現(xiàn)代電子技術(shù)在阿爾茨海默病檢測中的應用

溫 涵(綜述)，溫立斌(審校)

(1.合肥工業(yè)大學信息工程系微電子科學與工程專業(yè)2014級1班，安徽 宣城 242000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室，江蘇 南京 210014)

·綜 述·

現(xiàn)代電子技術(shù)在阿爾茨海默病檢測中的應用

溫 涵1(綜述)，溫立斌2*(審校)

(1.合肥工業(yè)大學信息工程系微電子科學與工程專業(yè)2014級1班，安徽 宣城 242000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室，江蘇 南京 210014)

阿爾茨海默病;淀粉樣β肽類;現(xiàn)代電子技術(shù)；綜述文獻

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是為了紀念德國醫(yī)生阿洛依斯·阿爾茨海默(Alois Alzheimer)而命名的，它是人類的一種不可逆、退行性腦病，患者出現(xiàn)嚴重的記憶障礙、認知功能障礙、行為和心理癥狀，如抑郁、應激、焦慮和情緒障礙[1]。另外，AD患者容易并發(fā)感染其他致命性疾病，如人類免疫缺陷病毒感染(艾滋病病毒)、癌癥、帕金森等。世界衛(wèi)生組織將AD作為一個超過6 000億美元花費的全球范圍的社會經(jīng)濟問題。世界衛(wèi)生組織確認3 700萬人患癡呆癥，其中1 700萬人為AD患者。最近研究表明，在2050年前，老齡化人口的AD發(fā)病率將穩(wěn)定增長至目前的3倍以上[2]。目前的科學技術(shù)和水平尚不能治愈AD，因此連續(xù)檢測AD進展成為患者選擇治療和管理疾病的關(guān)鍵。目前，尚不清楚AD的具體發(fā)病機制，存在許多假說，如基因突變、氧化應激、炎癥、病毒感染等[3]。當今普遍接受的是淀粉樣級聯(lián)假說。臨床研究表明，AD患者腦和創(chuàng)傷性腦損傷表現(xiàn)出淀粉樣肽積累的相似性，主要是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和Tau蛋白。患者的腦脊液檢測Aβ和Tau蛋白有望成為生物標志物[4]。Aβ是AD發(fā)病過程中的核心病理，其在腦內(nèi)的聚集引發(fā)系列分子級聯(lián)作用，造成炎癥損傷，對神經(jīng)元和突觸產(chǎn)生毒性作用，引起AD發(fā)生發(fā)展。本綜述集中于使用現(xiàn)代電子技術(shù)檢測Aβ，作為AD的檢測方法。

1 AD的Aβ假說

Aβ有多種形式，如單體、寡聚物、原纖維和纖維[5]。在AD進展中發(fā)揮著不同重要的生理或病理影響。單體的Aβ沒有神經(jīng)毒性，而形成的寡聚物和纖維Aβ通過成核依賴性復合物加工表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，阻止長時程增強影響突觸可塑性。一般來說，由于磷酸化Tau蛋白、Aβ斑塊和不溶性、疏水性Aβ的聚集造成神經(jīng)纖維纏結(jié)而引起了AD[6]?？缒さ矸蹣忧绑w蛋白(amyloid precursor protein，APP)的降解導致Aβ斑塊的形成，APP降解的產(chǎn)生有淀粉樣和非淀粉樣途徑2種機制[1]。淀粉樣機制是通過β-分泌酶即β位點APP裂解酶和γ-分泌酶來裂解APP產(chǎn)生Aβ，形成毒性寡聚物，聚集形成斑塊；非淀粉樣途徑是通過α-分泌酶即位于Aβ序列中去整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域蛋白10來裂解APP，阻止Aβ形成，防止可溶性分泌淀粉樣前體蛋白α片段的釋放。這些改變影響了大腦神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護的特性。

Aβ斑塊形成與AD發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。不同氨基酸鏈長的2個主要亞型，即Aβ1-40和Aβ1-42是神經(jīng)性斑塊形成的主要成分，在自發(fā)自締合成超分子組裝體形成纖維和斑塊過程中，這2個淀粉肽顯示了不同的速度[7]。大腦中Aβ1-40的含量比Aβ1-42的要高。與Aβ1-42相關(guān)的斑塊形成顯示了更快的聚集，造成更多的自由基損傷而導致神經(jīng)毒性。通過影響前炎細胞因子分泌、可溶性神經(jīng)毒性寡聚物形成和纖維聚集，Aβ聚集改變了大腦的免疫應答，出現(xiàn)癡呆。Aβ寡聚物與神經(jīng)細胞脂質(zhì)雙層結(jié)合，影響細胞膜的穩(wěn)態(tài)、鈣離子的上調(diào)、細胞膜去極化、活性氧的增強，導致神經(jīng)遞質(zhì)的興奮毒性和神經(jīng)細胞死亡[8]。

