果，因此臨床醫(yī)生可以考慮對(duì)這類患者進(jìn)行短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI。

七、胚胎培養(yǎng)

常規(guī)受精結(jié)束或ICSI后應(yīng)該更換培養(yǎng)液及培養(yǎng)皿，隨后在IVF授精或ICSI后16～18 h之間觀察受精情況，記錄原核形態(tài)、數(shù)量。

胚胎培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置：根據(jù)2011年版ESHERE發(fā)布的Istanbul共識(shí)[23]設(shè)置胚胎觀察時(shí)間點(diǎn)(表1)。由于各實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系不同、操作方法不同，胚胎發(fā)育速度不一致。因此，學(xué)組建議各中心應(yīng)在Istanbul共識(shí)的時(shí)間點(diǎn)基礎(chǔ)上找出符合各自中心最佳觀察點(diǎn)。

雖然多原核的胚胎依然有繼續(xù)發(fā)育甚至妊娠的可能性，但多原核胚胎有導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的可能，不應(yīng)該用于移植和冷凍[24]。

人類胚胎對(duì)外部應(yīng)激非常敏感，不良應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常，影響細(xì)胞功能和基因表達(dá)[25]。因此，胚胎體外培養(yǎng)的核心工作應(yīng)該著眼于使胚胎時(shí)刻保持在合適的pH值、溫度、滲透壓等指標(biāo)的環(huán)境中，以利于胚胎保持穩(wěn)態(tài)[26]。

胚胎的觀察應(yīng)該注意卵裂球數(shù)量、碎片所占的百分比、細(xì)胞大小的均一性及排列、胞漿顏色以及多核現(xiàn)象等。推薦參考Istanbul共識(shí)中的胚胎評(píng)分方法，針對(duì)每一枚卵裂期胚胎，形態(tài)學(xué)評(píng)分應(yīng)包含三個(gè)方面信息：卵裂球數(shù)、級(jí)別以及評(píng)為這個(gè)級(jí)別的原因。Istanbul共識(shí)中級(jí)別的評(píng)定見表2。

胚胎培養(yǎng)記錄中應(yīng)詳細(xì)記載所用培養(yǎng)液的品種、批號(hào)、培養(yǎng)箱的情況、操作人員等詳情。

表1 胚胎觀察時(shí)間點(diǎn)設(shè)置(修改自Istanbul共識(shí))

觀察點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)(h，授精后)期望值卵子活化4±2第二極體排出受精17±1原核形成合子23±11細(xì)胞發(fā)生率50%2細(xì)胞發(fā)生率20%早卵裂26±1(ICSI)28±1(IVF)2細(xì)胞D2卵裂期評(píng)估44±14?5細(xì)胞D3卵裂期評(píng)估68±18?9細(xì)胞D4評(píng)估92±2桑葚胚D5評(píng)估116±2囊胚

表2 胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)(除卵裂球數(shù)之外的評(píng)價(jià)內(nèi)容)
(引自Istanbul共識(shí))

評(píng)分質(zhì)量形態(tài)描述1優(yōu)碎片<10%細(xì)胞大小與發(fā)育階段相符無多核現(xiàn)象2中等碎片含量為10%～25%多數(shù)細(xì)胞的大小與發(fā)育階段相符沒有多核的證據(jù)3差大量碎片(>25%)細(xì)胞大小與發(fā)育階段不相符有多核現(xiàn)象

八、胚胎移植

1. 移植胚胎數(shù)目：我國(guó)衛(wèi)生行政部門已經(jīng)有明確的法規(guī)限制了移植胚胎的數(shù)量[27]，但是對(duì)于瘢痕子宮、雙子宮等畸形子宮、宮頸內(nèi)口松弛、身高過于矮小等高?；颊撸浦?枚胚胎將會(huì)對(duì)母嬰造成很大的安全風(fēng)險(xiǎn)，建議進(jìn)行單胚胎移植。

2. 移植胚胎選擇：相對(duì)而言，卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育能力；散在的胚胎碎片比集中的胚胎碎片更加影響胚胎著床；卵裂球內(nèi)是否存在多核現(xiàn)象顯著影響胚胎的著床率[28]。除了形態(tài)學(xué)選擇外，測(cè)定胚胎的氨基酸代謝情況等生化檢測(cè)指標(biāo)[29]、胚胎分泌的微量HCG等方法，也可以考慮作為一種無創(chuàng)選擇胚胎的手段。

