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    1株產(chǎn)藍(lán)色素鏈霉菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2017-02-05 23:24:47左勇江鵬葉碧霞王小龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵正交試驗(yàn)

    左勇++江鵬+++葉碧霞++王小龍++傅彬++楊小龍++張晶

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.131

    摘要:研究了1株產(chǎn)藍(lán)色素的鏈霉菌D2013的發(fā)酵條件。在單因素試驗(yàn)(發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、起始pH值、裝液量等因素)的基礎(chǔ)上,以正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明,鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL、起始pH值為7.6,在此條件下,藍(lán)色素的產(chǎn)量可達(dá) 74.8 U/mL。

    關(guān)鍵詞:鏈霉菌;藍(lán)色素;發(fā)酵;正交試驗(yàn)

    中圖分類號(hào): TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0455-03

    收稿日期:2015-08-17

    基金項(xiàng)目:四川省教育廳成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(編號(hào):11ZZ016)。

    作者簡(jiǎn)介:左勇(1972—),男,重慶萬州人,碩士,教授,主要從事食品工程方面的研究。E-mail:sgzuoyong@tom.com。目前,隨著合成色素在食品和化妝品等領(lǐng)域引起的安全問題不斷被報(bào)道,以及對(duì)合成色素毒性認(rèn)識(shí)的不斷加深,許多合成色素已被禁止用于食品、化妝品等領(lǐng)域,使得相關(guān)企業(yè)不得不尋求無毒或低毒的色素代替 “有毒色素”的應(yīng)用。

    天然色素具有無毒、無害及對(duì)人體有益等優(yōu)點(diǎn)[1],將逐步取代合成色素的應(yīng)用?,F(xiàn)在,市場(chǎng)對(duì)天然色素的需求逐漸增大,如何獲得大量的天然色素以滿足市場(chǎng)需求已成為色素領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。微生物色素作為一種天然色素,不僅具有天然色素的著色功能,大多數(shù)微生物色素還具有保健價(jià)值和藥用價(jià)值[2-7]。另外,微生物色素的生產(chǎn)不受資源、季節(jié)等的限制,制取工藝簡(jiǎn)單,成本相對(duì)較低,必將成為天然色素的主要來源之一。目前,利用微生物生產(chǎn)的天然色素種類較多、色系較齊[8-10],但通過發(fā)酵法生產(chǎn)的天然藍(lán)色素卻十分罕見[11-12],因此研究微生物發(fā)酵產(chǎn)藍(lán)色素有重要的研究?jī)r(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

    本試驗(yàn)以鏈霉菌D2013為試驗(yàn)菌株,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)藍(lán)色素的發(fā)酵條件進(jìn)行研究,以期為進(jìn)一步開發(fā)該菌株產(chǎn)藍(lán)色素提供基礎(chǔ)研究。

    1材料與方法

    1.1菌種與培養(yǎng)基

    1.1.1菌種鏈霉菌D2013,來源于四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基[13]。

    1.2主要儀器與設(shè)備

    SKY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司),GZ-250-HSⅡ恒溫恒濕培養(yǎng)箱(韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司),UV759S紫外可見光分光光度計(jì)(上海宜有電子科技有限公司)。

    1.3種子的制備

    挑取適量鏈霉菌D2013孢子,接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min,培養(yǎng)24 h后,作為種子。

    1.4藍(lán)色素產(chǎn)量的測(cè)定方法[12]

    (1)藍(lán)色素相對(duì)效價(jià)單位定義:1 mL發(fā)酵液所提取的藍(lán)色素,在pH值為9.0及在576 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,將D值0.1定義為1個(gè)色素效價(jià)相對(duì)單位(U/mL),簡(jiǎn)稱色價(jià)。

    (2)藍(lán)色素產(chǎn)量的測(cè)定方法:將發(fā)酵液以8 000 r/min離心10 min后取上清。調(diào)pH值至9.0,再用pH值為9.0的水溶液定容至原發(fā)酵體積,測(cè)定D576 nm值,計(jì)算色價(jià)。本研究所測(cè)色素為胞外藍(lán)色素。

    1.5發(fā)酵條件的研究[14-17]

    本試驗(yàn)以高氏1號(hào)培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。通過單因素試驗(yàn),研究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、裝液量、接種量和發(fā)酵起始pH值等因素對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

    2結(jié)果與分析

    2.1發(fā)酵溫度對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

    在接種量為10%、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間為 9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下,發(fā)酵溫度分別控制為 21、24、27、30、33、36、39 ℃,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果見圖1。

    由圖1可知,發(fā)酵溫度在21~30 ℃內(nèi),藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加;當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí),藍(lán)色素的產(chǎn)量最高;發(fā)酵溫度超過30 ℃后,藍(lán)色素的產(chǎn)量明顯下降。原因可能是溫度不但影響鏈霉菌的生長(zhǎng)和代謝途徑,同時(shí)還可能影響發(fā)酵培養(yǎng)基的理化性質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)濃度、pH值等)及所產(chǎn)藍(lán)色素的穩(wěn)定性,故發(fā)酵的最適溫度為30 ℃。

