CEACAM1和VEGF在涎腺黏液表皮樣癌中的表達及在血管生成中的作用

馬 賽，安 峰，胥愛文，王 芹，張 利，李立恒

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000)

CEACAM1和VEGF在涎腺黏液表皮樣癌中的表達及在血管生成中的作用

馬 賽，安 峰*，胥愛文，王 芹，張 利，李立恒

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000)

目的研究癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 在涎腺黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)組織中的表達及對血管生成的影響。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法檢測70例MEC、20例正常涎腺組織中CEACAM1、VEGF的表達情況，在光鏡下計數(shù)70例MEC組織中CD105標記的微血管密度(microvessel density，MVD)。結(jié)果70例MEC組織中CEACAM1蛋白陽性表達率明顯低于正常涎腺組(34.3%vs70.0%,P<0.05)，VEGF蛋白陽性表達率明顯高于正常涎腺組(71.4%vs10.0%,P<0.05)。在MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM1表達陽性率低于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者CEACAM1表達陽性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CEACAM1表達陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；而病理分級Ⅲ級者VEGF表達陽性率和MVD值高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表達陽性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF表達陽性率和MVD值高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。結(jié)論MEC組織中CEACAM1表達下調(diào)可能促進了VEGF的表達，從而參與MEC組織當(dāng)中血管的生成，促進其侵襲和轉(zhuǎn)移。

癌，黏液表皮樣；血管內(nèi)皮生長因子類；血管生成

黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是涎腺腫瘤中常見的一類惡性腫瘤。隨著MEC的發(fā)展，患者的面容會受到嚴重影響，當(dāng)腫瘤侵及神經(jīng)時面部功能也會隨之受到損害，造成患者生活質(zhì)量下降，甚至危及患者的生命。與其他腫瘤相同，MEC組織中新生血管的數(shù)量決定了其生長、浸潤、轉(zhuǎn)移潛能。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的血管生成是一個復(fù)雜的過程，受多種血管生成促進因子和抑制因子共同調(diào)控。癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是一種糖蛋白，它是癌胚抗原家族的成員之一，以往研究顯示CEACAM1與腫瘤血管、淋巴管的生成密切相關(guān)[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 是一種已知的促進血管生成的強效因子，它通過促進相鄰的血管內(nèi)皮細胞增殖和轉(zhuǎn)化遷移，促進血管的生成。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接(streptavidin-perosidase,SP)法觀察MEC組織中CEACAM1、VEGF的表達情況，并測定以CD105標記的腫瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)，旨在探討MEC組織中CEACAM1、VEGF表達改變與腫瘤微血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 收集2007年6月—2016年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科收治的MEC患者70例，均有完整的臨床病理資料。以上病例均經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療等其他治療，病理標本均由資深病理科醫(yī)師按照WHO(1991年)涎腺腫瘤組織病理學(xué)標準進行診斷分型。同時選取癌旁正常的涎腺組織20例作為對照組。兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體購自美國Labvision公司，鼠抗人CD105單克隆抗體購自NeoMarkers公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 標本處理及檢測方法 所用標本均由4%甲醛浸泡固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，并貼附于1%多聚賴氨酸處理后的載玻片上，65 ℃烤片1 h。免疫組織化學(xué)SP法檢測按試劑盒上說明的步驟進行。兔抗人CEACAM1單克隆抗體效價為1∶200，鼠抗人VEGF單克隆抗體效價為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 CEACAM1、VEGF表達陽性的判定標準 細胞膜和(或)細胞質(zhì)被染成棕黃色的細胞被判定為表達陽性細胞。在顯微鏡高倍視野下(×200)隨機選取5個視野，根據(jù)每個視野中陽性細胞的百分比和染色程度對標本進行評分。細胞計數(shù)：無陽性細胞為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。染色程度：基本不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分。細胞計數(shù)得分與染色程度得分2項相加，得分>3分被認定為陽性，≤3分認定被為陰性。

1.3.2 CD105表達陽性的判定標準及標本MVD計數(shù)方法 血管內(nèi)皮細胞膜和(或)細胞質(zhì)被染成棕黃色或棕褐色視為CD105表達陽性。根據(jù)Weidner[3]提出的方法計數(shù)標本的MVD值：在顯微鏡低倍視野下(×10)選取腫瘤微血管密度較高的區(qū)域，再在高倍視野下(×200)計數(shù)微血管的數(shù)目，每張切片選取5個高倍視野進行計數(shù)，取平均值作為該標本的MVD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CEACAM1、VEGF在MEC組織中的表達 CEACAM1和VEGF的陽性顆粒均集中在細胞質(zhì)或細胞膜中(圖1～4)，70例標本當(dāng)中CEACAM1陽性表達率分為34.3%(24/70)，明顯低于正常涎腺組織中的70.0%(14/20)，VEGF陽性表達率為71.4%(50/70)，明顯高于正常涎腺組織中的10.0%(2/20)。見表1。