3. 移植方法：應(yīng)該使用一次性移植導(dǎo)管。超聲引導(dǎo)下移植使手術(shù)更加精準(zhǔn)，并保證穩(wěn)定的妊娠率[30]。在裝載移植管時(shí)務(wù)必雙人核對(duì)，在將含胚胎的移植管置入患者宮腔之前，應(yīng)該雙人核對(duì)患者姓名[31]。

4. 移植記錄：移植記錄應(yīng)該詳細(xì)記載胚胎數(shù)目、形態(tài)學(xué)評(píng)分、移植時(shí)間、移植過程中導(dǎo)管置入深度、出血的情況、以及臨床醫(yī)師和臨床胚胎學(xué)家的姓名。

九、囊胚培養(yǎng)

囊胚培養(yǎng)的主要目的是對(duì)胚胎進(jìn)行自然選擇。對(duì)于部分患者而言，囊胚培養(yǎng)移植可能改善她們的臨床妊娠率[32]。囊胚培養(yǎng)可以等待PGD結(jié)果出具，利于篩選移植胚胎。囊胚培養(yǎng)增加了胚胎在體外的培養(yǎng)時(shí)間，也增加了不利因素影響的風(fēng)險(xiǎn)[33]。

由于囊胚的營(yíng)養(yǎng)需求與卵裂期胚胎有差異，因此囊胚培養(yǎng)過程中通常采取一些特殊的條件。目前較多采用序貫培養(yǎng)液進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，但這并非唯一方案。另外低氧培養(yǎng)、集合培養(yǎng)也有可能利于囊胚形成。如果進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，應(yīng)該具備良好的培養(yǎng)條件。

目前大多數(shù)中心按照Gardner囊胚分級(jí)法對(duì)形成的囊胚進(jìn)行分級(jí)[34]。在此基礎(chǔ)上，為了消除工作人員之間在評(píng)分方法上的差異，推薦采用更為細(xì)化和客觀化的評(píng)分手段：擴(kuò)張之后的囊胚因?yàn)槟遗咔幻黠@擴(kuò)大，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層清晰，而且囊胚在此階段發(fā)育的時(shí)間較長(zhǎng)，因此在此發(fā)育階段進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分更客觀可靠；可以在擴(kuò)張囊胚的中部最大直徑平面(“赤道面”)上以及囊胚最貼近培養(yǎng)皿的底面上分別聚焦后觀察滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。細(xì)化的擴(kuò)張囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。雖然滋養(yǎng)細(xì)胞層將來并不發(fā)育成胎兒，但其形態(tài)對(duì)于囊胚的進(jìn)一步發(fā)育和著床有著非常重要的意義[35]。D5和D6形成的囊胚均可進(jìn)行移植或冷凍，D5的囊胚著床率高于D6的囊胚。

不同來源的精子受精后的胚胎，形成囊胚的比例和質(zhì)量可能存在差異[36]。D3的優(yōu)質(zhì)胚胎，囊胚形成率較高，而且囊胚質(zhì)量較好[37]。

囊胚培養(yǎng)移植可能會(huì)增加移植取消率。

囊胚培養(yǎng)記錄中應(yīng)該包含培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液的情況，并記錄囊胚形成的時(shí)間。

表3 細(xì)化的擴(kuò)張期囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

評(píng)分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)滋養(yǎng)細(xì)胞層A形態(tài)規(guī)則，直徑在60μm以上，細(xì)胞大小均勻，融合沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球數(shù)明顯超過10個(gè)，大小均勻，在囊胚底面的細(xì)胞全部形態(tài)清晰，大多數(shù)可見細(xì)胞核B形態(tài)不規(guī)則，直徑在60μm以上，細(xì)胞大小不勻，有相當(dāng)一部分沒有融合沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球數(shù)10個(gè)左右，大小欠均勻，在囊胚底面的部分細(xì)胞形態(tài)清晰，部分可見細(xì)胞核C明顯小于正常大小，卵裂球數(shù)極少沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球數(shù)明顯少于10個(gè)，大小明顯不均勻，滋養(yǎng)細(xì)胞與透明帶之間有明顯的碎片殘留，囊胚底面的細(xì)胞難以辨認(rèn)

十、配子及胚胎冷凍

每個(gè)生殖中心實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)該建立可靠的冷凍保存技術(shù)，冷凍過程及放入液氮灌的儲(chǔ)存位置時(shí)應(yīng)雙人核對(duì)。

