白藜蘆醇對人食管癌EC9706細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機制

李 揚，蘇軍華，楊麗娟，魏宏蓮

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

白藜蘆醇對人食管癌EC9706細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機制

李 揚1，蘇軍華2，楊麗娟3，魏宏蓮2

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的探索白藜蘆醇對人食管癌EC9706細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機制，為白藜蘆醇用于防治食管癌提供理論依據(jù)。方法不同濃度白藜蘆醇處理食管癌EC9706細(xì)胞并作用不同時間，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)微形態(tài)改變；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法測定細(xì)胞增殖水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果白藜蘆醇處理使EC9706細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒增粗增多，胞質(zhì)減少，細(xì)胞變圓變小，形態(tài)呈多樣性；核染色質(zhì)電子密度增加,濃縮并聚集于核膜，部分細(xì)胞膜向外層呈銳角突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性；白藜蘆醇抑制EC9706細(xì)胞增殖，并具有量效和時效關(guān)系；白藜蘆醇處理使EC9706細(xì)胞G0/G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，凋亡率增加，G0/G1期比例增高，而S期和G2/M期比例減少(P<0.01)；4、白藜蘆醇處理使EC9706細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)降低，bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。結(jié)論白藜蘆醇可抑制人食管癌EC9706細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；這種作用可能與其影響凋亡基因bcl-2和bax有關(guān)。

食管腫瘤；白藜蘆醇；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

食管癌是全球癌癥死亡的第六大原因，在中國發(fā)病率也很高。近年來，盡管在手術(shù)、放療、化療治療食管癌方面有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但患者的預(yù)后仍然不佳，5年存活率估計只有15%，2年存活率為20%～30%[1]。尤其是化療藥物常存在不良發(fā)應(yīng)，患者不易耐受。因此，從天然生物中尋找低毒高效的抗腫瘤藥物已成為近年的研究熱點。Jang等[2]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對癌癥各階段具有抑制作用，這使白藜蘆醇成為癌癥領(lǐng)域研究的熱點之一。目前認(rèn)為白藜蘆醇具有多種生物活性，主要包括抗炎抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)、生長抑制活性、雌激素樣活性等抗腫瘤作用。但其對食管癌是否具有防治作用尚未明確。本研究采用人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞作為研究對象，檢測白藜蘆醇對其增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探討作用機制，旨在為白藜蘆醇用于食管癌防治提供實驗依據(jù)，報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 選取由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供的人食管癌EC9706細(xì)胞株；白藜蘆醇、碘化丙啶購于美國Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗單克隆抗體、鼠抗人bcl-2蛋白、鼠抗人bax蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；MTT、RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、二甲基亞砜購自美國Promega公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；余試劑純由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

1.2 主要儀器 普通光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡(LH50A型)購自日本OLYMPUS公司；透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司；CO2培養(yǎng)箱(TC 2323型)購自美國SHELDON公司；流式細(xì)胞儀(ACS420型)購自美國B.D公司；全自動定量酶標(biāo)儀購自奧地利Anthos公司；超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團安泰公司；高速離心機(SCR20B型)購自日本HITACHI公司；全自動高壓蒸汽消毒器(MLS-3750型)購自日本三洋公司；-80 ℃超低溫冰柜(Universal)購于德國Hettich公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(鏈霉素 100 mg/L，青霉素 1×105U/L)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，約3 d傳代1次，最后選取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察EC9706細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞接種在放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上，并于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期后，分別加入含或不含有白藜蘆醇的新鮮培養(yǎng)液，使白藜蘆醇終濃度分別為0、100、500、1 000、2 000 mmol/L，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72 h時定時觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，分別記錄各不同濃度及不同時間的細(xì)胞生長抑制率。

1.5 透射電子顯微鏡觀察EC9706細(xì)胞微形態(tài) 加入終濃度分別為0、500 mmol/L的白藜蘆醇培養(yǎng)液于對數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞培養(yǎng)液中，使細(xì)胞分散良好，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后收集細(xì)胞，固定(2.5%戊二醛)，后固定(10 g/L鋨酸)，脫水(丙酮系列)，包埋(Epon821環(huán)氧樹脂)，切片(KB-1型超薄切片機)，雙重染色(醋酸鈾與檸檬酸鉛)，然后在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞微形態(tài)變化。

