河北省保定地區(qū)雛雞雞白痢沙門菌的分離鑒定及耐藥性檢測

張夢茜 ， 唐欣浩 ， 王雪偉 ， 康 茜 ， 任志軍 ， 陳穎彬 ， 劉立元 ， 趙月蘭 ， 秦建華

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071001)

雞白痢沙門菌病是由雞白痢沙門菌引起的一種急性、敗血性傳染病，該病對1～3周齡的雛雞危害較為嚴(yán)重。病雛雞以急性死亡、敗血癥、拉白色稀便及糊肛為主要特征，發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán)重影響著育雛存活率及雞群質(zhì)量，給養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，雞沙門菌耐藥性出現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，特別是沙門菌多重耐藥的不斷出現(xiàn)給世界禽業(yè)造成巨大的威脅。化學(xué)藥物防治造成的藥物殘留對公共衛(wèi)生也產(chǎn)生了巨大的潛在危害。河北省保定地區(qū)某養(yǎng)殖場內(nèi)的部分4日齡雛雞突然出現(xiàn)死亡，疑似雞白痢沙門菌病，本作者自疑似病雞采取肝臟病料，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和PCR鑒定，并對分離菌株進(jìn)行了耐藥性檢測，為抗菌藥物的臨床合理選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 河北省保定地區(qū)某養(yǎng)殖場內(nèi)的部分4日齡的雛雞突然出現(xiàn)死亡，隨后幾天內(nèi)部分雛雞表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振、瘦弱垂腹、拉白色稀糞，繼而大量死亡，急性病例肝臟腫大、出血，呈土黃色并有磚紅色條紋，有針尖大小的灰白色壞死灶，疑似雞白痢沙門菌病。無菌采集10只病雞的肝臟，進(jìn)行病原分離與鑒定。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、S.S.瓊脂培養(yǎng)基等，均按常規(guī)方法配制。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、尿素等細(xì)菌微量生化管，由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。雞白痢沙門菌多價血清型陽性血清，購自北京中海動?？萍加邢薰?。藥敏試紙阿莫西林(AMX)、阿齊霉素(AZI)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMI)、頭孢唑啉(CFZ)、青霉素(PEN)、氧氟沙星(OFL)，購自杭州天和微生物試劑有限公司。PCR擴(kuò)增試劑，均購自TaKaRa公司。

1.3 病原的分離培養(yǎng) 將病雞肝臟病料接種到M.M.營養(yǎng)肉湯中，于37 ℃增菌培養(yǎng)24 h。取菌液斜劃線接種于S.S.瓊脂培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上菌落形態(tài)，挑取培養(yǎng)基上的單個菌落涂片，經(jīng)革蘭染色后鏡檢。

1.4 分離菌的生化鑒定 挑取普通瓊脂斜面上經(jīng)37 ℃培養(yǎng)的疑似沙門菌的單個菌落，接種于普通液體LB培養(yǎng)基中，150 r/min,37 ℃過夜培養(yǎng)12 h～24 h,取菌液接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行斜面劃線并穿刺直至底部，37 ℃培養(yǎng) 24 h～36 h。

將分離菌株接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、木糖九種生化管中，37 ℃培養(yǎng)2 d～5 d。

1.5 血清學(xué)鑒定 取普通瓊脂斜面培養(yǎng)的分離菌落，加滅菌生理鹽水制成菌液，取50 μL菌液與等量雞白痢沙門菌多價血清型陽性血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)試驗，2 min內(nèi)觀察結(jié)果。出現(xiàn)明顯的顆粒凝集者，判定為陽性反應(yīng)。

1.6 分離菌的PCR擴(kuò)增 參考Gene Bank中登記的沙門菌invA基因序列(序列號:NC-03197)，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計一對引物。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為373 bp。引物序列如下：

上游引物為P1：5′-GTCCTCCGCCCTGTCTACT-3′

下游引物為P2：5′-TCCTAACGACGACCCI丁C-3′

取培養(yǎng)的菌液，提取細(xì)菌基因組DNA，用上述引物進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的invA基因PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為(總體積25 μL)：DNA模板2 μL，dNTP 3 μL,Taq酶 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，上下游引物分別0.5 μL，水16 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測[1-2]。

1.7 分離菌的致病性試驗 將20只5日齡的雛雞分為兩組，每組10只。試驗組每只腹腔接種分離菌株雛雞沙門菌培養(yǎng)物0.2 mL(約3×107CUF/mL),對照組每只接種滅菌營養(yǎng)肉湯0.2 mL，兩組分別隔離飼養(yǎng)，正常供應(yīng)飼料及飲水。分別記錄每日雞只的發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)，連續(xù)觀察7 d。

1.8 藥敏試驗 采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的Kirby-Bauer法測定分離菌對抗菌藥物的敏感性。將菌液用生理鹽水校正濁度至0.5個麥?zhǔn)蠁挝?，均勻的涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和S.S.瓊脂培養(yǎng)基上，然后依次貼藥敏紙片即阿齊霉素(AZI)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMI)、青霉素(PEN)、頭孢唑啉(CFZ)、阿莫西林(AMX)、氧氟沙星(OFL)共7種藥敏片，于37 ℃過夜培養(yǎng)。

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS，2009)公布的標(biāo)準(zhǔn)，通過平板上抑菌圈的大小來判斷藥物的敏感性。以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)3種形式對抑菌圈大小做出判定(表1)。

表1 分離菌對7種抗菌藥物的敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將10份被檢病料接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和S.S.瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)過12 h～24 h的培養(yǎng)，均在培養(yǎng)基表面上長出了邊緣整齊的光滑菌落，其在普通瓊脂平板生長貧瘠，形成較小的無色透明菌落；在S.S.瓊脂平板上形成粉紅色、中等大小的菌落；有的菌落中間還會出現(xiàn)帶有金屬光澤的黑色小點(diǎn)。分離菌的菌落特征均與為雞白痢沙門菌菌落特征相似。