冷凍方法：雖然玻璃化冷凍技術(shù)中采用的冷凍保護(hù)劑濃度更高，可能帶來胚胎毒性的風(fēng)險(xiǎn)，但玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞、卵裂期胚胎和囊胚復(fù)蘇率均明顯優(yōu)于程序冷凍技術(shù)[38]。且從目前國(guó)內(nèi)外獲得的短期隨訪數(shù)據(jù)看來，玻璃化冷凍復(fù)蘇的胚胎，移植后出生的新生兒，出生缺陷無明顯增加，身長(zhǎng)體重也未見明顯異常[39]。因此推薦采用玻璃化冷凍技術(shù)進(jìn)行胚胎的冷凍。

卵母細(xì)胞冷凍：目前卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)上不完全成熟，效率較低，建議僅用于因醫(yī)學(xué)原因無法在取卵日受精的患者。HCG后36 h取卵，取卵后2 h玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率顯著高于取卵后5～6 h冷凍的卵母細(xì)胞，因此建議在取卵后2 h左右進(jìn)行冷凍[40]。

冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞，紡錘體在2～3 h重建，線粒體的膜電位2 h后恢復(fù)[41]，因此建議在復(fù)蘇2～3 h后進(jìn)行ICSI。

胚胎冷凍：移植剩余的胚胎，可以考慮按照一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選擇后，進(jìn)行胚胎冷凍。發(fā)育速度過慢或質(zhì)量太差的胚胎，不論是卵裂期胚胎還是囊胚，其復(fù)蘇后存活率和著床率都會(huì)顯著降低。每個(gè)冷凍容器內(nèi)的胚胎數(shù)量推薦結(jié)合擬復(fù)蘇移植的胚胎數(shù)量和所在中心的復(fù)蘇率來確定[42]。

玻璃化冷凍液中的平衡時(shí)間明顯影響胚胎復(fù)蘇率以及復(fù)蘇后的發(fā)育能力，平衡時(shí)間的長(zhǎng)短應(yīng)該與溫度相適應(yīng)：溫度越高(37℃)，平衡時(shí)間越短；溫度較低(“室溫”)，平衡時(shí)間應(yīng)該適度延長(zhǎng)。擴(kuò)張較充分的囊胚冷凍復(fù)蘇后存活率較好，建議這些胚胎在進(jìn)行玻璃化冷凍前應(yīng)進(jìn)行人工皺縮排出囊胚腔內(nèi)的液體[43]。

復(fù)蘇后胚胎存活的情況，可以根據(jù)胚胎形態(tài)和繼續(xù)培養(yǎng)過程中胚胎發(fā)育情況來綜合判斷。能進(jìn)一步發(fā)育的胚胎預(yù)后良好。卵裂期胚胎，如果復(fù)蘇后有部分卵裂球發(fā)生損傷，提示胚胎發(fā)育潛能不良，不利于后續(xù)的臨床結(jié)局[44]。

冷凍記錄：應(yīng)該包括冷凍方法、每個(gè)容器內(nèi)的胚胎數(shù)量、發(fā)育階段、形態(tài)學(xué)評(píng)分、在液氮容器內(nèi)的儲(chǔ)存位置。

為保證冷凍中的配子或胚胎的安全，應(yīng)該監(jiān)測(cè)液氮容器內(nèi)的液氮液面位置，建立完善的冷凍管理制度。

十一、輔助孵出

輔助孵出應(yīng)用于新鮮周期移植的價(jià)值一直存在爭(zhēng)議，目前的證據(jù)不推薦對(duì)所有移植的胚胎進(jìn)行輔助孵出。而對(duì)于那些臨床預(yù)后較差的患者，如反復(fù)植入失敗、胚胎質(zhì)量較差、胚胎透明帶異常的胚胎以及高齡的患者(>38歲)，輔助孵出可能改善種植率[45]。通過時(shí)差成像技術(shù)觀察，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇胚胎(尤其是復(fù)蘇囊胚)，輔助孵出后可以利于胚胎的后續(xù)孵出，但對(duì)臨床結(jié)局是否存在改善尚不明確。目前可以考慮采用激光輔助孵出設(shè)備進(jìn)行胚胎的輔助孵出。

指南總結(jié)

一、索引

配子與胚胎的總體操作原則；取卵及揀卵；精液處理；自然受精；ICSI；早期補(bǔ)救性ICSI；胚胎培養(yǎng)；胚胎移植；囊胚培養(yǎng)；配子及胚胎冷凍；輔助孵出

