lncRNA HOTTIP調(diào)控消化系統(tǒng)惡性腫瘤的作用機制及其研究進展

張亞陸 綜述 艾開興 審校

人類基因組中，具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因序列不到2%［1］，絕大多數(shù)被轉錄生成非編碼RNA，不參與生成具有生物學功能的蛋白質(zhì)。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的核苷酸系列長度＞200 nt，其轉錄過程與mRNA相似，大多數(shù)經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ轉錄后，再經(jīng)過加帽、剪切以及加尾修飾而成［2-3］。隨著基因芯片和基因測序等技術的不斷進步，越來越多的lncRNAs被發(fā)掘出來，目前已發(fā)現(xiàn)近三萬種 lncRNAs［4］。lncRNAs不編碼任何蛋白質(zhì)，但可以通過表觀遺傳學修飾、轉錄以及轉錄后加工等多層面調(diào)控基因的表達［5］。

近年大量證據(jù)顯示，lncRNAs作為調(diào)控因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用［6-7］。在眾多的ln?cRNAs中，HOXA遠端轉錄本（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）成為近年研究熱點，目前已發(fā)現(xiàn)HOTTIP 基因與食管癌［8］、胃癌［9］、肝癌［10］、胰腺癌［11］、結直腸癌［12］等常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤的病理過程密切相關（表1［4］）。

1 HOX和HOXA基因

根據(jù)染色體的位置可將HOX家族中的39個基因分為4簇：HOXA（7p15.3）、HOXB（17q21.3）、HOXC（12q13）和HOXD（2q31）［13］。HOX基因簇的表達具有時空共線性，而正是這種表達模式使得軀體解剖結構的近心端至遠心端與HOX基因的3'端至5'端具有線性對應關系［14］，表現(xiàn)為3'端的基因表達的早且調(diào)控軀體軸近端的發(fā)育，而5'端的基因表達的晚且調(diào)控軀體軸遠端的發(fā)育［15］。而其修飾改變可能導致腫瘤的發(fā)生，在一些實體腫瘤和血液病患者中均能觀察到HOX基因簇的表達異常［16-17］。

HOXA基因簇的表達異常同樣與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。如HOXA7、HOXA9、HOXA11被認為是急性粒細胞性白血病細胞遺傳學異常的基因標志［18］。HOXA13是胃癌組織中表達量最高的基因之一，腫瘤分期越晚，HOXA13的表達量越高。沉默HOXA13基因可顯著地抑制胃癌上皮細胞向間質(zhì)細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［19］。此外，在肝癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中HOXA13也起著類似的重要作用［20-21］。

2 HOTTIP的發(fā)現(xiàn)和作用機制

lncRNA HOTTIP最初發(fā)現(xiàn)于軀體解剖結構遠心端（如手足部和包皮）的成纖維細胞中［22］。HOTTIP基因位于HOXA基因簇的5'端（染色體7p15.2），因而被稱為“HOXA遠端轉錄本”。HOTTIP基因與HOXA13基因毗鄰（圖1［23］），且位于HOXA13基因上游330 bp處。與HOXA13相同，其表達于軀體遠端解剖位點，從胚胎到成年一直保持著保守的表達模式。

表1 HOTTIP在消化系統(tǒng)腫瘤中的功能特點Table 1 HOTTIP functional features in the digestive system tumors

圖1 HOTTIP與HOXA基因簇的分布Figure 1 The distribution of HOTTIP and HOXA gene cluster

HOXA基因簇5'端表現(xiàn)為緊密的環(huán)狀結構，這種結構使得HOTTIP基因在空間位置上與HOXA 5'端的多個基因序列極其接近，從而有利于HOTTIP發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。混合系白血病蛋白（mixed lineage leuke?mia，MLL）、三胸家族蛋白（trithorax，Trx）和多梳家族蛋白（polycomb-group proteins，PcG）控制著HOX基因的“開”、“關”狀態(tài)，而這兩種狀態(tài)依賴于通過介導組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化（H3K4me3）激活基因以及通過調(diào)節(jié)組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3）以抑制基因而實現(xiàn)［24］。HOTTIP RNA定位并結合到WDR5/MLL復合物上，作用于HOXA 5'端的基因位點，使得相應結構域廣泛的H3K4me3激活轉錄。這提示HOTTIP對協(xié)調(diào)激活HOXA基因簇5'端的基因是不可或缺的［22，25］。

