奶牛隱性乳房炎的診治及主要病原菌的藥敏試驗

王楠楠 ， 梁 曉 ， 濮思源 ， 張啟迪

(青島農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 山東 青島 266109)

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學、微生物等病原因子的刺激所致的一種炎癥反應。我國奶牛乳房炎的發(fā)病率一般在20%～75%，其中臨床型乳房炎發(fā)病率在9.7%～55.6%，隱性乳房炎發(fā)病率卻高達20%～40%[1]。乳房炎導致產奶量和奶質量下降，直接給我國的奶牛業(yè)、乳制品企業(yè)和社會帶來了巨大的經濟損失。流行病學研究表明，乳房炎在生殖性能上也有負面影響，臨床型乳房炎間接損害奶牛的生殖性能，使奶牛空懷天數增加、受胎率下降、早期流產比例增加、不規(guī)律的間隔發(fā)情[2]，由此造成的間接經濟損失更是難以估量。當乳汁受到隱性乳房炎致病因子侵害后，乳腺分泌細胞受到破壞，并且乳汁中含有大量的病原微生物及其產生的毒素，人類食用后可引起發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、脫水和過敏等癥狀。

近幾年，在政府優(yōu)惠政策的支持下，奶牛養(yǎng)殖業(yè)逐漸邁入產業(yè)化發(fā)展渠道，生產規(guī)模不斷擴大。臨床型乳房炎得到了很好的控制，而隱性乳房炎對人類經濟和健康卻帶來了挑戰(zhàn)。本研究對濰坊某牛場隱性乳房炎進行系統調查，并對病原菌進行分離鑒定和藥物敏感性試驗，探明乳房炎對藥物的耐藥狀況，采用敏感藥物治療，并提出相應防治措施，對控制奶牛隱性乳房炎提供了相應的技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基 美藍染液，購自上海紀寧試劑有限公司；AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，購自美國FERA Animal Health動保公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；MH培養(yǎng)基和MH肉湯，購自青島海博生物技術有限公司；胎牛血清，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗動物 濰坊市某奶牛場，規(guī)模4 200頭奶牛，其中正在泌乳期的奶牛2 000頭，后備牛(青年牛、育成牛、犢牛)為2 200頭。

1.3 儀器設備 生物潔凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、光學顯微鏡：上海躍進醫(yī)療機械廠。

1.4 采樣及細菌培養(yǎng) 采樣前應對雙手進行消毒，佩戴手套，用酒精棉徹底清潔乳頭末端和乳頭孔處，直至棉球表面沒有臟物為止，收集時需先棄掉頭幾把奶(3～5把)；采樣時保持采樣瓶45°傾斜，乳頭不要接觸瓶口。若一頭奶牛需要多個乳區(qū)采樣，消毒按照由里往外的順序消毒，而采樣則按照由前往后的順序；奶樣量應為采樣瓶的二分之一到三分之二之間。采用顯微鏡直接體細胞計數法(DMSCC)，如每毫升乳汁體細胞數超過 50 萬即可認為是隱性乳房炎[3]，但是有關的規(guī)定和標準卻不盡相同，一般在20萬～50萬以內為安全。將體細胞數超過50萬的奶樣進行涂AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿，分別用3個無菌棉簽對一份奶樣在診斷皿的3個區(qū)域涂抹。將診斷皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察記錄結果。

1.5 AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿診斷標準 一區(qū)革蘭陰性菌：藍色為克雷伯菌，粉色為大腸桿菌，白色菌群但介質變黃為假單胞菌屬。二區(qū)革蘭陽性鏈球菌屬：深藍色為乳房鏈球菌，淺藍色為鏈球菌屬，紫色為腸球菌屬，薰衣草色為乳酸乳球菌屬。三區(qū)革蘭陽性葡萄球菌數：白色為葡萄球菌數，粉色為金黃色葡萄球菌，藍色為溶血葡萄球菌。