1.6 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(methylthiazoliltetracolium colorimetric enzyme reactions trace， MTT)法試驗 選取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液(濃度為1×106/mL)，然后分5組將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)12個復(fù)孔，每孔200 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，隨機選4組分別加入含白藜蘆醇 100、500、1 000、2 000 mmol/L的培養(yǎng)液，剩余1組為對照組，含白藜蘆醇0 mmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h。并在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL，濃度為5 g/L的 MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，然后在每孔加入150 μL 二甲基亞砜，避光振蕩 15 min。自動酶標(biāo)儀波長 492 nm檢測各孔光密度值(optical density,OD 值)。結(jié)果判定：抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 白藜蘆醇終濃度分別為0、500和1 000 mmol/L，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一次性離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用冰塊上預(yù)冷的無菌PBS漂洗2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，分散細(xì)胞(70%預(yù)冷的乙醇)，固定過夜(4 ℃)。過夜后的細(xì)胞，離心(1 500 r/min，10 min)，用PBS 漂洗1次，再以生理鹽水洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，以碘化丙錠染液(PI：50 mg/L，Triton X-100：1.0%，RNase A：10 mg/L)，在4 ℃環(huán)境下避光染色30 min，染色完成后過濾。用 488 nm 激發(fā)光在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞 DNA 的含量，并對各樣品進(jìn)行分析，計算細(xì)胞凋亡率(MuticycleAV 軟件)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)測定白藜蘆醇對凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax含量的影響 分別收集白藜蘆醇終濃度為0、500和1 000 mmol/L的細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5 min)，分散細(xì)胞(70%預(yù)冷的乙醇)，固定過夜(4 ℃)。過夜后的細(xì)胞，離心(1 500 r/min，10 min)，用PBS 漂洗1次，再以生理鹽水洗滌2次， 離心(1 500 r/min，5min)，分別加入的bax鼠抗人單克隆抗體和0.1 mL的bcl-2，室溫孵育 30 min，PBS 洗滌1次，加入0.1 mL羊抗鼠 FITC-IgG二抗，室溫孵育 30 min(避光)，然后以PBS洗滌未結(jié)合的多余熒光抗體，加入0.1 mL PBS，過濾(500目銅網(wǎng))，然后用488 nm激發(fā)光在流式細(xì)胞儀上檢測，并且設(shè)有陰性對照及一抗或二抗的本底對照。最后使用Expo 32ADC 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以熒光指數(shù)表示蛋白定量表達(dá)。計算公式為：熒光指數(shù)=樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察EC9706細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 不同濃度白藜蘆醇作用于EC9706細(xì)胞24 h后即可見少量細(xì)胞變圓，48 h后可見細(xì)胞之間距離增大，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，72 h后越來越多的細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞脫落然后懸浮于培養(yǎng)基中，在少數(shù)貼壁生長的細(xì)胞中可見細(xì)胞膜破裂，并呈細(xì)胞壞死狀。

2.2 透射電鏡下觀察EC9706細(xì)胞的微形態(tài)學(xué)變化 白藜蘆醇 500 mmol/L作用于EC9706細(xì)胞72 h后，部分細(xì)胞膜向外層呈銳角突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性，可見核染色質(zhì)濃縮邊集于核膜，電子密度增加(圖1)。

圖1 EC9706細(xì)胞的微形態(tài)學(xué)變化

A.細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有空泡化變性;B.核染色質(zhì)濃縮邊集于核膜

Figure 1 The micro morphological changes of EC9706 cells

2.3 白藜蘆醇抑制EC9706細(xì)胞增殖 在EC9706細(xì)胞增殖過程中，不同濃度的白藜蘆醇均可產(chǎn)生抑制作用，表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系，即隨著白藜蘆醇濃度的增加，細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增加(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞增殖的抑制率也逐漸增加(P<0.05)，見表1。

