維生素D受體基因Apa1、Taq1多態(tài)性與肺鱗癌易感性的關(guān)系

楊雁鴻，吳劍冬，周文文，侯燕燕，尹端端，王真真

(1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 承德 067000)

維生素D受體基因Apa1、Taq1多態(tài)性與肺鱗癌易感性的關(guān)系

楊雁鴻1，吳劍冬1，周文文1，侯燕燕1，尹端端1，王真真2

(1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北 承德 067000)

目的探討維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)Apa1、Taq1兩基因位點(diǎn)的多態(tài)性與肺鱗癌易感性之間的關(guān)系。方法采集288例肺鱗癌患者和284例健康對(duì)照個(gè)體肘靜脈血5 mL，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)方法，對(duì)VDR Apa1、Taq1兩基因位點(diǎn)行基因型檢測(cè)。 結(jié)果VDR Taq1位點(diǎn)基因多態(tài)性是肺鱗癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其中tt+Tt基因型攜帶者發(fā)生肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的0.556倍(OR=0.556，95%CI=0.393～0.785)。按是否吸煙分層分析：吸煙人群中，Taq1位點(diǎn)基因多態(tài)性在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，tt+Tt基因型攜帶者發(fā)生肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的0.049倍 (OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因攜帶者發(fā)生肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因攜帶者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。而VDR Apa1位點(diǎn)多態(tài)性與肺鱗癌易感性無(wú)相關(guān)性。結(jié)論VDR Taq1基因多態(tài)性與肺鱗癌的遺傳易感性相關(guān)，tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低；t等位基因與患肺鱗癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)；吸煙者中tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。

肺腫瘤；維生素D；基因

肺癌是發(fā)病率高、治療效果差、病死率高、嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其中肺鱗癌在肺癌中占1/3。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)普遍存在于機(jī)體各組織細(xì)胞中，其中淋巴細(xì)胞、結(jié)腸、肺等部位表達(dá)量較高，具有抗腫瘤增殖、使腫瘤體積減小和數(shù)量減少等功能。本研究探討VDR Apa1、Taq1兩基因位點(diǎn)的多態(tài)性與肺鱗癌易感性之間的關(guān)系，旨在找出肺鱗癌的易感因素，為臨床探索提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年12月—2014年12月河北省秦皇島市第一醫(yī)院收治的肺鱗癌患者288例為病例組，均有病理學(xué)診斷依據(jù)，男性170例，女性118例，年齡52～73歲，平均(62.3±10.2)歲。選擇同期健康體檢者284例為對(duì)照組，男性162例，女性122例，年齡50～79歲，平均(63.0±10.3)歲。2組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 記錄研究對(duì)象一般信息、疾病史和有關(guān)臨床資料。采集288例肺鱗癌患者和284例健康對(duì)照個(gè)體肘靜脈血5 mL(經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝處理)，在提取外周血的白細(xì)胞DNA之后，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)方法，對(duì)VDR Apa1、Taq1兩基因位點(diǎn)行基因型檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；危險(xiǎn)因素分析采用Logistic多因素回歸分析肺；以比值比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 Apa1位點(diǎn)基因分型結(jié)果 Apa1位于3′端第8內(nèi)含子區(qū)，其多態(tài)性是由于堿基A→C的突變，PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序證實(shí)(圖1～4)：C等位基因純合子命名為aa基因型，電泳中產(chǎn)生148 bp和190 bp 2個(gè)條帶；A等位基因純合子命名為AA基因型，電泳中產(chǎn)生338 bp 1個(gè)條帶；雜合子命名為Aa基因型，電泳中產(chǎn)生338 bp，148 bp和190 bp 3個(gè)條帶。

2.2 Taq1位點(diǎn)基因分型結(jié)果 Taq1位于3′端第9外顯子區(qū)，其多態(tài)性是由于堿基T→C的突變，PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序證實(shí)(圖5～8)：C等位基因純合子命名為tt基因型，電泳中產(chǎn)生110 bp和228 bp 2個(gè)條帶；T等位基因純合子命名為T(mén)T基因型，電泳中產(chǎn)生338 bp 1個(gè)條帶；雜合子命名為T(mén)t基因型，電泳中產(chǎn)生338 bp、110 bp和228 bp 3個(gè)條帶。

