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    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶側(cè)孢短芽孢桿菌M64的產(chǎn)酶條件優(yōu)化及部分酶學(xué)性質(zhì)研究

    2017-02-05 23:28:11劉蒲臨程德勇繆禮鴻
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期

    劉蒲臨++程德勇++繆禮鴻

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.135

    摘要:在紫外誘變的基礎(chǔ)上,采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus) M64發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,并對粗酶液的酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明,碳氮源的種類與濃度、培養(yǎng)溫度、pH值以及表面活性劑吐溫80濃度對該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有顯著影響。突變株使用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件,其發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到55.19 U/mL,為未優(yōu)化前的2.56倍;粗酶液最適催化溫度為60 ℃,且在80 ℃預(yù)處理2 h后仍具有降解幾丁質(zhì)的能力,表現(xiàn)出了良好的熱穩(wěn)定性。

    關(guān)鍵詞:側(cè)孢短芽孢桿菌;幾丁質(zhì)酶;產(chǎn)酶條件;酶學(xué)性質(zhì)

    中圖分類號: S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0468-04

    收稿日期:2015-09-29

    基金項(xiàng)目:國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃(編號:2013AA102805);武漢輕工大學(xué)科研啟動經(jīng)費(fèi)(編號:2014RZ19)。

    作者簡介:劉蒲臨(1985—),男,湖北武漢人,博士,講師,主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。Tel:(027)83956793;E-mail:liunan3585@163.com。

    通信作者:繆禮鴻,博士,教授,主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究。Tel:(027)83956793;E-mail:miaowhpu@126.com。幾丁質(zhì)是由幾丁質(zhì)合酶以尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺為前體,催化N-乙酰葡糖胺以β-1,4糖苷鍵相連形成長鏈后,不同長鏈之間以反平行(α型)或平行(β型)的方式相互作用所形成的[1]。幾丁質(zhì)是構(gòu)成絲狀真菌和擔(dān)子菌細(xì)胞壁的主要成分,同時廣泛存在于節(jié)肢動物外骨骼和甲殼綱動物的外殼中[2]。據(jù)統(tǒng)計,自然界中每年產(chǎn)生的幾丁質(zhì)超過100億t,是僅次于纖維素的第二大有機(jī)物[3]。

    幾丁質(zhì)酶可以催化幾丁質(zhì)的水解,廣泛存在于微生物和高等動植物體內(nèi)[4]。微生物所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶除了可以水解幾丁質(zhì)獲取營養(yǎng)、賦予細(xì)菌競爭或寄生優(yōu)勢以外,還可以降解真菌細(xì)胞壁和昆蟲幾丁質(zhì)外殼,進(jìn)而應(yīng)用于植物的病蟲害防治[5]。此外,幾丁質(zhì)降解所形成的幾丁寡糖具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力和抗癌等功效,在功能食品和保健藥品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。因此本研究以前期篩選得到的具有幾丁質(zhì)降解能力的側(cè)孢短芽孢桿菌M64為出發(fā)菌株,通過紫外誘變和正交試驗(yàn)等手段提高和優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶能力并研究了粗酶液的部分酶學(xué)性質(zhì),為進(jìn)一步研究開發(fā)其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶提供依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    側(cè)孢短芽孢桿菌M64,由筆者所在課題組前期篩選得到。幾丁質(zhì)粉末購自美國Sigma-Aldrich公司。

    1.2試驗(yàn)方法

    1.2.1膠體幾丁質(zhì)制備將10 g幾丁質(zhì)粉末加入100 mL濃鹽酸中,磁力攪拌2 h后室溫靜置24 h。將幾丁質(zhì)的酸溶液轉(zhuǎn)移至1 L蒸餾水中,攪拌均勻。5 000 g離心10 min收集膠體幾丁質(zhì)沉淀。使用蒸餾水反復(fù)沖洗至pH值為6.5左右。最終使用200 mL蒸餾水重懸沉淀,獲得5%的膠體幾丁質(zhì)母液。

    1.2.2培養(yǎng)基配制(1)菌體擴(kuò)增與計數(shù)培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。(2)初始發(fā)酵培養(yǎng)基,在Hoster等所使用培養(yǎng)基配方[8]基礎(chǔ)上有所更改:膠體幾丁質(zhì) 5.0 g/L,酵母膏 2.0 g/L,KH2PO4 3.0 g/L,K2HPO4 2.0 g/L,CaCl2·2H2O 1.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L。(3)突變株篩選培養(yǎng)基:初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加瓊脂至濃度為15.0 g/L。

    1.2.3幾丁質(zhì)酶酶活測定使用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)[9],以β-D-N-乙酰氨基葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別對待測樣品以及樣品空白進(jìn)行測定。將1 min產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個活力單位(U)。

