應(yīng)用多重Taqman-LNA熒光PCR同時(shí)檢測肉制品中豬雞鴨源性成分

許如蘇 ， 紀(jì)玲珍 ， 黃 帥 ， 周廣彪 ， 魏 霜 ， 段建發(fā)

(汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 汕頭 515031)

盡管在2013年歐洲馬肉丑聞之后，我國相關(guān)部門開展了打擊肉制品摻假整治活動(dòng)，但由于不同肉種存在明顯的物價(jià)差異，利益的驅(qū)使導(dǎo)致肉制品“摻假使假”現(xiàn)象難以杜絕，肉制品摻假時(shí)有報(bào)道，常見以豬肉、鴨肉等低價(jià)肉摻入甚至代替高價(jià)的牛羊肉[1-2]，并出現(xiàn)多肉種摻假趨勢(shì)[3]。打擊肉制品摻假工作任重而道遠(yuǎn)。

基于蛋白質(zhì)的ELISA方法和基于核苷酸序列的分子生物學(xué)方法是肉種鑒別的主要方法。其中，具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)勢(shì)的PCR技術(shù)已得到廣泛的應(yīng)用[4-6]，有的已成為肉種鑒別的標(biāo)準(zhǔn)方法[7-9]，但除了SN/T 2051-2008[8]等少數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法采用雙重實(shí)時(shí)PCR方法同時(shí)檢測不同肉種外，SN/T 2727-2010等多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[7、9-10]均為單一肉種檢測方法，顯然，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法尚難以滿足肉制品打假的高通量快速鑒別需要。

本研究針對(duì)常見摻假肉種豬、雞、鴨，利用Taqman-LNA熒光探針可提升Tm值，增加探針雜交的特異性[11]和設(shè)計(jì)靈活性[12]等優(yōu)點(diǎn)，克服多重?zé)晒釶CR普通存在的不同目標(biāo)序列擴(kuò)增效率不一致等問題，建立了可同時(shí)檢測上述3種肉源性成分的多重?zé)晒釶CR方法，達(dá)到了快速、經(jīng)濟(jì)、高效的檢測目的。

1 材料與方法

1.1 樣品 從農(nóng)貿(mào)市場、飲食店和超市購買牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、兔等動(dòng)物肌肉和牛肉丸、牛肉粒、牛肉片、羊肉串、羊肉丸、羊肉片、肉腸等肉制品。

1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀(BIO-RAD， CFX96)，樣品破碎系統(tǒng)(北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司，GT200)；Probes Master 2×conc.(Roche公司)；核酸提取(離心柱法)試劑盒(達(dá)安公司)。

1.3 樣品制備和DNA提取 稱取樣品10 g，剪碎后按1∶4加入去離子水，制成肉漿，取50 μL按核酸提取試劑盒說明書提取DNA。

1.4 引物探針的設(shè)計(jì)與合成標(biāo)記 從GenBank上查找并下載豬、雞、鴨線粒體基因組全序列，參考近年文獻(xiàn)發(fā)表的相關(guān)序列，使用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出種屬相關(guān)的保守序列，使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物探針，交上海輝睿生物科技有限公司合成。序列見表1。

表1 引物探針序列

1.5 多重Taqman-LNA熒光PCR方法的建立 按常規(guī)方法分別建立檢測豬雞鴨的單重Taqman-LNA熒光PCR方法。在此基礎(chǔ)上組建多重方法，通過優(yōu)化各引物探針濃度和退火溫度，驗(yàn)證方法的特異性和檢測限，最后確定多重方法的反應(yīng)體系為20 μL，其中Probes Master 2x conc溶液10μL，豬、雞、鴨的引物終濃度分別為0.6 μmol/L、0.3 μmol/L、0.8 μmol/L，探針終濃度分別為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4μmol/L，DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 8 min；95 ℃ 8 s，59 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 對(duì)市售肉制品的檢測及陽性結(jié)果的驗(yàn)證 用多重方法對(duì)市售肉制品進(jìn)行檢測，同時(shí)采用SN/T 2051-2008，SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013對(duì)檢出動(dòng)物源性成分與標(biāo)簽不符樣品進(jìn)行檢測驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn) 與從牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、驢、兔等動(dòng)物肌肉提取的DNA的試驗(yàn)結(jié)果，相應(yīng)熒光通道僅與對(duì)應(yīng)的肉種出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，與其他肉種無典型擴(kuò)增。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)送上海輝睿生物科技有限公司測序，結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2 敏感性試驗(yàn) 多重方法對(duì)豬、雞、鴨的檢測限均達(dá)到肉含量的0.001%。結(jié)果見表2。擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見圖1。

表2 多重Taqman-LNA熒光PCR方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：*敏感性試驗(yàn)為3次重復(fù)試驗(yàn)；**3次重復(fù)Ct<35，且有典型擴(kuò)增曲線