白藜蘆醇濃度(mmol/L)抑制率24h48h72hFP100 7．35±2．119．79±2．0912．85±2．18☆▲7．2820．002500 18．45±2．0527．85±2．05?☆32．72±2．19?☆▲28．2240．000100038．88±3．05?#41．60±3．13?#53．66±3．05?#☆▲28．3910．000200054．66±4．16?#△68．34±4．25?#△☆80．55±4．22?#△☆▲49．3260．000F86．728130．722170．824P0．0000．0000．000

*P<0.05與100 mmol/L組比較 #P<0.05與500 mmol/L組比較 △P<0.05與1 000 mmol/L組比較 ☆P<0.05與24 h比較

▲P<0.05,與48 h比較(SNK-q檢驗)

2.4 白藜蘆醇對EC9706細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax表達(dá)的影響 白藜蘆醇500、1 000 mmol/L作用于EC9706細(xì)胞72 h后，隨著各組白藜蘆醇濃度增加，在細(xì)胞周期中G0/G1期的比例逐漸增加，S期和G2/M期的比例逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);隨著各組白藜蘆醇濃度增加，凋亡率和bax的熒光指數(shù)逐漸增加，bcl-2的熒光指數(shù)逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

白藜蘆醇濃度(mmol/L)細(xì)胞周期(%)G0/G1SG2/M凋亡率(%)熒光指數(shù)baxbcl?20 42．0±1．2346．3±0．4811．8±0．201．31±1．031．00±0．01100±12 500 59．5±1．28?38．3±0．18?9．3±0．33?10．54±1．422．37±1．0675±16?100068．5±1．69?#22．6±0．27?#8．8±0．05?19．85±1．68?#5．54±3．84#69±18?F 114．613320．03613．15727．3089．96351．322P 0．0000．0000．0000．0000．0470．000

*P<0.05與0 mmol/L組比較 #P<0.05與500 mmol/L組比較(SNK-q檢驗)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測EC9706細(xì)胞凋亡率結(jié)果

A.對照組細(xì)胞；B.500 mmol/L白藜蘆醇作用于EC9706細(xì)胞；C.1 000 mmol/L白藜蘆醇作用于EC9706細(xì)胞

Figure 2 Apoptotic rate of EC9706 cells detected by flow cytometry

3 討 論

芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚類化合物，有順、反2種構(gòu)型，其中反式是穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因首先在歐洲白藜中被提取出來而得名[3]?，F(xiàn)階段約在21科31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆,白藜蘆醇化學(xué)名稱為芪三酚，分子式為 C14H12O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)為 3,5,4′-三羥基二苯乙烯(3,5,4′-trihydroxy-stilbene) ，相對分子質(zhì)量是228.2。首次從毛葉藜蘆的根部提取得到一種含有醇，其中以虎杖、葡萄、花生中含量最高。白藜蘆醇具有抗腫瘤活性，抗自由基、保護(hù)心血管、抗炎、抗激素活性、抗病毒、抗菌等方面多種生物活性作用。

食管癌預(yù)后較差，多數(shù)患者在確診后1～2年內(nèi)死亡， 20%的患者能生存 5 年以上[4]。雖然近年來其治愈率有了很大提高，但總有相當(dāng)患者在就診時或治療過程中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致治療失敗。河北省是食管癌的高發(fā)區(qū)，尤以邯鄲的涉縣高發(fā)。目前在無更有效治療手段條件下，預(yù)防是減少其發(fā)生率的有力手段。尋求一種高效低毒的抗腫瘤藥物是治療食管癌的當(dāng)務(wù)之急。白藜蘆醇作為一種植物提取素具有天然低毒的特性。國內(nèi)外研究證實其作為腫瘤抑制劑在多種腫瘤中均具有高效性，包括肝癌、胃癌、血液病、前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等[5-10]。但是，目前對白藜蘆醇在食管癌的抗腫瘤中作用的研究尚少。本研究旨在進(jìn)一步證實白藜蘆醇在抗食管腫瘤中同樣具有一定的作用，以便為白藜蘆醇今后應(yīng)用于食管癌的治療提供相關(guān)實驗證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇對EC9706細(xì)胞的作用呈時間-劑量依賴，但是在低濃度(100 mmol/L)時，細(xì)胞生長抑制率差別不大；在白藜蘆醇同一濃度下，隨著作用時間的延長白藜蘆醇對EC9706細(xì)胞的抑制作用增強，大于72 h高濃度白藜蘆醇作用下EC9706細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶中，無貼壁生長(細(xì)胞死亡)。以上證明了白藜蘆醇在一定作用時間和一定濃度范圍內(nèi)，對食管癌細(xì)胞生長增殖具有抑制作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多抗腫瘤藥物的作用除抑制腫瘤細(xì)胞生長外，還可誘導(dǎo)其凋亡[11-12]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，輔以透射電鏡微觀觀察不同濃度白藜蘆醇作用于EC9706細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示對照組未發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞，而白藜蘆醇500、1 000 mmol/L組細(xì)胞凋亡明顯；在DNA直方圖中，也可以觀察到較為明顯的亞二倍體凋亡峰，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；透射電鏡鏡下觀察，白藜蘆醇500 mmol/L組可見凋亡細(xì)胞特征，而對照組細(xì)胞生長良好。表明白藜蘆醇可提高食管癌EC9706細(xì)胞凋亡率，使EC9706細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。因此，白藜蘆醇抗食管腫瘤的主要機制可能是白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡。

