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    全硫代反義hTR對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

    2012-11-21 01:09:06夏麗娟李洪秀李德華
    中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2012年7期
    關(guān)鍵詞:端粒酶反義脂質(zhì)體

    夏麗娟 李洪秀 李德華

    在多數(shù)人類(lèi)原發(fā)惡性腫瘤中,85%以上發(fā)現(xiàn)有端粒酶活性,但在人正常細(xì)胞(除生殖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞外)則為陰性[1]。設(shè)計(jì)互補(bǔ)于hTR模板區(qū)的反義寡核苷酸封閉該模板區(qū),就可抑制端粒酶合成端粒,從而使細(xì)胞退出增殖周期,達(dá)到治療腫瘤的目的,本研究將端粒酶PS-ASODN經(jīng)lipotap脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A,觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響,同時(shí)檢測(cè)其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,旨在探討PS-ASODN對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療價(jià)值,為臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞 人HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。

    2 方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)共分六組,不予正、反義核酸及脂質(zhì)體的空白對(duì)照組,脂質(zhì)體對(duì)照組,1.5 μM端粒酶PS-SODN組和濃度分別為0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM 的 PS-ASODN 組。形態(tài)學(xué)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀均采用1.5 μM PS-ASODN。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1~2 d換一次培養(yǎng)液,細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70%~80%傳代。0.25%的胰蛋白酶分離消化細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

    2.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 取各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A細(xì)胞以5×104個(gè)/ml濃度接種在96孔板,每孔100 μl,待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為 0.5、1.0與 1.5 μM 的 PSASODN,脂質(zhì)體組加含脂質(zhì)體的DMEM培養(yǎng)液,對(duì)照組加入濃度為1.5 μM的端粒酶PS-SODN,空白對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)液,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)570 nm處OD值,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

    2.2.3 端粒酶活性檢測(cè) 分別收集各組細(xì)胞(約1×106個(gè)),在反應(yīng)板中分別加入50 μl陰性對(duì)照、50 μl陽(yáng)性對(duì)照,50 μl標(biāo)準(zhǔn)液和50 μl各實(shí)驗(yàn)組的端粒酶提取物于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。酶標(biāo)儀上讀取450 nm處OD值。Index=樣品的OD值/標(biāo)準(zhǔn)液的OD值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    4 結(jié)果

    4.1 PS-ASODN作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖 如表1顯示,端粒酶PS-ASODN組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖減慢,0.5 μM PS-ASODN 組細(xì)胞尚能緩慢增殖,1.0 μM PS-ASODN組細(xì)胞基本無(wú)明顯增殖,在48 h到72 h時(shí)間段,細(xì)胞增殖尤為緩慢。端粒酶PS-SODN組、空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組HEC-1A細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈指數(shù)增長(zhǎng),不受藥物影響。

    4.2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度的端粒酶PS-ASODN后,不同時(shí)間的端粒酶活性見(jiàn)表2。各濃度組48 h時(shí)端粒酶皆表現(xiàn)為陰性,表明PS-ASODN能夠抑制端粒酶活性。

    表1 各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖變化,(A值,,n=4)

    表1 各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖變化,(A值,,n=4)

    注:t檢驗(yàn),各組與對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照組比較,△P>0.05、*P<0.05、**P<0.01

    實(shí)驗(yàn)分組0.017脂質(zhì)體對(duì)照 0.256±0.005△ 0.613±0.013△ 0.752±0.013△ 0.793±0.012△PS-SODN 0.252±0.015△ 0.610±0.014△ 0.744±0.020△ 0.777±0.018△0.5 μM PS-ASODN 0.238±0.009* 0.429±0.012* 0.474±0.009** 0.564±0.011**1.0 μM PS-ASODN 0.228±0.014* 0.380±0.020** 0.3798±0.011** 0.485±0.013**1.5 μMPS-ASODN 0.213±0.020* 0.324±0.022** 0.310±0.022** 0.392±0.013 24 h 48 h 72 h 96 h空白對(duì)照 0.261±0.012 0.628±0.010 0.769±0.021 0.807±**

    表2 端粒酶PS-ASODN對(duì)HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響(,n=4)

    表2 端粒酶PS-ASODN對(duì)HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響(,n=4)

    注:index≥1為+index在0.91~0.99之間為+/-index≤0.90為-

    實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)時(shí)間0.047 PS-SODN組 1.296±0.023 1.214±0.039 1.323±0.035 1.317±0.025脂質(zhì)體對(duì)照 1.278±0.045 1.282±0.045 1.327±0.028 1.356±0.036 0.5 μM PS-ASODN 0.988±0.039 0.878±0.022 0.718±0.023 0.762±0.019 1.0 μM PS-ASODN 0.848±0.055 0.817±0.014 0.766±0.014 0.769±0.016 1.5 μM PS-ASODN 0.740±0.025 0.717±0.025 0.696±0.24 h 48 h 72 h 96 h空白對(duì)照 1.373±0.036 1.146±0.027 1.269±0.030 1.291±016 0.760±0.032

    5 討論

    應(yīng)用封閉人端粒酶RNA為靶序列的反義寡核苷酸在體內(nèi)外能明顯抑制癌細(xì)胞中的端粒酶活性及細(xì)胞的增殖[2],早在1995年,F(xiàn)eng等就用反義hTR轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中端粒酶活性明顯降低,端??s短[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者用端粒酶反義核酸進(jìn)行體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能抑制多種癌細(xì)胞的端粒酶活性[4]。此點(diǎn)在本研究同樣得到了證實(shí),我們的結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A細(xì)胞中端粒酶活性呈陽(yáng)性表達(dá),經(jīng)端粒酶PS-ASODN作用后HEC-1A細(xì)胞端粒酶活性受到抑制。而端粒酶PS-SODN對(duì)HEC-1A細(xì)胞的端粒酶無(wú)抑制作用。提示PS-ASODN對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用是序列特異性的。

    [1]Zamaratski E,Pradeepkumar PI,Chattopadhyaya J.A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNAse H.J Biochenm Biophys Methods,2001,28,48(3):189-208.

    [2]Greider CW,Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell,1985,43:405-413.

    [3]Feng RH,Zhu ZG,Li JF,et al.Inhibition of human telomerase in MKN-45 cell line by antisense hTR expression vector induces cell apoptosis and growth arrest.World J Gastroenterol,2002,8(3):436-400.

    [4]MandalM,kumarR,et al.Bcl-2 modulatestelomeraseactevity.Biolchem,2004,272(22):14183.

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