在末梢成纖維細胞中，沉默HOTTIP會抑制位于HOXA 5'端基因的表達。其中，抑制效應最強的是距離HOTTIP最近的HOXA13和HOXA11基因，并且對HOXA10、HOXA9、HOXA7基因的抑制效應隨著與HOTTIP基因距離的增加而逐漸減弱［22］。而在腫瘤細胞中，HOTTIP與HOXA 5'端多個基因（尤其是HOXA13）表達調(diào)控關系同樣保持著這種特點。在肝癌、胃癌以及胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HOTTIP的基因沉默使得HOXA13、HOXA11、HOXA10表達量呈階梯式變化，并且HOTTIP和HOXA13具有良好的相關性［10，23，26-27］。

與上述報道不同，Cheng等［11］在沉默胰腺癌細胞HOTTIP基因后，HOXA13的表達量并無明顯下降，而HOXA11、HOXA10、HOXA9基因的表達量卻出現(xiàn)了明顯的降低。因此，該研究認為HOTTIP并不參與調(diào)節(jié)HOXA13的表達，而是通過對HOXA11、HOXA10以及下游靶基因的調(diào)節(jié)而增強胰腺癌細胞的轉移和侵襲能力。這種差異性結果可能與腫瘤組織的類型不同、細胞系的不同以及實驗的具體條件不同等有關。

3 HOTTIP和消化系統(tǒng)腫瘤的關系

3.1 HOTTIP與胃癌

近幾十年，盡管醫(yī)學的不斷發(fā)展極大地減少了全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率和死亡率，但目前胃癌仍是世界第三大致死性癌癥［28］。Ye等［9］對98例胃癌患者臨床資料的回顧性研究證實，與鄰近正常組織相比，胃癌組織中HOTTIP的水平明顯升高。HOTTIP高表達組的患者腫瘤體積更大，浸潤更深，淋巴結轉移比率更高，臨床分期也更晚。下調(diào)HOTTIP在胃癌細胞系中的表達后，降低了癌細胞增殖的速率，減弱了其侵襲和轉移能力，同時促進腫瘤細胞的凋亡。HOTTIP高表達是影響胃癌患者預后的不利因素。Chang等［29］還發(fā)現(xiàn)HOTTIP和HOXA13均在胃癌組織中顯著表達，且HOXA13還參與HOTTIP介導的胃癌細胞惡性表型的形成，兩者在胃癌和癌旁組織中均具有顯著相關性。Wang等［27］認為沉默HOXA13基因會引起HOTTIP和胰島素樣生長因子結合蛋白3（in?sulin growth factor-binding protein 3，IGFBP-3）基因的下調(diào)，提示兩者可能均為HOXA13的下游靶點。HOXA13通過HOX結合位點反式激活IGFBP-3的啟動子，激活的IGFBP-3具有刺激致癌基因的潛在活性。因此，認為HOXA13-HOTTIP-IGFBP-3軸可能是胃癌中致癌基因的一條重要路徑。

3.2 HOTTIP與肝癌

肝細胞癌（hepatocellular carcinomas，HCC）占所有原發(fā)性肝癌的90%以上，亞洲每年有超過58萬的新發(fā)HCC病例［30］。