2 神經(jīng)影像學方法檢測Aβ

診斷AD的傳統(tǒng)方法是對患者大腦進行尸體檢查，確定老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[9]。AD的診斷基于臨床病史和活體腦成像，如使用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、單光子發(fā)射型計算機斷層掃描顯像(single-photon emission computed tomography,SPECT)、正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography，PET)、近紅外(near infrared，NIR)響應成像和表面等離子體共振成像(surface plasmon resonance imaging,SPRi)。神經(jīng)心理學、認知和神經(jīng)學測試也用來分析AD。神經(jīng)影像學是臨床上評估AD的傳統(tǒng)和可靠技術(shù)，諸如PET、MRI、NIR等技術(shù)是廣泛采用的檢測AD腦異常的方法。目前在設(shè)計和發(fā)展成像以及具有穿透血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)能力的熒光劑方面作了巨大努力。不幸的是，這些方法費時，昂貴，準確度有限(大約85%)，近來可溶性標志物(如腦脊液或血漿中Aβ或Tau蛋白水平)被開發(fā)用來監(jiān)測疾病[10]。Wadghiri等[11]將轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD監(jiān)測的動物模型，由于過表達突變APP和早老素蛋白1，這種轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)類似AD患者的Aβ斑塊，磁標記的Aβ1-40肽，與Aβ有較高親和力，用于MRI檢測小鼠腦中的Aβ斑塊。磁標記的Aβ1-40粒子通過動脈給藥能夠穿過血腦屏障與Aβ斑塊的結(jié)合，應用免疫組織化學MRI掃描定量評價Aβ斑塊。Raymond等[12]應用了成像熒光劑的超聲輔助給藥和通過BBB的抗Aβ抗體來檢測AD，通過靜脈給藥(臺盼藍和抗體)于2種不同轉(zhuǎn)基因AD小鼠品系，使用MRI指導AD監(jiān)測和治療，結(jié)果在海馬中顯示了(16.56+5.4)倍增量的臺盼藍熒光強度和(2.76+1.2)倍增量位于淀粉樣斑塊的抗Aβ抗體。

基于神經(jīng)影像學探針的NIR熒光用于臨床前AD的監(jiān)測和治療。Fu等[13]探索了基于不同電子給體-受體末端基團的各種給體-受體NIR探針，能夠通過π-共軛系統(tǒng)互作檢測AD患者腦中的Aβ沉積。合成的2個不同鏈長和具有優(yōu)良熒光性能(發(fā)射極大值>650 nm和高量子產(chǎn)率)的探針，能夠通過BBB，也能從腦中洗掉。對于Aβ聚集物，這些探針顯示了高敏感性和高親和力。基于MRI的體內(nèi)NIR成像顯示優(yōu)化的NIR探針能區(qū)分小鼠模型，可用作Aβ聚集物或斑塊檢測的潛在的神經(jīng)影像學探針。最近，NIR神經(jīng)影像學探針用于監(jiān)測AD治療期間的Aβ變化，基于姜黃素的NIR熒光PET成像探針用于檢測可溶性和不溶性的Aβ。Zhang等[14]使用 (T-4)-[(1E,6E)-1,7-Bis[4-(dimethylamino)phenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dionato-kO3,kO5]difluoroboron(CRANAD)-3探針檢測了轉(zhuǎn)基因AD (APP/PS1)小鼠模型的Aβ 2種類型，與同日齡野生型小鼠相比，結(jié)果顯示2.29倍的信號。這種方法成功用于檢測早期階段的AD。Jaruszewski等[15]設(shè)計了一種親水性納米載體，靶向腦血管淀粉樣蛋白，用于AD的早期診斷。這種納米載體包括釓,基于MRI或SPECT成像造影劑(如碘125)和抗炎或抗淀粉劑(如姜黃素)或免疫抑制劑(如地塞米松)來靶向和處理腦血管淀粉樣蛋白?？笰β抗體固定在納米載體上。MRI和SPECT成像結(jié)果證實納米載體能夠作為有效的診斷試劑以及減少腦血管淀粉樣蛋白相關(guān)炎癥。