分離菌染色鏡檢結(jié)果均為革蘭陰性、兩端鈍圓短小桿菌，無芽孢、無莢膜，多散在，少數(shù)成對或呈短鏈狀排列。分離菌的菌體特征與雞白痢沙門菌特征相一致。

2.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株對葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖的分解能力見表2。

表2 分離菌的主要生化特性

⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣； ﹢：為陽性； -：為陰性

由表1可知，多數(shù)分離菌的生化鑒定結(jié)果符合沙門菌的特性，三糖鐵斜面陰性、底部陽性，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖和蔗糖。只有個別分離菌株與此有一定的差異，S2三糖鐵斜面陽性、葡糖糖陽性，S3乳糖陽性。

2.3 血清學(xué)鑒定結(jié)果 分離菌與等量雞白痢沙門菌多價血清型陽性血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)試驗，結(jié)果出現(xiàn)明顯的凝集顆粒，判定為陽性反應(yīng)。

2.4 分離菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果 將10株分離菌進(jìn)行沙門菌基因組DNA片段invA基因的PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出373 bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 沙門菌invA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DL-2 000 Marker； S1-S10：分離菌1-10株

2.5 分離菌的致病性結(jié)果 雛雞攻毒后6 h開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神不振，惡寒怕冷，羽毛粗亂，食欲減退，拉白色稀便。12 h后雛雞開始死亡，整個試驗期的死亡率達(dá)90%(表3)。對照組僅有一只在第5天死亡，其他無臨床癥狀，健康存活。對照組在第5天死亡的一只雛雞，死前無拉白色稀糞等雞白痢癥狀，可能是由于雛雞有個體差異，有環(huán)境應(yīng)激，抵抗力降低，其他病因?qū)е滤劳觥?/p>

表3 沙門菌分離株對雛雞的致病性

2.6 藥敏試驗結(jié)果

2.6.1 雛雞沙門菌分離株的耐藥性 雛雞沙門菌分離株的耐藥性見表4和表5。所有的分離菌株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，且表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象(表4)。在試驗的7種抗菌藥物中，10株分離菌株對阿莫西林和青霉素耐藥率達(dá)100%，對阿齊霉素的耐藥率達(dá)90%，而對阿米卡星、頭孢唑林和慶大霉素耐藥性較弱、對氧氟沙星較為敏感(表5)。

2.6.2 雛雞耐藥沙門菌的耐藥譜 10株耐藥菌株的耐藥譜見表6和表7。在試驗的7種抗菌藥物中，分離菌株均對其3～5種藥物表現(xiàn)出耐藥性(表6)，4耐菌株占總菌株的比例最大，達(dá)40%，3耐和5耐菌株各占30%。從耐藥沙門菌的多重耐藥率(表7)可以看出，3耐菌株多重耐藥比例為42.86%，4耐菌株多重耐藥比例為57.14%，5耐菌株多重耐藥比例為71.43%，臨床分離株的多重耐藥現(xiàn)象已經(jīng)十分嚴(yán)重。

表4 各分離菌對7種藥物的耐藥性

注： R：耐藥， I：中度耐藥， S：敏感

表5 耐藥沙門菌對各種抗生素的耐藥率

表6 分離菌的多重耐藥性

表7 耐藥沙門菌的多重耐藥率

3 討論

本研究通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)觀察、生化試驗、血清學(xué)鑒定,證明從病死雛雞組織中分離出的細(xì)菌為雞白痢沙門菌。沙門菌inv基因簇是編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的基因，基于inv基因簇設(shè)計的引物，具有屬特異性，可用于鑒別沙門菌[3-4]。本研究以沙門菌invA基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片段，進(jìn)一步確定分離菌為沙門菌。用分離菌株接種雛雞，其死亡率高達(dá)90%，表明該菌株有很高的致病性。

抗生素藥物在防治雞白痢沙門菌病方面具有重要作用，但隨著抗生素藥物的廣泛使用,以及濫用抗生素，雞白痢沙門菌耐藥菌株不斷出現(xiàn),耐藥譜不斷增大[5-6]，因此，在雞白痢病的防治中,應(yīng)經(jīng)常分離流行致病菌株,通過藥敏試驗指導(dǎo)用藥,防止盲目用藥貽誤最佳治療時機(jī)。為了準(zhǔn)確有效地治療雞白痢沙門菌病，本研究自保定地區(qū)疑似雞白痢沙門菌病雞肝組織采取病料，進(jìn)行雞白痢沙門菌分離鑒定以及耐藥性檢測，為本地區(qū)雞白痢沙門菌病的防治提供依據(jù)。

藥敏試驗結(jié)果表明，雞白痢沙門菌保定分離菌株對阿莫西林和青霉素耐藥率達(dá)100%，但對阿米卡星、頭孢唑林和慶大霉素耐藥性較弱，對于氧氟沙星相對較為敏感。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中應(yīng)通過藥敏試驗篩選幾種敏感藥物交替使用，避免長期使用同一種藥物而產(chǎn)生耐藥性或盲目用藥。另外，對雞白痢沙門菌病的防制不能完全依賴藥物，應(yīng)把重點(diǎn)放在強(qiáng)化生物安全措施，改善飼養(yǎng)管理條件，防止或者延緩耐藥株的產(chǎn)生[7]。近年來微生態(tài)制劑如益生菌、益生素和中草藥制劑如地榆散等的應(yīng)用,為在臨床中防治雞白痢沙門菌感染提供了新途徑[8]。

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