Quagliata等［10］對52例未經(jīng)過任何特異性治療的HCC患者進行肝臟活組織穿刺，研究認為HOTTIP和HOXA13在HCC組織中的表達顯著增加，并且HOTTIP/HOXA13高表達的HCC患者其腫瘤轉移率更高，總體生存率更低。進一步研究表明，在肝癌細胞中的HOTTIP和HOXA13之間存在著雙向調(diào)節(jié)環(huán)路，抑制HOTTIP的表達會使HOXA13表達下降，同樣，沉默HOXA13基因也會降低HOTTIP的表達。Tsang等［23］發(fā)現(xiàn)在體外沉默HOTTIP會減弱HCC細胞的增殖、抑制腫瘤的形成，并發(fā)現(xiàn)HOTTIP表達上調(diào)的小鼠有利于HCC的肝外轉移（尤其肺部）。通過熒光素酶報告分析還發(fā)現(xiàn)，miR-125b對HOTTIP有負性調(diào)節(jié)作用，miR-125b的缺失也許是導致HCC患者HOTTIP表達增加的因素之一。除此之外，Ge等［31］發(fā)現(xiàn)miR-192和miR-204同樣對HOTTIP有著直接抑制作用。在HCC患者體內(nèi)，谷氨酰胺酶（GLS1）基因是miR-192/-204-HOTTIP軸的下游靶點，而谷氨酰胺代謝是癌細胞內(nèi)重要的代謝過程，所以沉默GLS1會引發(fā)癌細胞內(nèi)谷氨酰胺代謝障礙，進而抑制癌細胞活性。因此，可以推斷miR-192/-204-HOTTIP軸是通過抑制GLS1的表達來阻斷HCC細胞的谷氨酰胺代謝，進而抑制癌細胞的增殖。

3.3 HOTTIP與胰腺癌

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是所有人類腫瘤類型中生存率最差的腫瘤之一，患病率和死亡率幾乎持平，中位生存時間僅4個月左右［32］。其中，胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是PC中最常見的類型。

Cheng等［11］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞中HOTTIP表達量顯著增高，而沉默HOTTIP可抑制癌細胞的增殖和轉移，誘導癌細胞的凋亡。通過利用siHOTTIP轉染Panc1細胞系后，檢測到757個基因表達增加，同時伴有515個基因表達降低，這意味著HOTTIP基因的調(diào)控網(wǎng)絡極其復雜。Li等［26］認為沉默HOTTIP的表達會抑制胰腺癌細胞的EMT過程，進而引起癌細胞侵襲性減弱。此外，裸鼠荷瘤實驗證實，沉默HOTTIP能夠顯著增加胰腺癌對吉西他濱的化療敏感性。Wang等［33］從PC組織中的7 419個lncRNA中篩選出高表達的lncRNA：HOTTIP-005（HOTTIP的剪接異構體）和RP11-567G11.1。通過檢測發(fā)現(xiàn)血漿中HDRF和RDRF（分別為HOTTIP-005和RP11-567G11.1來源的RNA片段）的存在形式穩(wěn)定，而且和122例健康對照者相比發(fā)現(xiàn)，127例PC患者血漿中HDRF和RDRF顯著增高（P＜0.000 1），同時具有很高的特異度和靈敏度，這提示血漿中HDRF和RDRF聯(lián)合或取代血清腫瘤標志物CA199作為胰腺癌高危人群的篩查手段成為可能。

與Wang等［33］的研究相對應，Xie等［34］研究了人唾液中的HOTTIP含量是否可以作為PC的診斷指標。該研究篩選出了HOTAIR、HOTTIP和PVT1三種獨立的lncRNA作為候選診斷標志。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，雖然與正常胰腺組織（normal pancreatic tissues，NPT）和良性胰腺腫瘤（benign pancreatic tumor，BPT）相比，PC組織中HOTAIR、HOTTIP和PVT1的表達量均顯著增高，但唾液中HOTTIP的含量與NPT和BPT組織并無顯著差異，而唾液中HOTAIR和PVT1的表達量仍顯著性增高。推測可能是PC組織產(chǎn)生的某種介質(zhì)通過血液循環(huán)到達唾液腺而改變HOTAIR和PVT1基因的表達，但對HOTTIP基因的表達無明顯影響。雖然該研究證實，唾液中HOTTIP RNA含量并不能作為胰腺癌的診斷指標，但提供了新的思路，即探究非侵入性操作所獲體液中l(wèi)ncRNA的含量是否可以作為診斷腫瘤的依據(jù)。