    1.2.4紫外誘變與突變株篩選將出發(fā)菌株接種至50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 10 h。離心收集菌體,使用50 mL無菌生理鹽水進(jìn)行重懸,平板計數(shù)法測定菌懸液濃度。轉(zhuǎn)移5 mL菌懸液至無菌培養(yǎng)皿中,在距離40 W紫外燈50 cm處,分別處理15~105 s。紫外照射完畢后,進(jìn)行平板菌落計數(shù),并按照以下公式計算致死率:

    致死率=(照射前菌懸液濃度-照射后菌懸液濃度)/照射前菌液濃度×100%。

    觀察并測定菌落在膠體幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基上所形成的水解圈大小。挑取水解圈較大的單菌落接種至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,測定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的酶活。

    1.2.5培養(yǎng)條件優(yōu)化以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),通過單因素試驗(yàn)分別考察pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和吐溫80濃度對發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響。

    1.2.6培養(yǎng)基優(yōu)化通過單因素試驗(yàn)確定不同培養(yǎng)基成分對發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響,選取影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn),確定M64產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)基構(gòu)成。

    1.2.7粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究(1)最適溫度和pH值的測定:分別于20~80 ℃以及pH值為3.0~10.0條件下測定發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)酶的活性。(2)熱穩(wěn)定性的測定:將發(fā)酵上清液置于20~80 ℃下水浴 2 h 后檢測酶活。

    2結(jié)果與分析

    2.1紫外誘變與突變株篩選

    2.1.1紫外致死曲線菌株M64的紫外致死曲線如圖1所示。當(dāng)紫外處理時間為15 s時,菌體致死率為9.02%。隨著處理時間延長至60 s,菌體致死率增長至87.22%。當(dāng)紫外處理時間大于75 s時,菌體致死率已接近100%。本試驗(yàn)選擇致死率在80%~90%的紫外線劑量,確定誘變所使用照射時間為60 s。

    2.1.2紫外誘變后菌株的篩選經(jīng)過紫外誘變的菌懸液經(jīng)梯度稀釋后涂布于含有1%膠體幾丁質(zhì)的固體培養(yǎng)平板上,避光培養(yǎng)72 h后觀察透明圈產(chǎn)生情況。測量并計算透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)的比值,從中挑選出比值較大的單菌落完成初篩。將比值較大的10株突變株分別劃線純化,培養(yǎng)形成種子液后以1%接種量接種至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,使用DNS法測定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力。突變株篩選結(jié)果如表1所示。其中,菌株 M64-7幾丁質(zhì)酶活力最高,達(dá)到32.30 U/mL,為野生型菌株的1.50倍。突變株M64-7經(jīng)過多次劃線傳代后酶活力保持穩(wěn)定,具有較好的遺傳穩(wěn)定性,故以突變株M64-7進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

    2.2突變株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.2.1培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將過夜培養(yǎng)的突變株M64-7的菌液以1%接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng),每隔6 h測定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活和菌體生長量。圖2表明,菌株M64-7在36 h產(chǎn)酶達(dá)到最大值,36 h與42 h幾丁質(zhì)酶活差異不顯著。發(fā)酵液酶活變化曲線與菌體生長情況表現(xiàn)出了良好的一致性。

    2.2.2培養(yǎng)溫度與起始pH值對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將突變株M64-7的種子液以1%接種量接種至不同pH值或不同培養(yǎng)溫度的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)(180 r/min),36 h后測定發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活力。圖3表明,該菌株在初始pH值為7.0以及培養(yǎng)溫度為37 ℃時,產(chǎn)酶達(dá)到最高水平。

    2.2.3吐溫80含量對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響表面活性劑能增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,從而提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量。將非離子表面活性劑吐溫80添加至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,至終濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。在最適pH值和培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)36 h后,發(fā)酵上清液中的酶活如圖4所示。當(dāng)吐溫濃度小于0.2%時,發(fā)酵液酶活隨著吐溫80濃度的增大而增強(qiáng);吐溫80濃度為0.2%時,發(fā)酵液酶活達(dá)到最大值。因此,本研究最終選擇培養(yǎng)基中的吐溫80濃度為0.2%。

    2.3不同的培養(yǎng)基成分對發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響

    2.3.1氮源種類與濃度對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在其他成分不變的條件下,分別添加不同濃度的酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl以及KNO3,比較不同氮源對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響。在相同接種量和培養(yǎng)條件下,以有機(jī)物作為氮源有助于幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的提高,當(dāng)培養(yǎng)基中含有8.0 g/L的酵母膏時,發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到 49.68 U/mL(圖5-a);而向培養(yǎng)基中添加無機(jī)氮(NH4Cl與KNO3)不會顯著影響幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量(圖5-b)。