Bcl-2是一種跨膜蛋白，存在于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[13]。雖然bcl-2基因曾被認(rèn)為是一種原癌基因，但隨后的大量實驗結(jié)果卻表明該基因本身對細(xì)胞增殖沒有影響，也不能促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。bax相對分子質(zhì)量約為21 000，bax基因長約4.5 kb，bax是bcl-2的抑制因子，其與bcl-2具有21%的同源性[14]。bax和bcl-2在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮的作用相反，二者的比例發(fā)生變化，可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2和bax在前列腺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，并且與食管癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[15-20]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)bcl-2和bax的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以明顯上調(diào)bax的表達(dá)及下調(diào)bcl-2的表達(dá)，這可能是白藜蘆醇誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡的分子機制之一。

綜上所述，白藜蘆醇能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，使其細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；白藜蘆醇可能通過影響凋亡基因bcl-2和bax，從而抑制細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。因此，白藜蘆醇可能成為防治食管癌的有效藥物之一用于臨床治療食管癌。

[1] Gao J,Zou Z,Gao J,et al. Increased expression of HMGB3:a novel independent prognostic marker of worse outcome in patients with esophageal squamous cellcarcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(1):345-352.

[2] Jang M,Cai L,Udeani GO,et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol,a natral product derived from grapes[J]. Scinence,1997,275(5297):218-220.

[3] Ferrero ME,Bertelli AA,Pellegatta F,et al. Phytoalexin resveratrol(3-4'-5-trihydroxystilbene) modulates granulocyte and monocyte endothelial adhesion[J]. Transplant Pro,1998,30(8):4191-4193.

[4] Zhang Y. Epidemiology of esophageal cancer[J]. World J Gastroenterol，2013，19(34):5598-5606.

[5] Fulda S,Debatin KM. Sensitization for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by the chemopreventive agent resveratrol[J]. Cancer Res,2004,64(1):337-346.

[6] Fulda S,Debatin KM. Resveratrol-mediated sensitisation to TRAIL- induced apoptosis depends on death receptor and mitochondrial signaling[J]. Fur J Cancer,2005,41(5):786-798.

[7] Rigolio R,Miloso M,Nicolini G,et al. Resveratrol interference with the cell cycle protects human neuroblastoma SH-SY5Y cell from paclitaxel induced apoptosis[J]. Neurochem Int,2005,46(3):205-211.

[8] Proviciali M,Re F,Donnin A,et al. Effect of resveratrol on the development of spontaneous mammary tumors in HER-2/neu transgenic mice[J]. Int J Cancer,2005,115(1):36-45.

[9] Kubota T,Uemura Y,Kobayashi M,et al. Combined effects of resveratrol and paclitaxel on lung cancer cells[J]. Anticancer Res,2003,23(5A):4039-4046.

[10] Sexton E,van Themsche C, LeBlanc K, et al. Resveratrol interferes with AKT activity and triggers apoptosis in human uterine cancer cells[J]. Mol Cancer,2006,5:45.

