西藏自治區(qū)產(chǎn)堿性彈性蛋白酶枯草芽孢桿菌的分離及鑒定

馬長(zhǎng)中++辜雪冬++池福敏++羅章++楊林

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.144

摘要：從西藏自治區(qū)不同海拔地區(qū)的屠宰場(chǎng)土壤中分離得到180株菌株，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得1株產(chǎn)堿性彈性蛋白酶較高的菌株XZJ4，結(jié)合生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

關(guān)鍵詞：堿性彈性蛋白酶；分離；鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0502-03

收稿日期：2015-11-14

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號(hào)：Z2012A076）。

作者簡(jiǎn)介：馬長(zhǎng)中（1975—），男，四川遂寧人，碩士，副教授，主要從事高原特色農(nóng)畜產(chǎn)品加工及貯藏研究。Tel：（0894）5826471；E-mail：414767450@qq.com。彈性蛋白酶是一種以水解不溶性彈性硬蛋白為特征的廣譜蛋白水解酶，是一種肽鏈內(nèi)切酶[1-2]，廣泛存在于動(dòng)物胰臟和微生物類群中，細(xì)菌、真菌、放線菌中均存在。彈性蛋白酶是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的酶制劑[3-4]。彈性蛋白酸作為一種水解專一性較廣的內(nèi)肽酶，對(duì)很多蛋白質(zhì)均有水解能力[5]。當(dāng)彈性蛋白與其他蛋白共存時(shí)，它會(huì)優(yōu)先水解彈性蛋白，彈性蛋白酶可作為理想的肉類嫩化劑應(yīng)用于食品工業(yè)和日常生活中[6-7]。此外，彈性蛋白酶還可應(yīng)用于農(nóng)副產(chǎn)品深加工、高蛋白食品制作、罐頭工業(yè)，也可作為益生菌保健食品的促菌劑和嬰兒食品的強(qiáng)化劑[8-10]。胰臟是彈性蛋白酶的主要來(lái)源，由于臟器資源不足，胰彈性蛋白酶一直供不應(yīng)求。由微生物發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶成本低、產(chǎn)量大、設(shè)備利用率高，且不受原料來(lái)源的限制；因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶是一條有效途徑。目前，由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)彈性蛋白酶，關(guān)鍵在于篩選到產(chǎn)彈性蛋白酶的高產(chǎn)菌株。本研究首次從西藏自治區(qū)不同海拔地區(qū)的屠宰場(chǎng)附近采集土樣，并從中分離得到產(chǎn)堿性彈性蛋白酶的菌株XZJ4，結(jié)合生理生化特征和16S rDNA，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

1材料與方法

1.1樣品采集

選取西藏自治區(qū)林芝市、拉薩市、日喀則市、阿里地區(qū)4個(gè)不同海拔地區(qū)的屠宰場(chǎng)，在其附近的土樣中采集樣品共30份。

1.2主要試劑

pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 HindⅢ、T4DNA連接酶等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。小量PCR產(chǎn)物試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio Tek公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[11]。

1.4培養(yǎng)方法

種子斜面及平板培養(yǎng)均于37 ℃下培養(yǎng)24 h。進(jìn)行復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，將20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，接種后置于旋轉(zhuǎn)式搖床，于32～37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.5粗酶制備[12]

將細(xì)菌發(fā)酵液以10 000 r/min離心10 min，收集去菌體發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)鹽析（30%～65%飽和度），將沉淀溶于0.05 mol/L、pH值9.0的硼酸緩沖液中即為粗酶液。

1.6酶活力的測(cè)定

采用分光光度法[13]測(cè)定彈性蛋白酶活力。稱取10 mg剛果紅-彈性蛋白溶于1 mL水中，加入1 mL適當(dāng)稀釋的酶液以及1 mL pH值7.4的0.2 mol/L硼酸緩沖液，于37 ℃下振蕩反應(yīng)30 min；加入2 mL pH值6.0的0.7 mol/L磷酸鈉緩沖液終止反應(yīng)，過(guò)濾后取上清液，于波長(zhǎng)495 nm處測(cè)定光密度，采用蒸餾水替代酶液的反應(yīng)體系為空白對(duì)照。在此反應(yīng)條件下，溶解1 mg剛果紅-彈性蛋白底物所需的酶量定義為1個(gè)彈性蛋白酶活力單位（U）。