    2.3.2碳源種類與濃度對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響在培養(yǎng)基中其他成分不變的條件下,分別添加不同濃度的膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖和蔗糖,比較不同碳源對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖6所示。膠體幾丁質(zhì)含量由0.5%增加至2.5%時,幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量先逐漸增加后趨于平緩,說明該菌株幾丁質(zhì)酶的表達(dá)受到外源幾丁質(zhì)的誘導(dǎo);但當(dāng)培養(yǎng)基中不含膠體幾丁質(zhì)時,幾丁質(zhì)酶仍有部分表達(dá)(圖6-a)。以葡萄糖或蔗糖作為碳源時,發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶含量明顯下降(圖6-b)。

    2.3.3緩沖鹽濃度對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度定義為100%,調(diào)整培養(yǎng)基中磷酸鹽相對濃度至25%~200%不等,比較不同緩沖鹽濃度對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖7所示。培養(yǎng)基中緩沖鹽濃度為初始培養(yǎng)基緩沖鹽濃度的50%~125%時,單位體積發(fā)酵液所表現(xiàn)出的幾丁質(zhì)酶活力穩(wěn)定在較高水平;低于或高于該濃度范圍均使幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量有所下降。

    2.3.4培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,選擇酵母膏作為氮源,膠體幾丁質(zhì)作為碳源和緩沖鹽濃度一起進(jìn)行正交試驗(yàn),確定最佳培養(yǎng)基配方。菌體的發(fā)酵均在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行(含0.2%吐溫80),結(jié)果如表2所示。使用SPSS 10.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后,發(fā)現(xiàn)在α=005的顯著性水平上酵母膏和膠體幾丁質(zhì)的濃度變化顯著影響了幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量(P<0.05);而培養(yǎng)基中的緩沖鹽濃度的變化對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響不顯著。此外,極差(R)結(jié)果表明,酵母膏濃度對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響較大??疾焐鲜?個因素在4個水平上的變化之后,得出最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為:酵母膏 6.0 g/L,膠體幾丁質(zhì)含量 2.0%,緩沖鹽濃度為初始發(fā)酵培養(yǎng)基的50%。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證,使用該配方后,菌株M64-7酶活穩(wěn)定在(55.19±0.48) U/mL。

    2.4溫度與pH值對發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響

    溫度與pH值對幾丁質(zhì)酶活力的影響如圖8所示。發(fā)酵液最適催化溫度為60 ℃;當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時,酶活為最高值的41.17%(圖8-a)。圖8-b表明,發(fā)酵液在pH值為70時表現(xiàn)出了最高酶活力。為了進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)酶對高溫的耐受能力,將發(fā)酵液分別置于20~80 ℃預(yù)處理2 h,在60 ℃以及pH值=7.0的條件下測定殘余的酶活力,結(jié)果(圖8-c)表明,經(jīng)過60 ℃預(yù)處理后,其酶活力沒有受到顯著影響;當(dāng)預(yù)處理溫度提高至80 ℃時,其酶活力仍為原來的3775%,具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

    3討論與結(jié)論

    側(cè)孢短芽孢桿菌在自然界中常常定殖于水體、土壤以及昆蟲的體表,對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目的多種昆蟲以及一些線蟲具有殺滅作用;該菌還產(chǎn)生與拮抗性有關(guān)的酶和抗生素,抑制多種病原細(xì)菌或真菌的生長[10]。幾丁質(zhì)酶已被證明是微生物產(chǎn)生真菌拮抗能力的重要原因之一,然而國內(nèi)尚未對側(cè)孢短芽孢桿菌中幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量及其影響因素展開研究。因此,本試驗(yàn)以前期所篩選的側(cè)孢芽孢桿菌M64為基礎(chǔ),通過紫外誘變提高其產(chǎn)酶能力,并探索其產(chǎn)酶的最佳條件與影響因素。該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃,最佳酸堿度為pH值=7.0。培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類與濃度對幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量有顯著影響。膠體幾丁質(zhì)可以誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達(dá),葡萄糖等速效碳源對幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。 有機(jī)氮源濃度的提高也有助于菌體合成并分泌幾丁質(zhì)酶。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏濃度由2 g/L提高至8 g/L時,發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的含量提高了31%。經(jīng)過紫外誘變與培養(yǎng)條件優(yōu)化之后,突變株發(fā)酵液酶活達(dá)到55.19 U/mL,為初始野生型菌株的2.56倍。酶學(xué)分析表明,菌株M64-7發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,80 ℃預(yù)處理2 h仍具有37.75%的催化活性。Karthik等研究指出,微生物幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度主要介于40~60 ℃之間,耐受溫度平均在50 ℃左右[11]。因此,M64-7所分泌幾丁質(zhì)酶的耐熱性處于較高水平。綜上所述,本研究探索了影響側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的幾個營養(yǎng)因素,并顯著提高了幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量,為該菌株在幾丁質(zhì)廢棄物生物轉(zhuǎn)化以及生物拮抗方面的推廣與應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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