    2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

    在發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、接種量為10%、裝液量為100 mL/250 mL的條件下,發(fā)酵時(shí)間分別控制為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,發(fā)酵時(shí)間在2~8 d內(nèi),藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí),藍(lán)色素的產(chǎn)量最高;發(fā)酵時(shí)間超過8 d后,藍(lán)色素的產(chǎn)量不但沒有增加,反而有下降的趨勢(shì)。原因在于發(fā)酵的前期,藍(lán)色素的產(chǎn)量與鏈霉菌生長(zhǎng)有關(guān),隨著發(fā)酵時(shí)間的增加藍(lán)色素的產(chǎn)量不斷增加;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),在發(fā)酵的后期,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗,菌體不再產(chǎn)藍(lán)色素,代謝產(chǎn)生的藍(lán)色素可能在自身酶的作用下發(fā)生降解或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì),從而使藍(lán)色素產(chǎn)量減少,故最適發(fā)酵時(shí)間確定為8 d。

    2.3接種量對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

    在發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間為9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下,接種量分別控制為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果見圖3。

    由圖3可知,接種量在2%~8%內(nèi),藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著接種量的增大而增加;當(dāng)接種量為8%時(shí),藍(lán)色素的產(chǎn)量最高;接種量超過8%后藍(lán)色素的產(chǎn)量顯著下降。原因在于,接種量的大小將決定微生物的生長(zhǎng)繁殖速度,會(huì)影響代謝產(chǎn)物的生成[15];接種量過小,菌體的調(diào)整期長(zhǎng),發(fā)酵周期延長(zhǎng),影響發(fā)酵效率;接種量過大,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快,培養(yǎng)液的理化因子變化快,不利于藍(lán)色素產(chǎn)生,故最適接種量應(yīng)為8%。

    2.4裝液量對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

    在250 mL的搖瓶中,裝液量分別為20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mL的條件下,接種量控制為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵起始pH值為7.2、發(fā)酵時(shí)間9 d,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果見圖4。

    由圖4可知,裝液量在20~100 mL內(nèi),藍(lán)色素的產(chǎn)量隨著裝液量的增加而增加;當(dāng)搖瓶裝液量為100 mL時(shí),藍(lán)色素的產(chǎn)量最高;裝液量超過100 mL后,藍(lán)色素的產(chǎn)量有下降的趨勢(shì)。這是由于裝液量少,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量少、發(fā)酵容積小,影響了藍(lán)色素的產(chǎn)量;然而隨著裝液量的增加,溶氧量減小,不利于藍(lán)色素的產(chǎn)生;故在250 mL的搖瓶中,發(fā)酵的最佳裝液量為100 mL。

    2.5發(fā)酵起始pH值對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響

    在接種量為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為9 d、裝液量為100 mL/250 mL的條件下,將發(fā)酵起始 pH值 分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果見圖5。

    由圖5可知,發(fā)酵起始pH值在5.0~7.6內(nèi),藍(lán)色素產(chǎn)量隨pH值增大而增加;當(dāng)pH值為7.6時(shí),藍(lán)色素的產(chǎn)量最高;pH值超過7.6后,藍(lán)色素的產(chǎn)量明顯下降。這是由于pH值不僅可以影響鏈霉菌的生長(zhǎng),還可能影響藍(lán)色素的穩(wěn)定性;pH值會(huì)影響菌株代謝所需酶的活性,pH值過低或過高都不利于菌體生長(zhǎng),從而影響藍(lán)色素的產(chǎn)量,故發(fā)酵的最適起始pH值為7.6。

    2.6正交試驗(yàn)

    在單因素研究結(jié)果基礎(chǔ)上,按表1安排5因素4水平的正交試驗(yàn)[18],優(yōu)化發(fā)酵條件。

    由表2可知,5個(gè)因素對(duì)D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響的主次為D>C>B>A>E,即裝液量的影響最大,接種量和發(fā)酵溫度的影響次之,發(fā)酵時(shí)間和起始pH值的影響較小。由表3可知,因素C和D在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著影響,而因素A、B和E沒有顯著影響。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果可知,發(fā)酵條件的最佳組合為A2B2C2D3E2,即控制搖床轉(zhuǎn)速為 200 r/min 時(shí),最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度 30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL以及發(fā)酵起始pH值為76,此條件下藍(lán)色素的產(chǎn)量最高。

    2.7驗(yàn)證試驗(yàn)

    由正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果得知最優(yōu)發(fā)酵條件的組合不在16個(gè)試驗(yàn)內(nèi),該發(fā)酵條件是否是真正最優(yōu),還需做實(shí)際驗(yàn)證試驗(yàn)。按最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表4。

    由表4可知,正交優(yōu)化后藍(lán)色素最低產(chǎn)量為74.4 U/mL,藍(lán)色素最高產(chǎn)量為75.1 U/mL;藍(lán)色素的平均產(chǎn)量為 74.8 U/mL,與正交試驗(yàn)結(jié)果中的最高產(chǎn)量73.1 U/mL在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異,由此可知正交優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果可以作為鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的最佳發(fā)酵條件,與優(yōu)化前(56.1 U/mL)比較,藍(lán)色素的產(chǎn)量提高了33.3%。

    3結(jié)論

    本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量、發(fā)酵起始pH值對(duì)鏈霉菌D2013產(chǎn)藍(lán)色素的影響,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以正交試驗(yàn)優(yōu)化了鏈霉菌D2013的發(fā)酵條件。鏈霉菌D2013在固定的搖床轉(zhuǎn)速(200 r/min)下最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間8 d、發(fā)酵溫度 30 ℃、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL、發(fā)酵起始pH值7.6,藍(lán)色素的平均產(chǎn)量達(dá)到74.8 U/mL。

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