Gagni等[16]依據(jù)免疫學方法建立了一種檢測Aβ1-42新的標記/非標記硅/二氧化硅芯片技術(shù)，該技術(shù)平臺建立在干涉反射成像檢測基礎(chǔ)上，顯示出高通量和高敏感性。使用三元共聚物包被硅/二氧化硅，應用干涉反射成像傳感器檢測與Aβ1-42結(jié)合的抗Aβ抗體特異性識別位點。這種方法檢測腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)樣品的下限可達73 pg/mL。Kaminski Schierle等[17]報道了Aβ裝配可作為熒光蛋白的能量受體，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器監(jiān)測Aβ聚集動態(tài)。

抗體與納米技術(shù)相結(jié)合的平臺包括磁性核殼納米粒子、附著混合氧化石墨烯、建立非標記表面增強拉曼光譜，從CSF中選擇性分離Aβ。由于強等離子體耦合，納米顆粒使強拉曼光譜指紋顯示出高敏感性，經(jīng)磁性分離可檢測Aβ和Tau蛋白至100 fg/mL。此類型傳感器可分別檢測Aβ和Tau蛋白至0.312 ng/mL和0.15 ng/mL，結(jié)果優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附測定[18]。載脂蛋白E4(apolipoprotein E，ApoE4)促進了Aβ聚集，也是AD進展的主要風險因子。在生理狀態(tài)下使用局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)檢測ApoE4的傳感器已開發(fā)，ApoE4僅與Aβ1-42結(jié)合，特異性自組裝結(jié)合納米金表面，使用LSPR監(jiān)測電荷差異，這種傳感器檢測Aβ1-42達1.5 pmol/L，引起LSPR峰位移動2.9 nm。這種實時檢測方法可用來探索ApoE4-Aβ互作，以非標記方法優(yōu)化治療靶向[19]。

Cheng等[20]報道多數(shù)AD患者蛋白錯誤折疊與富含β折疊的淀粉樣纖維聚集有關(guān)。Aβ肽可與諸如鋅、銅和鐵等金屬離子互作，導致活性氧產(chǎn)生?；诤艘蕾囆訟β聚集或增殖纖維形成的互作過程可用SPR成像檢測。為此，開發(fā)出一種單芯片用來同時監(jiān)測多調(diào)節(jié)物對纖維延伸的影響，使用SPRi獲得的結(jié)果經(jīng)透射電子顯微鏡和硫黃素T驗證，確證了SPRi實驗中不同程度Aβ聚集與纖維不同延伸率相關(guān)。通過抗原替代物ADP3類肽(一種合成的N取代寡甘氨酸)，Zhao等[21]使用SPRi檢測Aβ鑒別和分離體液中的靶抗體，用制備的金鍍膜玻璃芯片執(zhí)行SPRi，測定AD患者體內(nèi)的ADP3濃度(30～48 mmol/L)，芯片上捕獲的ADP3通過抗Aβ1-42和人IgG抗體來確認，結(jié)果觀察到與抗Aβ有關(guān)的信號要比抗IgG的要高，確證了ADP3對人血清中Aβ1-42的選擇性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，作者報道AD患者的血清具有低IgG和高Aβ1-42特征。Lee等[22]制備了博導耦合雙金屬-SPR芯片來檢測Aβ水平。由于狹窄的半最大值全寬度，這種改良的SPR系統(tǒng)顯示出比金基系統(tǒng)更好的特性，抗Aβ抗體固化在博導耦合雙金屬-SPR芯片上，檢測Aβ水平范圍為100～2 000 pg/mL。

3 電化學傳感技術(shù)檢測Aβ

由于具備快速、特異和敏感等突出特點，電化學免疫傳感技術(shù)可以在pg/mL水平上檢測靶標。此外，微納電極、納米傳感材料、微電子和微型感應傳感器的出現(xiàn)又提高了技術(shù)性能。Veloso等[8]應用基于絲網(wǎng)印刷碳糊電極和方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)的非標記電化學生物傳感器來檢測β-折疊阻斷五肽(亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，LPFFD,FibIII)，它是一種Aβ纖維和寡聚物的抑制物。作者應用SWV檢測早期聚集階段Aβ1-42與FibIII的互作。通過監(jiān)測其單一酪氨酸殘基的氧化來測定SWV信號。使用硫黃素T染料作為Aβ的顯像劑，通過熒光成像來驗證結(jié)果。Zhang等[23]將電化學和高效液相色譜法相結(jié)合，通過檢測連接小肽(賴氨酸-亮氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸，KLVFFAE)N端的Fc氧化，抑制Aβ1-42聚集而進行Aβ的檢測。使用姜黃素作為電活性成分來抑制Aβ聚集，高效液相色譜法-電化學技術(shù)使可溶性Fc-KLVFFAE分子從姜黃素中分離，實時控制聚集。