3.4 HOTTIP與其他消化系統(tǒng)腫瘤

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carci?noma，ESCC）是中國食管癌中最主要的亞型，發(fā)病率占我國所有食管癌的90%以上［35］。ESCC組織中HOTTIP的表達量顯著高于癌旁組織，且主要集中于晚期腫瘤組織和體積較大的腫瘤。抑制HOTTIP的作用可以阻滯ESCC細胞EMT過程，進而使得癌細胞的轉移及侵襲能力下降［8］。HOTTIP RNA不僅可以通過H3K4me3或H3K27me3在轉錄水平上調(diào)控HOXA13基因的表達，而且可以在轉錄后作為miR-30b的競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceR?NA）對HOXA13進行調(diào)控，進而促使ESCC的發(fā)生和轉移。HOTTIP-miR-30b-HOXA13軸也許可以作為潛在的診斷標志和藥物靶點［36］。

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大常見的惡性腫瘤，在西方國家有著更高的發(fā)病率，全球每年有超過130萬新發(fā)病例，超過60萬人死于結直腸癌［35］。和鄰近正常組織相比，HOTTIP在CRC組織中的表達量顯著增高，并且和腫瘤體積、臨床分期以及遠處轉移有密切關系。通過多變量分析顯示，HOTTIP高表達是CRC患者獨立的負性預后影響因子［37］。在裸鼠體內(nèi)，抑制HOTTIP的表達會減慢CRC的生長速度。通過Western blot和免疫組織化學法分析證實，HOTTIP可能是通過沉默P21基因而促進CRC細胞的生長［2］。

4 結語

HOTTIP除了在消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮促癌作用外，在肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和前列腺癌等非消化系統(tǒng)腫瘤中同樣表現(xiàn)為促癌作用［38-41］。但在膠質(zhì)瘤中正好相反，表現(xiàn)為類似抑癌基因的作用［42］。因此，HOTTIP的作用機制較為復雜。

目前HOTTIP在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中作用的研究依然不夠深入，仍需大量研究進行補充驗證，而且主要局限于其在腫瘤生物學行為以及患者預后方面的影響。研究依然處于體外細胞實驗和動物實驗階段，尚無直接證據(jù)表明HOTTIP能夠真正用來治療或診斷消化系統(tǒng)腫瘤。因此，進一步對其調(diào)控機制進行研究，同時探究是否存在另外的調(diào)節(jié)路徑，并且根據(jù)調(diào)節(jié)通路研發(fā)治療腫瘤的相關藥物是未來HOTTIP的研究方向之一。

本研究希望能夠在患者的血液、唾液、排泄物等標本中直接或間接地檢測到HOTTIP的表達異常，可以為消化系統(tǒng)腫瘤早期診斷以及預后判斷提供依據(jù)。類似胰腺癌患者血漿中HDRF的顯著升高，是否在其他消化系統(tǒng)腫瘤中存在著另外的檢測途徑或檢測指標是未來研究的另一重要方向。

綜上所述，HOTTIP可促進常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，抑制癌細胞的凋亡，其高表達與患者的淋巴結轉移和總體生存時間密切相關［43］。因此，繼續(xù)對HOTTIP具體作用機制進行更為深入的研究，能夠使臨床更好地理解消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，并有望為腫瘤的診斷方法和治療策略開辟新的道路。

[1]Wilusz JE,Sunwoo H,Spector DL.Long noncoding RNAs:functional surprises fromthe RNA world[J].Genes&Development,2009,23(13):1494-1504.

[2]Guttman M,Amit I,Garber M,et al.Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals[J].Nature,2009,458(7235):223-227.

[3]Yoon JH,Kim J,Gorospe M.Long noncoding RNA turnover[J].Biochimie,2015,117:15-21.