2.2 MEC患者不同病理特征的CEACAM1、VEGF和MVD表達 在MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM1表達陽性率低于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+IV期者CEACAM1表達陽性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CEACAM1表達陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同性別、年齡和腫瘤部位CEACAM1表達陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);VEGF與MVD表達相反，病理分級Ⅲ 級者VEGF表達陽性率和MVD值高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表達陽性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者VEGF表達陽性率和MVD值高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同性別、年齡、病變部位VEGF表達陽性率和MVD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖5。

表1 CEACAM1和VEGF在兩組中的表達比較 Table 1 Expression of CEACAM1 and VEGF between the two groups (例數(shù)，%)

圖1 MEC組織中CEACAM1的表達情況(SP×200)Figure1 ExpressionofCEACAM1inmucoepidermoidcarcinoma(SP×200)圖2 MEC組織中VEGF的表達情況(SP×200)Figure2 ExpressionofVEGFinmuco?epidermoidcarcinoma(SP×200)

圖1 MEC組織中CEACAMI的表達情況(SP×200)

Figure 1 expression of CEACAMI in mucopidermoid carcinoma(SP×200)

圖2 MEC組織中VECF的表達情況(SP×200)

Figure 2 Expression of VECF in mucoepidermoid carcinoma(SP×200)

圖3 正常涎腺組織中CEACAM1的表達情況(SP ×200)

Figure 3 Expression of CEACAM1 in normal salivary gland(SP ×200)

圖4 正常涎腺組織中VEGF的表達情況(SP ×200)

Figure 4 Expression of VEGF in normal salivary gland(SP ×200)

圖5 MEC組織中CD105的表達情況(SP ×200)

Figure 5 Expression of CD105 in mucoepidermoid carcinoma(SP ×200)

表2 MEC中不同病理特征CEACAM1和VEGF的表達及MVD值Table 2 Expression of CEACAM and VEGF in different pathological features and MVD value in MEC

3 討 論

MEC是口腔頜面部最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，占涎腺上皮性惡性腫瘤30%左右?？砂l(fā)生于任何年齡段，其中又以40～60歲為發(fā)病高峰，女性多于男性。腮腺、頜下腺、腭腺、磨牙后腺等腺體均可發(fā)生，因其發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，病史通常較長。黏液表皮樣癌根據(jù)其發(fā)生部位、分化程度、惡性程度、有無轉(zhuǎn)移等方面的差異，治療方法及預(yù)后也有所不同[4-5]。如果臨床醫(yī)師能夠更準確地了解、評估工作中遇到的MEC，那么臨床上對MEC的治療水平必將顯著提高。

CEACAM1是免疫球蛋白超家族之中的一員，它可以參與細胞黏附、細胞信號通路傳導(dǎo)以及各種復(fù)雜的生物學(xué)進程，并且在血管生成、血運轉(zhuǎn)移、腫瘤進展中發(fā)揮著重要的作用[6]。與正常組織相比，在一些惡性腫瘤中，CEACAM1表達明顯減低，甚至不表達，所以人們普遍認為它是一種腫瘤抑制因子。CEACAM1表達的下調(diào)或缺失解除了機體對腫瘤細胞的抑制，可能是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個早期事件[2，7-8]。但是又有研究得出相反的結(jié)論，在諸如胃癌、肺癌等一部分惡性腫瘤中，CEACAM1的表達隨腫瘤惡性程度的上升而升高，且能夠促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，影響患者的預(yù)后[9-11]。對于CEACAM1在不同腫瘤當(dāng)中發(fā)揮不同作用的解釋，目前有文獻報道可能與其不同的亞型和在腫瘤細胞當(dāng)中的表達部位不同有關(guān)[10]。隨著研究的深入，人們越來越重視CEACAM1在腫瘤診斷、病情評估和判斷預(yù)后方面的重要性。目前，已有學(xué)者嘗試通過檢測患者血清當(dāng)中CEACAM1的表達來預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。而CEACAM1在涎腺MEC組織中的表達情況及與腫瘤血管生成的關(guān)系如何，國內(nèi)外均未見報道。本研究結(jié)果顯示，CEACAM1在MEC中的陽性表達率明顯低于正常涎腺組織(P<0.05)，且其表達隨涎腺MEC惡性程度的增高而降低，腫瘤侵犯的范圍越廣，其陽性表達率也越低，當(dāng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，其陽性表達率也隨之降低。這說明在涎腺MEC當(dāng)中，CEACAM1起到腫瘤抑制因子的作用，當(dāng)患者組織中CEACAM1表達降低時，提示可能腫瘤組織的惡性程度較高，預(yù)后不良。

惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程離不開新生血管的形成，而新生血管形成是一個復(fù)雜的、多基因共同參與調(diào)控的過程。VEGF是目前公認的促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵性因子[13]。VEGF在惡性腫瘤細胞中高表達，促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖，從而形成新生的血管，為腫瘤的快速發(fā)展提供充足的養(yǎng)分，并且增加了腫瘤血運轉(zhuǎn)移的機會。本研究結(jié)果顯示，VEGF在MEC組織中的表達明顯高于正常涎腺組織(P<0.05)；腫瘤的惡性程度越高、侵襲性越強，VEGF的陽性表達率越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，其陽性表達率也隨之升高。與以往的研究結(jié)論一致[14]。

CD105是一種同型二聚體的細胞膜糖蛋白，在增殖旺盛的腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞上高表達。由于CD105能夠更顯著地標記腫瘤組織中新生的微小血管，故人們把CD105視為一種更優(yōu)質(zhì)、高效的血管內(nèi)皮細胞增殖標記物，而根據(jù)它的染色評估MVD的方法也被認為能更好地量化腫瘤的MVD[15]。本研究通過標記CD105的方法來檢測MEC組織的MVD值，結(jié)果顯示CD105在MEC組織中陽性表達為100%，腫瘤的惡性程度越高、侵襲性越強，通過CD105標記的MVD值越大，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者MVD值高(P<0.05)。說明CD105標記的MVD值高，很可能預(yù)示著MEC的惡性程度高，浸潤、轉(zhuǎn)移能力強。

本研究MEC組織中CEACAM1表達與VEGF表達、CD105標記的MVD值表達相反。說明CEACAM1過表達能夠抑制腫瘤新生血管的生成。以此推斷，在MEC的發(fā)生、發(fā)展過程當(dāng)中，CEACAM1表達降低，VEGF表達增高，從而促進了MEC組織新生血管的形成，提高了其侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，影響了MEC的生物學(xué)行為。其作用機制可能是：CEACAM1作為VEGF的一個重要效應(yīng)分子，CEACAM1的表達缺失啟動了一系列促進血管生成相關(guān)的因子的高表達，如VEGF-C、VEGF-A、VEGF-D和血管生成素2等因子，從而促進了腫瘤生成新生血管[16]。但也有文獻報道，CEACAM1過表達促進了腫瘤血管、淋巴管的生成，并能夠促進血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化成淋巴管內(nèi)皮細胞[17]。至于為何CEACAM1在不同腫瘤血管生成當(dāng)中發(fā)揮著截然相反的作用，其具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，可以推斷，CEACAM1低表達、VEGF高表達，并伴有較高MVD值的MEC患者，可能預(yù)示著其腫瘤惡性程度高、侵襲性強、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后較差。通過檢測CEACAM1、VEGF的表達，并計數(shù)CD105標記的MVD值，有助于預(yù)測涎腺MEC的惡性程度及預(yù)后情況。進一步研究在MEC組織中CEACAM1與VEGF之間如何相互作用，在這一過程中是否還有其他因子參與調(diào)控及其調(diào)控的方式，有望為涎腺MEC的精準化治療提供科學(xué)依據(jù)。

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(本文編輯：許卓文)

Expression of CEACAM l and VEGF in mucoepidermoid carcinoma of salivary glands and its effect on angiogenesis

MA Sai, AN Feng*, XU Ai-wen, WANG Qin, ZHANG Li, LI Li-heng

(Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Hebei North College， ZhangJiakou 075000， China)

Objective To investigate the relationship of carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) and vascular endothelial growth factors (VEGF) expression with angiogenesis in mucoepidermoid carcinoma(MEC) of salivary glands. Methods The expression of CEACAM1 and VEGF was detected with immunohistochemcal method streptavidin-perosidase (SP) in 70 cases of MEC tissues，and 20 cases of normal salivary gland，the microvessel density(MVD) was recorded under optical microscope. Results The positive expressions of CEACAM1 protein (34.3%vs70.0%) was lower in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein (71.4%vs10.0%) was higher in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05). In MEC group，the positive expressions of CEACAM1 protein in pathological grade levelⅢ patients were lower than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in TNM stage Ⅲ+Ⅳpatients were lower than those in TNM stageⅠ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in patients with lymph node metastasis were lower than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). The positive expressions of VEGF protein and MVD in pathological grade level Ⅲpatients were higher than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in TNM stage Ⅲ+Ⅳ patients were higher than those in TNM stage Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in patients with lymph node metastasis were higher than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). Conclusion Downregulationg of CEACAM1 in MEC of salivary glands may play a role in angiogenesis through increasing the expression of VEGF，thus promote tumor invasion and metastasis.

carcinoma, mucoepidermoid； vascular endothelial growth factors； angiogenesis

2016-10-11；

2016-11-26

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20150059)；河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究項目(361009)；張家口市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(1421128D)

馬賽(1984-)，男，河北望都人，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔科疾病診治研究。

R730.26

A

1007-3205(2017)01-0043-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.010

*通訊作者