圖1 多重Taqman-LNA熒光PCR敏感試驗(yàn)擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：擴(kuò)增曲線從左到右分別為肉含量100%～0.0001%。平線為陰性對(duì)照

2.3 對(duì)市售樣品的檢測結(jié)果及對(duì)陽性結(jié)果的驗(yàn)證 共檢測市售樣品170份，檢出標(biāo)簽標(biāo)示以外肉種成分的樣品共42份，其中豬肉和鴨肉各19份，同時(shí)檢出豬、雞、鴨肉2份，詳見表2。樣品不合格率為24.7%。從表2可看出，豬肉和鴨肉是主要的摻假肉種，從肉種看，摻假頻率較高的樣品為牛羊肉制品；從加工方式看，摻假頻率較高的樣品為丸類制品和調(diào)味較重的肉制品。

對(duì)檢出肉種成分不符的42份樣品，分別采用SN/T 2051-2008 ，SN/T 2978-2011 和SN/T 3731.5-2013對(duì)其中的豬、雞、鴨源性成分進(jìn)行檢驗(yàn)確證，結(jié)果除1份香酥牛肉丁和1份麻辣牛肉未檢出鴨源性成分，與多重方法檢測結(jié)果不符外，其余檢驗(yàn)結(jié)果與多重方法一致，多重方法的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的符合率為95.5%。

表2 市售肉制品檢測結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)建立的多重Taqman-LNA熒光PCR方法能同時(shí)檢測肉制品中的豬、雞、鴨源性成分，具有良好的特異性和敏感性，多成分同步檢測既節(jié)約試劑、耗材，降低檢測成本，又節(jié)省時(shí)間，快速便捷。與何瑋玲等[13]應(yīng)用多重 PCR 同時(shí)鑒定豬、牛、羊、雞相比，操作更簡便，也更快速安全，既無需電泳和觸毒，還可免去對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的測序證實(shí)。與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本多重方法顯著提高了檢測效率和檢測通量，可滿足打擊肉制品摻假執(zhí)法的需要。

關(guān)于動(dòng)物源性成分的鑒別已有很多研究報(bào)道，其中，Taqman-LNA熒光PCR方法以穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速、無需觸毒等優(yōu)勢(shì)而得到越來越廣泛的應(yīng)用，然而，在探針設(shè)計(jì)時(shí)，需要通過較長的探針序列來獲得較高的Tm值，在設(shè)計(jì)多重反應(yīng)時(shí)，常常會(huì)因此難以找到理想的探針序列。Taqman-LNA熒光探針是在Taqman探針的基礎(chǔ)上，有目的地將探針的一些堿基修飾成LNA堿基，通過提高探針的Tm值，縮短探針長度來增加探針的穩(wěn)定性、特異性和設(shè)計(jì)的靈活性[14]。本試驗(yàn)利用Taqman-LNA探針的上述優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了序列較短，但特異性較強(qiáng)的Taqman-LNA探針，實(shí)現(xiàn)了多肉種同步檢測。

以往的熒光PCR儀如Roche，LightCycler?480，由于相鄰熒光通道存在一定波長的交叉而產(chǎn)生相互熒光干擾，雖然通過建立顏色補(bǔ)償曲線等技術(shù)處理，可在一定程度上消除相鄰?fù)ǖ赖臒晒飧蓴_，但遇到弱反應(yīng)時(shí)，效果可能不盡理想，加上增加了操作步驟和試劑耗材，使多重?zé)晒釶CR的應(yīng)用受到了制約。本試驗(yàn)采用新一代的熒光PCR儀BIO-RAD， CFX96，由于相鄰?fù)ǖ罌]有波長交叉，因此，進(jìn)行多重反應(yīng)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生熒光干擾，無需任何技術(shù)處理，其檢測限與單重反應(yīng)沒有明顯區(qū)別。

對(duì)市售肉制品檢測發(fā)現(xiàn)，肉制品摻假依然存在，比例尚不低，甚至某大品牌企業(yè)也參與其中。雖然以低價(jià)肉代替高價(jià)肉的安全風(fēng)險(xiǎn)不高，但存在欺詐行為。一些企業(yè)鉆了標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)和目前肉制品中肉含量尚無定量檢測標(biāo)準(zhǔn)的空子，利用肉制品的多肉種成分，以高價(jià)肉作為品名，而實(shí)際卻以低價(jià)肉為主打肉，這應(yīng)引起監(jiān)管部門和標(biāo)準(zhǔn)制定者的關(guān)注，建議在對(duì)標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)，應(yīng)明確標(biāo)簽列明肉含量，并僅限以主肉種作為品名。而檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)加快肉制品中肉含量的定量檢測研究，盡快制定肉含量定量檢測標(biāo)準(zhǔn)。

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