[4]LianY,Cai Z,GongH,et al.HOTTIP:acritical oncogeniclongnon-coding RNA in human cancers[J].Mol Biosyst,2016,12(11):3247-3253.

[5]Pandey RR,Kanduri C.Transcriptional and posttranscriptional programming by long noncoding RNAs[J].Prog Mol Subcell Biol,2011,51:1-27.

[6]Huarte M.The emerging role of lncRNAs in cancer[J].Nat Med,2015,21(11):1253-1261.

[7]Schmitt AM,Chang HY.Long noncoding RNAs in cancer pathways[J].Cancer Cell,2016,29(4):452-463.

[8]Chen X,Han H,Li Y,et al.Upregulation of long noncoding RNA HOTTIP promotes metastasis of esophageal squamous cell carcinoma via induction of EMT[J].Oncotarget,2016,7(51):84480-84485.

[9]Ye H,Liu K,Qian K.Overexpression of long noncoding RNA HOTTIP promotes tumor invasion and predicts poor prognosis in gastric cancer[J].Onco Targets Ther,2016,9(1):2081-2088.

[10]QuagliataL,MatterMS,PiscuoglioS,etal.LongnoncodingRNAHOTTIP/HOXA13 expression is associated with disease progression and predicts outcome in hepatocellular carcinoma patients[J].Hepatology,2014,59(3):911-923.

[11]Cheng Y,Jutooru I,Chadalapaka G,et al.The long non-coding RNA HOTTIP enhances pancreatic cancer cell proliferation,survival and migration[J].Oncotarget,2015,6(13):10840-10852.

[12]Lian Y,Ding J,Zhang Z,et al.The long noncoding RNA HOXA transcript at the distal tip promotes colorectal cancer growth partially via silencing of p21 expression[J].Tumour Biol,2016,37(6):7431-7440.

[13]Quinonez SC,Innis JW.Human HOX gene disorders[J].Mol Genet Metab,2014,111(1):4-15.

[14]Duboule D,Morata G.Colinearity and functional hierarchy among genes of the homeotic complexes[J].Trends Genet,1994,10(10):358-364.

[15]Lajoie BR,van Berkum NL,Sanyal A,et al.My5C:web tools for chromosome conformation capture studies[J].Nat Methods,2009,6(10):690-691.

[16]Mo RJ,Lu JM,Wan YP,et al.Decreased HoxD10 expression promotes a proliferative and aggressive phenotype in prostate cancer[J].Curr Mol Med,2017,17(1):70-78.

[17]Kontro M,Kumar A,Majumder MM,et al.HOX gene expression predicts response to BCL-2 inhibition in acute myeloid leukemia[J].Leukemia,2016,31(2):301-309.

[18]Li Z,Huang H,Li Y,et al.Up-regulation of a HOXA-PBX3 homeobox-gene signature following down-regulation of miR-181 is associated with adverse prognosis in patients with cytogenetically abnormal AML[J].Blood,2012,119(10):2314-2324.

[19]He YX,Song XH,Zhao ZY,et al.HOXA13 upregulation in gastric cancer is associated with enhanced cancer cell invasion and epithelial-tomesenchymal transition[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(2):258-265.

[20]Pan TT,Jia WD,Yao QY,et al.Overexpression of HOXA13 as a potential marker for diagnosis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Tohoku J Exp Med,2014,234(3):209-219.

[21]Hu H,Chen Y,Cheng S,et al.Dysregulated expression of homebox gene HOXA13 is correlated with the poor prognosis in bladder cancer[J].Wien Klin Wochenschr,2017,129(11-12):391-397.

[22]Wang KC,Yang YW,Liu B,et al.A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression[J].Nature,2011,472(7341):120-124.

[23]Tsang FH,Au SL,Wei L,et al.Long non-coding RNA HOTTIP is frequently up-regulated in hepatocellular carcinoma and is targeted by tumour suppressive miR-125b[J].Liver Int,2015,35(5):1597-1606.