1.6 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)2012年推薦的抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準進行藥敏試驗[5]。將鏈球菌屬和克雷伯菌挑取單菌落接種到MH肉湯培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)，取200 μL菌液用涂布器在MH培養(yǎng)基(鏈球菌要加入5%血清)上涂勻，用鑷子放置藥敏紙片并輕壓，放置10 min。于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，記錄結果。

1.7 治療 選擇對菌株敏感的藥物進行乳頭注射治療。對鏈球菌屬引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素，對克雷伯菌引起的隱性乳房炎乳頭注射頭孢噻呋，凝固酶陰性葡萄球菌感染的乳房炎先對其進行排空乳區(qū)法，進而乳頭注射孢氨芐和卡那霉素。其他細菌引起的隱性乳房炎均采用乳頭注射頭孢氨芐和卡那霉素。在對大腸桿菌感染的乳房炎進行排空乳區(qū)法，使其自愈。一個療程為 4 d，每個療程統計治愈率，其中在前一個療程中治愈的，下一個療程不繼續(xù)給藥，4個療程無法治愈的定為瞎乳區(qū)(乳區(qū)完全沒奶或豆腐渣樣奶或清水奶)。

1.8 奶牛隱性乳房炎治療后檢測方法 治療結束后，進行CMT試驗，檢測藥物的治愈率。擠奶前用溫水清洗治療后的乳區(qū)，棄掉2把乳汁，然后每個乳區(qū)取2 mL奶樣置于CMT診斷盤中待檢測，每2 mL乳汁中加入2 mL的CMT診斷液，充分混合，根據凝集反應判斷治愈情況。

1.9 奶牛隱性乳房炎治愈標準[5]。

表1CMT試驗的判定標準

判定指標乳汁凝集反應體細胞總數(萬/mL)陰性無變化0～20弱陽性部分形成凝膠狀40～150陽性全部呈凝膠狀,回旋搖動時凝塊集中在中央,停止搖動時呈凸凹狀附于底部。80～500強陽性全部呈凝膠狀并保持原狀,并固著于底部。>500

2 結果

奶牛場中泌乳奶牛為2 000頭，通過顯微鏡體細胞直接計數法對2 000頭奶牛的每個乳區(qū)進行體細胞計數，其中121頭奶牛中的253個乳區(qū)的體細胞超過50萬。奶牛隱性乳房炎發(fā)病數為121頭， 發(fā)病率6.33%，發(fā)病乳區(qū)數為253。奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率結果如表2所示。

表2奶牛隱性乳房炎的發(fā)生率

檢測奶牛/頭發(fā)病數/頭陽性率/%發(fā)病乳區(qū)20001216.33253

在253例奶樣中鏈球菌屬檢出率最高為 46.24%，大腸桿菌為32.41%，克雷伯菌為16.60%，金黃色葡萄球菌僅有1例，AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結果具體見表3。

主要病原菌藥敏試驗結果見表4。對濰坊某奶牛場中造成奶牛隱性乳房炎的主要細菌鏈球菌屬、克雷伯菌進行藥敏試驗，結果中顯示鏈球菌屬對頭孢氨芐、頭孢噻呋、卡那霉素敏感，敏感率分別為82.05%、70.08%、67.52%，對氨芐青霉素耐藥，耐藥率為84.62%；克雷伯菌對頭孢噻呋敏感，敏感率為73.81%，對氨芐青霉素、紅霉素耐藥，耐藥率分別為71.43%、61.90%。

表3AccuMast乳房炎病原菌快速診斷皿結果

病菌菌株數菌株比例/%鏈球菌屬11746.24大腸桿菌8232.41克雷伯菌4216.60凝固酶陰性葡萄球菌41.58假單胞菌屬20.79腸球菌屬20.79乳酸乳球菌屬20.79金黃色葡萄球菌10.40其他菌屬10.40