1.7菌落形態(tài)觀察及生理生化特征

菌體形態(tài)特征觀察和生理生化鑒定的方法主要參照文獻(xiàn)[14-16]。

1.8XZJ4菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA寡核苷酸通用引物：P1，5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；P2，5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)按以下擴(kuò)增程序進(jìn)行：96 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，將剩余的PCR產(chǎn)物純化，連接到pMD18-T載體，委托上海鼎安生物科技有限公司完成。采用Blast在線軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1枯草芽孢桿菌的篩選

通過(guò)對(duì)30個(gè)樣品進(jìn)行混合富集培養(yǎng)、彈性蛋白平板初篩、分離純培養(yǎng)，獲得180株產(chǎn)堿性彈性蛋白酶的菌株。對(duì)彈性蛋白水解圈與菌落直徑之比（H/C）較大的90株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，得到1株酶活力最高的菌株，編號(hào)為XZJ4，酶活為33 U/mL。

2.2菌株XZJ4的形態(tài)和生理生化特征

2.2.1形態(tài)特征將菌株XZJ4接種于彈性蛋白培養(yǎng)基上，于30 ℃下倒置培養(yǎng)48 h，形成蛋白水解圈（圖1）。圖1顯示，該菌株菌落呈圓形、乳白色、不透明，隆起度較高。顯微鏡下形態(tài)見(jiàn)圖2，為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，大?。▽挕灵L(zhǎng)）為（1.0～1.4） μm×（2.0～2.4） μm，兩端鈍圓，單個(gè)排列或短鏈狀排列。芽孢橢圓位于菌體中央，有鞭毛，無(wú)莢膜。

2.2.2生理生化特征由生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果（表1）可知，菌株XZJ4葡萄糖產(chǎn)酸、水解淀粉、木糖產(chǎn)酸、L-阿拉伯糖產(chǎn)酸、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、接觸酶、甘露醇產(chǎn)酸試驗(yàn)為陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)氣、厭氧生長(zhǎng)、吲哚、丙二酸鹽、卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)為陰性，這與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌具有相同或近似的生理生化特征[17-18]。

表1菌株XZJ4的生理生化特征

特征試驗(yàn)結(jié)果葡萄糖產(chǎn)酸+水解淀粉+木糖產(chǎn)酸+L-阿拉伯糖產(chǎn)酸+檸檬酸鹽利用+硝酸鹽還原+接觸酶+甘露醇產(chǎn)酸+葡萄糖產(chǎn)氣-厭氧生長(zhǎng)-吲哚-丙二酸鹽-卵黃卵磷脂酶-注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

2.3菌株XZJ4的分子生物學(xué)鑒定

利用P1、P2引物擴(kuò)增16S rDNA區(qū)域，片斷大小約為 1 500 bp（圖3），與預(yù)期相符。將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，純化后連接pMD18-T載體，篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子委托上海鼎安生物科技有限公司完成。

將測(cè)序結(jié)果在GenBank的Blast上進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)增片段與GenBank上報(bào)道的枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis，GenBank登錄號(hào)NBRC13719）16S rDNA的同源性達(dá)100%，與枯草芽孢桿菌（GenBank登錄號(hào)JCM1465）16S rDNA的同源性達(dá)99%。序列采用Blast軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rDNA進(jìn)行相似性比對(duì)，應(yīng)用ClustalX軟件對(duì)目的序列進(jìn)行比對(duì)和聚類分析，使用MEGA 6.06生物軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖4）。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，XZJ4菌株屬于芽孢桿菌屬，與模式菌株枯草芽孢桿菌親緣性最近。

3結(jié)論與討論

選取西藏自治區(qū)不同海拔地區(qū)的屠宰場(chǎng)，在其附近的土樣中采樣30份樣品。通過(guò)混合富集培養(yǎng)、彈性蛋白平板初

篩、分離純培養(yǎng)獲得180株產(chǎn)堿性彈性蛋白酶的菌株，對(duì)彈性蛋白水解圈與菌落直徑之比（H/C）較大的90株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，得到1株酶活力最高的菌株，編號(hào)為XZJ4，酶活為 30 U/mL。結(jié)合生理生化和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究為進(jìn)一步篩選高產(chǎn)堿性彈性蛋白酶菌株及其工業(yè)化發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)，下一步可通過(guò)克隆該菌株的彈性蛋白酶基因構(gòu)建基因工程菌，以期為西藏自治區(qū)本土堿性彈性蛋白酶的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

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