[11] Moore J,Boswell S,Hoffman R,et al. Mutant H-rasover- expression inhaibits a random apoptosis nuclease in myeloid leukemia cells[J]. Leuk Res,1993,17(8):703-709.

[12] Evan G,Littlewood T. A matter of life and cell death[J]. Science,1998,281(5381):1317-1322.

[13] Shimizu S,Tsujimoto Y. Proapoptotic BH3-only Bcl-2 family members induce cytochrome C release but not mitochondrial membrance potentical loss,and do not directly modulate voltage-dependent channel activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(2):577-582.

[14] Zhou HB,Yan Y,Sun YN,et al. Resveratrol induces apoptosis in human esophageal carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol,2003,9(3):408-411.

[15] Stevenson HS,Fu SW,Pinzone JJ,et al. BP1 transcriptionally activates bcl-2 and inhibits TNF alpha-induced cell death in MCF7 breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res,2007,9(5):R60.

[16] Li Y,Desilvio M,Li R,et al. Bcl-2 and bax expression and prostate cancer outcome in men treaten with radiotherapy in Radiattion Therapy Oncology Group protocol 86-10[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,2006,66(1):25-30.

[17] Batsi C,Markopoulou S,Kontargiris E,et al. Bcl-2 blocks 2-methoxyestradiol induced leukemia cell apoptosis by a p27(Kip1)-dependent G1/S cell cycle arrest in conjunction with NF-κB activation[J]. Biochem Pharmacol,2009,78(1):33-44.

[18] Sakinah SA,Handayani ST,Hawariah LP. Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2 ratio[J]. Cancer Cell Int,2007,7:4.

[19] Kolluri SK,Zhu X,Zhou X,et al. A short Nur77-derived peptide converts Bcl-2 from a protector to a killer[J]. Cancer Cell,2008,14(4):285-298.

[20] Yu W,Fu YC,Wang W. Cellular and molecular effects of resveratrol in health and disease[J]. J Cell Biochem,2012,113(3):752-769.

(本文編輯：許卓文)

Effects of resveratrol on biological behavior of human esophageal cancer cell EC9706 and its mechanism

LI Yang1, SU Jun-hua2, YANG Li-juan3, WEI Hong-lian2

(1.Department of Medical Service, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2.Department of Laboratory, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 3.Department of Immunology, School of Basic Medical, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective To explore the effects of resveratrol on biological behavior of human esophageal cancer cell EC9706 and its mechanism, and to provide a theoretical basis for the clinical application of resveratrol to prevent or treat esophageal cancer. Methods Different concentrations of resveratrol were used to treat EC9706 cells for different time. Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope. Intracellular micro-morphological changes were observed under electron microscope. Methylthiazoliltetracolium colorimetric enzyme reactions trace method were used to determinate cell proliferation level. Flow cytometry method was used to detect cell cycle distribution and the expression of apoptosis related protein. Results Resveratrol treatment increased and thickened particles in EC9706 cytoplasm, reduced the cytoplasm, rounded cells and made cells more smaller and the cell shape more diversity, and made the nuclear chromatin condense on the boundary of the nuclear envelope. The electron density was increased, part of the cell membrane bulge was outward and form an acute angle. There was vacuoles degeneration in the cytoplasm. Resveratrol inhibited EC9706 cell proliferation in a dose and time-dependent manner. Resveratrol made sub-diploid nuclear peak(apoptotic peak) appear before G0/G1phase in EC9706 cells, and increased the rate of apoptosis together with proportion of G0/G1phase. In contrast, resveratrol decreased the S and G2/M phase fraction(compared with the control group,P<0.01). Resveratrol treatment also decreased expression of bcl-2 protein, and increased expression of bax protein(compared with the control group,P<0.01). Conclusion Resveratrol can inhibit the proliferation and induces apoptosis of EC9706 cells, and make the cell cycle arrest in G0/G1phase. This effect may be related to apoptosis gene bcl-2 and bax.

esophageal neoplasms; resveratrol; cell proliferation; apoptosis

2016-04-01；

2016-10-25

李揚(1977-)，男，河北衡水人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主管檢驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗學(xué)研究。

R735.1

A

1007-3205(2017)01-0011-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.003