[24]Schuettengruber B,Chourrout D,Vervoort M,et al.Genome regulation by polycomb and trithorax proteins[J].Cell,2007,128(4):735-745.

[25]Pradeepa MM,McKenna F,Taylor GC,et al.Psip1/p52 regulates posterior Hoxa genes through activation of lncRNA Hottip[J].PLoS Genet,2017,13(4):e1006677.

[26]Li Z,Zhao X,Zhou Y,et al.The long non-coding RNA HOTTIP promotes progression and gemcitabine resistance by regulating HOXA13 in pancreatic cancer[J].J Transl Med,2015,13(1):84-99.

[27]Wang SS,Wuputra K,Liu CJ,et al.Oncogenic function of the homeobox A13-long noncoding RNA HOTTIP-insulin growth factor-binding protein 3 axis in human gastric cancer[J].Oncotarget,2016,7(24):36049-36064.

[28]Duraes C,Almeida GM,Seruca R,et al.Biomarkers for gastric cancer:prognostic,predictive or targets of therapy[J]?Virchows Arch,2014,464(3):367-378.

[29]Chang S,Liu J,Guo S,et al.HOTTIP and HOXA13 are oncogenes associated with gastric cancer progression[J].Oncol Rep,2016,35(6):3577-3585.

[30]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[31]Ge Y,Yan X,Jin Y,et al.MiRNA-192 and miRNA-204 directly suppress lncRNA HOTTIP and interrupt GLS1-mediated glutaminolysis in hepatocellular carcinoma[J].PLoS Genet,2015,11(12):e1005726.

[32]Sharma C,Eltawil KM,Renfrew PD,et al.Advances in diagnosis,treatment and palliation of pancreatic carcinoma:1990-2010[J].World J Gastroenterol,2011,17(7):867-897.

[33]Wang Y,Li Z,Zheng S,et al.Expression profile of long non-coding RNAs in pancreatic cancer and their clinical significance as biomarkers[J].Oncotarget,2015,6(34):35684-35698.

[34]Xie Z,Chen X,Li J,et al.Salivary HOTAIR and PVT1 as novel biomarkers for early pancreatic cancer[J].Oncotarget,2016,7(18):25408-25419.

[35]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[36]Lin C,Wang Y,Zhang S,et al.Transcriptional and posttranscriptional regulation of HOXA13 by lncRNA HOTTIP facilitates tumorigenesis and metastasis in esophageal squamous carcinoma cells[J].Oncogene,2017,36(38):5392-5406.

[37]Ren YK,Xiao Y,Wan XB,et al.Association of long non-coding RNA HOTTIP with progression and prognosis in colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):11458-11463.

[38]Sang Y,Zhou F,Wang D,et al.Up-regulation of long non-coding HOTTIP functions as an oncogene by regulating HOXA13 in non-small cell lung cancer[J].Am J Transl Res,2016,8(5):2022-2032.

[39]Yang Y,Qian J,Xiang Y,et al.The prognostic value of long noncoding RNA HOTTIP on clinical outcomes in breast cancer.[J].Oncotarget,2016,8(4):6833-6844.

[40]Li Z,Zhao L,Wang Q.Overexpression of long non-coding RNA HOTTIP increases chemoresistance of osteosarcoma cell by activating the Wnt/β-catenin pathway.[J].Am J Transl Res,2016,8(5):2385-2393.

[41]Zhang SR,Yang JK,Xie JK,et al.Long noncoding RNA HOTTIP contributes to the progression of prostate cancer by regulating HOXA13[J].Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2016,62(3):84-88.

[42]Xu L M,Chen L,Li F,et al.Over-expression of the long non-coding RNA HOTTIP inhibits glioma cell growth by BRE[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):162-176.

[43]Chen Z,He A,Wang D,et al.Long noncoding RNA HOTTIP as a novel predictor of lymph node metastasis and survival in human cancer:a systematic reviewand meta-analysis[J].Oncotarget,2016,8(8):14126-14132.