2.3 Logistic回歸分析 選用非條件Logistic回歸分析肺鱗癌的易感危險(xiǎn)因素，以是否發(fā)生肺鱗癌為因變量，以性別(男=1，女=2)、年齡(<60歲=1，≥60歲=2)、吸煙(是=1，否=2)、Apa1(aa =1，Aa=2，AA=3)、Taq1(TT =1，Tt+ tt=2)的基因型為自變量，結(jié)果顯示VDR Taq1位點(diǎn)基因多態(tài)性、吸煙是肺鱗癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。其中tt+Tt基因型攜帶者發(fā)生肺鱗癌的危險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的0.556倍；吸煙者發(fā)生肺鱗癌的危險(xiǎn)是非吸煙者的2.392倍。見(jiàn)表1。

按是否吸煙進(jìn)行分層分析。吸煙人群中，Apa1位點(diǎn)基因多態(tài)性在病例組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.547，P=0.459)；Taq1位點(diǎn)基因多態(tài)性在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.908，P=0.027)， tt+Tt基因型攜帶者發(fā)生肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的0.049倍(OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因、T等位基因在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t等位基因攜帶者肺鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因攜帶者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。非吸煙人群中，Apa1、Taq1位點(diǎn)基因多態(tài)性在病例組與對(duì)照組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.104、0.071，P=0.078、0.790)。見(jiàn)表2，3。

圖1 采用PCR-RFLP技術(shù)方法分析VDR-Apa1單核苷酸多態(tài)性基因型

條帶1：PCR產(chǎn)物；條帶2：AA純合子；條帶3：Aa雜合子；條帶4：aa純合子;M:標(biāo)記物

Figure 1 The genotype analysis of SNP VDR-Apa1 by PCR-RFLP method

圖2 VDR-Apa1 aa位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 2 Sequencing of VDR-Apa1 site aa genotype

圖3 VDR-Apa1 Aa位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 3 Sequencing of VDR-Apa1 site Aa genotype

圖4 VDR-Apa1 AA位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 4 Sequencing of VDR-Apa1 site AA genotype

圖5 采用PCR-RFLP技術(shù)方法分析VDR-Taq1單核苷酸多態(tài)性基因型

條帶1：PCR產(chǎn)物；條帶2：TT純合子；條帶3：Tt雜合子；條帶4：tt純合子;M:標(biāo)記物

Figure 5 The genotype analysis of SNP VDR-Taq1 by PCR-RFLP method

圖6 VDR-Taq1 tt位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 6 Sequencing of VDR-Taq1 site tt genotype

圖7 VDR-Taq1 Tt位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 7 Sequencing of VDR-Taq1 site Tt genotype

圖8 VDR-Taq1 TT位點(diǎn)基因型測(cè)序

Figure 8 Sequencing of VDR-Taq1 site TT genotyp

表1 肺鱗癌易感危險(xiǎn)因素非條件Logistic回歸分析Table 1 Logistic regression analysis of risk factors for SCC

表2 吸煙人群中病例組與對(duì)照組基因型和等位基因比較Table 2 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in smokers (例數(shù)，%)

表3 非吸煙人群中病例組與對(duì)照組基因型和等位基因比較Table 3 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in non-smokers (例數(shù)，%)

3 討 論

肺癌的疾病演變是多基因參與、多因素交互、眾多階段變化相互作用的結(jié)果。吸煙是肺癌的重要致病因素，隨著每天吸煙量的增加以及吸煙年數(shù)的延長(zhǎng)，罹患肺癌的危險(xiǎn)也隨之增加[1]。暴露于相同致病環(huán)境中的個(gè)體，并非都會(huì)發(fā)生肺癌，表明個(gè)體之間罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)存在差異，而這一差異正是由于遺傳因素所決定的。單核苷酸突變、缺失及基因多態(tài)性等遺傳因素決定了不同個(gè)體對(duì)遺傳易感性的差異[2-3]。個(gè)體之間外顯性的不同、疾病易感性和藥物反應(yīng)性不同的最重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)就是存在于整個(gè)基因組的單核苷酸多態(tài)性[4-5]。

維生素D是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)課題，因其除了參與鈣的代謝外，還調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。維生素D在與VDR結(jié)合后具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，抑制其生長(zhǎng)甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6-7]。VDR是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員之一，本質(zhì)為親核蛋白，是一種配體依賴因子[8]，VDR基因的多態(tài)性影響了維生素D效應(yīng)的發(fā)揮。有關(guān)肺癌組織和肺癌前病變VDR表達(dá)的報(bào)道中，VDR在60%肺正常組織和61%肺化生組織中呈中-高度核表達(dá)。在肺癌組織中，VDR核表達(dá)為79%，62%的細(xì)胞質(zhì)缺乏表達(dá)[9]。另外，一項(xiàng)關(guān)于人類癌癥的初步研究，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)測(cè)量VDR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)正常細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，VDR的表達(dá)數(shù)量也在發(fā)生改變，由此推測(cè)這一變化可以作為預(yù)測(cè)疾病發(fā)生的標(biāo)志[10]。