二、簡(jiǎn)略說明

IVF實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，應(yīng)該針對(duì)所有配子或胚胎操作制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序。撿卵時(shí)，盡可能縮短卵冠丘復(fù)合物在培養(yǎng)箱外停留時(shí)間；精液處理方法應(yīng)根據(jù)精液具體情況而定；自然受精的加精時(shí)間為HCG注射后38～40 h，受精率較為理想；加精濃度在很大的一個(gè)范圍內(nèi)，獲得的受精率類似；影響ICSI受精率的最重要的因素包括：卵母細(xì)胞的質(zhì)量和成熟度、精子質(zhì)量及制動(dòng)情況、破膜的情況；短時(shí)受精(早拆卵)聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI對(duì)常規(guī)IVF周期完全受精失敗患者的臨床結(jié)局有明顯改善；胚胎培養(yǎng)和觀察應(yīng)嚴(yán)格按照設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，D3胚胎的卵裂球數(shù)量比卵裂球均一情況及胚胎碎片含量更能預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育能力；囊胚培養(yǎng)的主要目的是對(duì)胚胎進(jìn)行自然選擇；雖然滋養(yǎng)細(xì)胞層將來并不發(fā)育成胎兒，但其形態(tài)對(duì)于囊胚的進(jìn)一步發(fā)育和著床有著非常重要的意義；玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞、卵裂期胚胎和囊胚復(fù)蘇率均明顯優(yōu)于程序冷凍技術(shù)；輔助孵出應(yīng)用于新鮮胚胎移植的價(jià)值一直存在爭(zhēng)議，對(duì)復(fù)蘇胚胎移植可能改善臨床結(jié)局。

三、下一步研究指導(dǎo)、方法學(xué)

下一步的研究應(yīng)該著重于各種操作技術(shù)對(duì)比的RCT研究，獲得更強(qiáng)的證據(jù)；應(yīng)考慮到全國(guó)范圍內(nèi)環(huán)境、人群和實(shí)驗(yàn)室具體條件的區(qū)別，多中心研究要納入不同地域的中心。

參與本指南修訂與討論專家：

黃國(guó)寧(重慶市婦產(chǎn)醫(yī)院)、孫瑩璞(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)、孫海翔 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院)、劉平(北京大學(xué)第三醫(yī)院)、徐艷文(中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、孫正怡(北京協(xié)和醫(yī)院)、黃元華(海南醫(yī)學(xué)院)、金帆(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院)、靳鐳(武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院)、田莉(北京大學(xué)人民醫(yī)院)、康躍凡(福建省婦幼保健院)、師娟子(陜西省婦幼保健院)、劉麗英(沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院)、周從容(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)、劉睿智(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院)、錢曉喬(江蘇省人民醫(yī)院)、陳秀娟(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)、胡泊(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)、辛才林(江西省婦幼保健院)、鐘影(成都市錦江婦幼保健院)、滕曉明(上海市第一婦嬰保健院)、乃東紅(廣西醫(yī)科大學(xué))、林戈(中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院)、李永剛(云南省第一人民醫(yī)院)、薛石龍(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院)、馬學(xué)工(青海省人民醫(yī)院)、張愛軍(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院)、辛志敏(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)、杜湧瑞(天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院)、方叢(中山大學(xué)附屬六院)、周平(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)、胡蓉(寧夏醫(yī)科大學(xué)總院生殖醫(yī)學(xué)中心)、曾勇(深圳中山泌尿外科醫(yī)院)、趙志明(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)、武學(xué)清(山西省婦幼保健院輔助生殖中心)、段金良(解放軍第一八一醫(yī)院)、吳克良(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院)、李蕾(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院)

指南評(píng)閱人：

黃國(guó)寧(重慶市婦產(chǎn)醫(yī)院)、孫瑩璞(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)、孫海翔 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院)、劉平(北京大學(xué)第三醫(yī)院)、徐艷文(中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

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[編輯：羅宏志]

Consensus on human IVF-ET laboratory manipulations(2016)

Embryologist Group， China Society of Reproduction Medicine， Chinese Medical Association

Since the first IVF baby was born in 1988 in China mainland， millions of women got pregnancy by ART treatment in over 300 IVF centers in China. It is well known that embryologists are critical for the correct and justified application of ART in the laboratory. They manipulate human gametes and embryos in vitro， and the processes and procedures represent the core of ART clinics. In order to improve quality and safety of ART through the implementation of a quality management system in IVF laboratory， the embryologist group of China Society of Reproduction Medicine (CSRM) compiled this consensus aiming to promote assurance of good laboratory practice.

Assisted reproduction techniques； Laboratory safety； Quality assurance

黃國(guó)寧，重慶婦產(chǎn)醫(yī)院，gnhuang217@sina.com；孫瑩璞，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，syp2008@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.001