諸如SWV、微分脈沖伏安法和循環(huán)伏安法(cycle voltammetry, CV)等電化學技術(shù)，利用玻碳電極快速和非標記檢測Aβ1-40和Aβ1-42也有報道。使用酪氨酸作為氧化還原基團，監(jiān)測氧化信號來檢測Aβ水平。Aβ的聚集改變了結(jié)構(gòu)構(gòu)象，導致酪氨酸氧化信號的改變?；趥鞲行阅?，作者認為微分脈沖伏安法優(yōu)于CV和SWV，其檢測限達0.7 ng/mL，對于Aβ1-40和Aβ1-42的變異系數(shù)分別為0.3%～1.4%和0.4%～3.0%[24]。Li等[25]開發(fā)了一種基于肽的SWV電化學傳感器來檢測Aβ1-42可溶性寡聚物，基于肽生物傳感器的表面電子轉(zhuǎn)移動力學區(qū)分了Aβ是否存在。結(jié)果顯示其檢測限達240 pmol/L。

金屬(鐵、銅和鋅離子)介導的Aβ聚集增加了活性氧簇產(chǎn)生，從而對腦細胞造成更大損傷。用蘇氨酸作為信號，開發(fā)的SWV生物傳感器用來了解在有金屬或沒有金屬情況下Aβ聚集的動力學，結(jié)果顯示鋅和鐵金屬離子增加了Aβ聚集。該傳感器對Aβ響應，可分析金屬螯合富含組氨酸區(qū)域(即肽疏水部分)的效果。這些結(jié)果提出了添加金屬螯合劑時Aβ聚集的機制[26]。

Yu等[27]制備了敏感的電化學納米探針，使用生物共軛的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-Au納米粒子(nanoparticles，NPS)-凝溶膠蛋白檢測可溶性Aβ1-40/1-42肽。該研究小組探索了凝溶膠蛋白和Aβ之間的特異性結(jié)合，作為一種替代方法來檢測Aβ。通過特異性結(jié)合，用凝溶膠蛋白捕獲可溶性Aβ，通過測量標記AuNPS上的HRP氧化/還原進行電化學信號的檢測。傳感器對Aβ1-40/1-42的檢測限為28 pmol/L。血紅素Aβ1-16是一種電活性劑，具有電催化O2還原功能，Liu等[28]用其修飾AuNPS來檢測Aβ，將能與Aβ N端特異性結(jié)合的單克隆抗體固化在AuNPS-血紅素/Aβ1-16上，由于Aβ被單克隆抗體捕獲導致伏安響應下降，阻止了AuNPS-血紅素/Aβ1-16對傳感器表面的吸附，該傳感器對Aβ的檢測范圍為0.02～1.50 nmol/L，檢測限為10 pmol/L。

Liu等[29]制備了一種不使用抗體的電化學傳感器，將堿性磷酸鹽-半胱氨酸-Prp(95-115)肽固化在金電極上，使用CV技術(shù)特異性檢測Aβ寡聚物?；诙F的電化學氧化還原循環(huán)的外層到內(nèi)層機制用來放大信號，達到更好的靈敏度。該傳感器的檢測限為3 pmol/L，優(yōu)于傳統(tǒng)的類三明治檢測過程。Xia等[30]建立了非標記、無酶的生物傳感器，通過CV監(jiān)測β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶 1(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)，一種天冬氨酸蛋白酶，可促進Aβ的產(chǎn)生，該傳感器也可檢測BACE1的抑制劑。在傳感過程中，Aβ-血紅素復合物在傳感器表面上形成，顯示O2分子的電催化還原。由于抑制劑即IC-50的影響，BACE1的抑制產(chǎn)生了較高的電化學信號。這種方法簡便、成本低，但檢出限相對較高。

Rama等[31]將AuNPS修飾絲網(wǎng)印刷碳電極(screen-printed carbon electrodes,SPCE)，應用競爭免疫技術(shù)檢測Aβ1-42。固化生物素Aβ1-42于電極表面，在那里Aβ與抗Aβ1-42抗體競爭。該傳感器對Aβ的檢測范圍為0.5～500 ng/mL，檢測限為0.1 ng/mL。作者認為這種免疫傳感器簡便，可與傳感設(shè)備集成，有望用于便攜式傳感系統(tǒng)。Liu等[32]開發(fā)了一種敏感和特異的電化學生物傳感器，固化抗Aβ抗體于金電極上，檢測樣品中Aβ1-42和總Aβ。使用鏈霉親和素耦合的堿性磷酸酶和生物素化Aβ來捕獲抗體修飾的電極。隨著與Aβ錨定抗體競爭的Aβ水平增加，獲得的電化學信號減少。該傳感器對CSF樣品中Aβ1-42和總Aβ的檢測限為5 pmol/L。一種基于碳納米管(carbon nanotube，CNT)薄膜的生物傳感器包含金屬半導體場效應晶體管結(jié)構(gòu)(metal-semiconductor field-effect transistor，MESFET)，其中金作為一種柵材料，將抗HRP抗體連同蛋白G或自顯示蛋白A Z結(jié)構(gòu)域固化在金上，CNT-MESFET生物傳感器比CNT-FET敏感，該傳感器對血液樣品Aβ的檢測范圍為1 pg/mL～1 ng/mL，檢測限為1 pg/mL[33]。