對奶牛隱性乳房炎治療結果如表5所示：對鏈球菌屬治療1個療程時治愈率為77.78%，2個療程時治愈率為88.89%，3個療程時治愈率為90.60%，4個療程時治愈率為91.45%；對克雷伯菌治療1個療程時治愈率為30.95%，2個療程時治愈率為38.10%，3個療程時治愈率為40.48%，4個療程時治愈率為40.48%；對凝固酶陰性葡萄球菌治療1個療程時治愈率為25%，2個療程時治愈率為50%，3個療程時治愈率為50%，4個療程時治愈率為75%；對其他菌屬治療1個療程時治愈率為57.14%，2個療程時治愈率為85.71%，3個療程時治愈率為85.71%，4個療程時治愈率為85.71%。

表4主要病原菌藥敏試驗結果

表5藥物治療結果

病菌乳區(qū)數治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%治療時間治愈率/%鏈球菌屬1174d77.78(91/117)8d88.89(104/117)12d90.60(106/117)16d91.45(107/117)克雷伯菌424d30.95(13/42)8d38.10(16/42)12d40.48(17/42)16d40.48(17/42)凝固酶陰性葡萄球菌44d25(1/4)8d50(2/4)12d50(2/4)16d75(3/4)其他菌屬74d57.14(4/7)8d85.71(6/7)12d85.71(6/7)16d85.71(6/7)

3 討論

造成濰坊某奶牛場奶牛乳房炎的主要病原菌為鏈球菌屬、 克雷伯菌和大腸桿菌。濰坊某奶牛場中金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎僅有一例，在濰坊地區(qū)其他奶牛養(yǎng)殖場中由金黃色葡萄球菌感染的奶牛隱性乳房炎卻高達10%。大腸桿菌性奶牛乳房炎多見于高產奶牛及產后泌乳高峰時期的奶牛，大腸桿菌主要來源于牛糞及其污染的環(huán)境，從損傷的生殖道進入血液或淋巴而引起感染。對于大腸桿菌沒有采用抗生素治療的原因是，大腸桿菌死亡，細胞壁破裂會釋放內毒素，細胞內毒素在體內，會誘發(fā)其他一系列病理反應。有研究者認為抗生素誘導釋放的內毒素不僅是因為抗生素殺滅大腸桿菌后，大腸桿菌壁破裂而釋放出來的，可能是細菌在抗生素作用下通過某些機制逐漸釋放出來[6]。藥敏試驗結果顯示，鏈球菌屬對頭孢噻呋、頭孢氨芐、卡那霉素敏感，克雷伯菌對頭孢噻呋敏感。由于奶牛場中抗生素的濫用，使得一些病原菌產生耐藥性，因而單一藥物的治療很難取得理想效果，在治療過程中采用聯合用藥會產生更好的療效。

臨床型乳房炎造成的損失是顯而易見的；而隱性乳房炎由于缺乏明顯癥狀，常被人們所忽略。據統計我國奶牛業(yè)每年因乳房炎引起的損失達135億人民幣，其中70%的損失是來自隱性乳房炎引起的產奶量降低[7]。根據濰坊某奶牛場的實際情況，按照操作規(guī)程使用大小合適的杯組和運行正常的設備進行擠奶操作；擠奶時應佩戴乳膠手套，消毒要及時；潮濕或被糞便污染的墊料應及時清除，保持奶牛飼養(yǎng)環(huán)境的干凈、干燥；確保日糧中有足量的維生素E和硒；定期進行奶牛隱性乳房炎的檢測，并進行合理的藥物治療，可以有效的預防和治療奶牛乳房炎，降低病情的危害，提高企業(yè)經濟效益。

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[3] Little R B. Mastitis[M]. New York and London: W. NBorine, 1946.

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[5] 李宏濱. 三個與奶牛乳房炎抗性相關基因的克隆及比較基因組學分析[D]:北京： 中國農業(yè)科學院; 2008.

[6] 王麗平, 郭永剛, 史曉麗, 等. 不同抗生素對大腸桿菌形態(tài)的影響及其誘導游離內毒素的釋放[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2004, 24(6):596-597.

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