已有薈萃分析顯示：VDR Taq1與患肺癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，吸煙者中CC /TC(相對(duì)于本研究中的tt+Tt)基因攜帶者顯著降低了肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，Taq1基因在肺部致癌因素特別是吸煙患者中起保護(hù)作用[11]；維生素D Apa1 AA基因型與亞洲人患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，Taq1 t等位基因和TT基因型與白種人患肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[6]；Apa1可能是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[12]；Apa1、Taq1酶切位點(diǎn)的多態(tài)性可能與非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的遺傳易感性無(wú)關(guān)[13]；Dogan等[14]學(xué)者對(duì)VDR Apa1、Taq1與肺癌易感性關(guān)系的研究中，證實(shí)Taq1多態(tài)性可能是肺癌患者致病的危險(xiǎn)因素之一，且年齡、吸煙、性別等可能加重這一因素的影響。本研究重點(diǎn)探討肺鱗癌患者與VDR基因Apa1、Taq1可能的相關(guān)性，選用非條件Logistic回歸分析得出VDR Taq1位點(diǎn)多態(tài)性、吸煙是肺鱗癌易感的危險(xiǎn)因素，tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，t等位基因與患肺鱗癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，吸煙者中tt+Tt基因攜帶者顯著降低了肺鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而未得出VDR Apa1位點(diǎn)多態(tài)性與肺鱗癌易感性相關(guān)的結(jié)論。也有研究表明，維生素D基因多態(tài)性可能對(duì)NSCLC晚期患者人群的存活率沒(méi)有真正的影響[15]。既往研究結(jié)論尚有爭(zhēng)議，出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是：①不同地理環(huán)境、不同種族間基因多態(tài)性存在差異；②VDR基因與其他基因存在相互作用，各研究結(jié)果的差異與不同人群連鎖不平衡類型的差異有關(guān)；③選取的樣本較片面，可能造成一定程度的結(jié)果差異。

綜上所述，遺傳因素在肺癌發(fā)病中所起的重要作用，雖然目前未有確定的結(jié)論，但基因位點(diǎn)多態(tài)性重要影響仍舊存在。在今后進(jìn)一步的研究中，應(yīng)考慮多方面因素加以探討，以便為腫瘤的早期診斷、個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Association of vitamin D receptor gene Apa1 and Taq1 polymorphisms with susceptibility to lung squamous cell carcinoma

YANG Yan-hong1， WU Jian-dong1， ZHOU Wen-wen1， HOU Yan-yan1, YIN Duan-duan,WANG Zhen-zhen2

(1.Department of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao City, Hebei Province, Qinhuangdao 066000, Chian; 2.Graduate School, Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective To investigate the relationship between polymorphism of vitamin D receptor(VDR) gene(including Apa1, Taq1) and susceptibility of squamous cell carcinoma of lung cancer(SCC). Methods The blood samples were collected from 288 patients with SCC and 284 healthy individuals. Leukocyte DNA from peripheral blood was extracted. The method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was applied to test the genotype of Apa1, Taq1 in VDR gene. Results VDR Taq1 gene polymorphisms is the risk factor of SCC. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.556 times than the TT genotype carriers(OR=0.556， 95%CI=0.393-0.785). Based on stratification analysis of smoking: In smoking group, there is statistical significance in Taq1 gene polymorphisms. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.049 times than the TT genotype carriers(OR=0.049， 95%CI=0.259-0.929). There is statistical significance in t allele and T allele. The SCC risk of t allele carriers is 0.444 times than the T allele carriers(OR=0.444， 95%CI=0.241-0.817). Conclusion Taq1 polymorphism is related to genetic susceptibility of SCC. The tt+Tt gene reduces the risk of SCC. The t allele is negatively correlated with the risk of SCC. Smokers with tt+Tt gene are significantly reduced the risk of SCC.

lung neoplasms; vitamin D; gene

2016-08-07；

2015-12-05

秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(201101A259)

楊雁鴻(1966-)，女，河北秦皇島人，河北省秦皇島市第一醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事惡性腫瘤診治研究。

R734.2

A

1007-3205(2017)01-0020-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.005