電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)也用于檢測Aβ來評估AD。EIS方法是最好的無創(chuàng)分析工具，可用于監(jiān)測蛋白互作、生物傳感、納米毒性和腫瘤藥物相互作用等生物學現(xiàn)象。使用10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-作為氧化還原電位探針，在0.30 V電位下檢測Aβ，該系統(tǒng)通過一種多酚類化合物，即白藜蘆醇與Aβ互作，通過監(jiān)測電荷轉(zhuǎn)移電阻的變化來研究Aβ的聚集和抑制[34]。

一種非標記的EIS傳感器采用生物素標記的細胞朊蛋白(PrPC殘基95-110)，用來特異性檢測Aβ寡聚物。PrpPc(95-110)是一種突觸蛋白，介導神經(jīng)元結(jié)合和Aβ寡聚物毒性。基于生物素/抗生物素與聚合物功能化金-SPE橋，采用逐層方法，將這種蛋白用來制備Aβ阻抗生物傳感器。該傳感器對Aβ的檢測限為0.5 pmol/L。然而這種高靈敏傳感器尚需對重復性和穩(wěn)定性優(yōu)化以便用于臨床[35]。

將金盤與二硫代二丙酸SAM功能化，固定特異抗體(OC和A11)，這種EIS傳感器用來檢測Aβ1-42寡聚物和纖維狀態(tài)的聚集。以此開發(fā)的技術(shù)平臺可檢測抑制Aβ聚集的均三嗪衍生聚合調(diào)節(jié)劑(TAE-1和TAE-2)性能[36]。

通過特異的Aβ抗體固定到納米金顆粒，濺射到陽極氧化鋁納米半球陣列檢測Aβ1-42。該傳感器對血液Aβ的檢測范圍為1～10 pg/mL，檢測限為1 pg/mL。線性方程為電荷轉(zhuǎn)移電阻=29 098×log[Aβ1-42] +90 150，回歸系數(shù)為0.991 6[37]。Lien等[38]基于一次性電化學印刷碳陣列制備了非標記的EIS Aβ生物傳感器，通過優(yōu)化表面化學物質(zhì)(蛋白G)制備的基于SAM-AuNPS的Aβ生物傳感器有更高的敏感性。該傳感器對Aβ的檢測范圍為2.65 nmol/L～2.04 μmol/L，檢測限為0.57 nmol/L。最近基于SPR和EIS的多參數(shù)非標記分析系統(tǒng)用來監(jiān)測感染Aβ1-42的犬腎上皮細胞變化，通過添加非致命劑量的Aβ到傳感器表面，引起細胞基質(zhì)黏附和細胞-細胞緊密連接或細胞骨架重構(gòu)的變化，基于SPR和EIS的方法能夠監(jiān)測產(chǎn)生的雙相細胞反應，可用來研究細胞層上Aβ纖維的動態(tài)變化[39]。

4 展 望

AD給患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟、心理、神經(jīng)等負擔，對社會發(fā)展進步、福利和安全等也帶來巨大挑戰(zhàn)。盡管上述的MRI、PET、SPET、NIR、SPR和 SPRi等神經(jīng)影像學方法都能檢測生物體液中的Aβ來監(jiān)測AD進程和發(fā)病機制，然而由于它們需要復雜設(shè)備和高技術(shù)人員操作，所以這些方法僅限于診所使用。為了克服這些缺點，電化學傳感方法被用來快速、特異和靈敏檢測Aβ，雖然目前僅限于研究使用，但今后如果與納米技術(shù)集成，使設(shè)備微型化，有望應用于AD的即時檢驗。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-11-17；

2016-12-14

國家自然科學基金資助項目(31272574，30972184)

溫涵(1995-)，男，河北石家莊人，合肥工業(yè)大學學生，從事微電子研究。

*通訊作者。E-mail:wlbwhxjp@163.com

R745.7

A

1007-3205(2017)01-0102-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.025