基于超高效串聯(lián)質(zhì)譜的氨基酸代謝組學(xué)預(yù)測(cè)晚期乳腺癌化療反應(yīng)初探*

徐君南 李曉睿 孫濤

近年來，乳腺癌的死亡率隨著手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等綜合治療水平提高而降低［1］，但晚期乳腺癌患者的預(yù)后仍不佳，生存質(zhì)量不理想，這與腫瘤耐藥和個(gè)體化差異密不可分。在腫瘤個(gè)體化治療時(shí)代，化療在乳腺癌多學(xué)科綜合治療中仍占重要地位，原發(fā)性耐藥嚴(yán)重影響化療的療效。目前，包括CEA在內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物尚不能對(duì)晚期乳腺癌化療療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，影像學(xué)監(jiān)測(cè)腫瘤疾病進(jìn)展至少需要化療2～4個(gè)療程。因此，臨床上亟需用于早期評(píng)估化療療效的生物標(biāo)志物。代謝紊亂與多種常見癌癥包括乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］，研究顯示體內(nèi)循環(huán)血液中的多種氨基酸可作為鑒別乳腺腫瘤良惡性的生物標(biāo)志物［3-4］。本研究基于超高效串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)氨基酸，探討其含量水平變化與晚期乳腺癌患者化療敏感性之間的相關(guān)性，及能否較影像學(xué)更早預(yù)測(cè)化療療效。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2015年3月至2016年10月73例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并于遼寧省腫瘤醫(yī)院行化療的女性晚期乳腺癌患者，穿刺活檢的組織學(xué)確診為乳腺癌來源。對(duì)有明確預(yù)后的患者，分為惡化（疾病進(jìn)展）組43例和好轉(zhuǎn)（完全緩解、部分緩解和疾病穩(wěn)定）組30例。分別采集所有患者在化療前和化療第1個(gè)療程后的外周血2 mL，分析氨基酸含量水平的變化。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本收集及處理 采用EDTA真空抗凝管收集患者全血2 mL，收集血液后必須在2 h內(nèi)分離血漿和血細(xì)胞，分離條件為常溫或4℃，3 000 r/min離心10 min，分離的血漿和血細(xì)胞樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。血漿樣本用于氨基酸檢測(cè)。

1.2.2 血清中氨基酸含量水平的檢測(cè) 根據(jù)Tan等［5］報(bào)道的血清氨基酸檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，基于LCMS/MS平臺(tái)，將樣品盤置于60℃恒溫和N2下，50℃吹干。樣品吹干后，加入60 μL衍生試劑，密封，60℃孵育15～30 min進(jìn)行衍生化。復(fù)溶、進(jìn)樣衍生后溶液N2下，50℃吹干。使用100 μL流動(dòng)相（80%乙腈+20%水+0.02%甲酸）再溶解吹干物，取20 μL進(jìn)樣，進(jìn)行LC-MS/MS分析。共檢測(cè)33種氨基酸，包括作為內(nèi)標(biāo)的正纈氨酸及甘氨酸等32種氨基酸。

1.2.3 療效評(píng)價(jià) 對(duì)所有患者采用RECIST1.1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)體瘤化療療效進(jìn)行評(píng)估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）與進(jìn)展（PD）。CR為治療后腫瘤病灶完全消失；PR為腫瘤病灶大小縮小≥30%，且無新病灶出現(xiàn)；SD為腫瘤病灶大小無明顯變化，包括腫瘤病灶大小縮小不到＜或增大＜20%；PD為腫瘤病灶大小增大≥20%或出現(xiàn)新病灶。好轉(zhuǎn)組包括CR、PR和SD患者，惡化組包括PD患者。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)（上/下四分位數(shù)）表示；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示。臨床特征與化療療效之間相關(guān)性采用Fisher's精確檢驗(yàn)，基線與預(yù)后差異比較采用獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)，t值為負(fù)數(shù)表示預(yù)后上升，t值為正數(shù)表示預(yù)后下降。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期乳腺癌患者的療效

73例患者中，中位年齡為54（32～78）歲，行化療2～4個(gè)療程后行療效評(píng)估。其中好轉(zhuǎn)組30例中無CR、13例為PR、17例為SD，惡化組43例均為PD。好轉(zhuǎn)組中絕經(jīng)后、ER陽性、PR陽性、HER-2陽性和Ki-67陽性患者的比例分別為34.88%（15/43）、45.24%（19/42）、45.71%（16/35）、47.06%（8/17）和33.33%（12/36），好轉(zhuǎn)組與惡化組中的絕經(jīng)后、ER陽性、PR陽性、HER-2陽性和Ki-67陽性進(jìn)行比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。好轉(zhuǎn)組及惡化組患者行一線、二線和多線治療的比例分別為36.7%（11/30）、33.3%（10/30）和30.0%（9/30）及39.5%（17/43）、25.6%（11/43）和34.9%（15/43），治療線數(shù)與患者預(yù)后之間無相關(guān)性（表1）。

表1 73例晚期乳腺癌患者的臨床特征與化療療效之間相關(guān)性Table 1 Correlation between the clinical characteristics and chemotherapy response in 73 patients with advanced breast cancer

2.2 晚期乳腺癌患者行聯(lián)合或單藥化療方案與療效之間相關(guān)性

73例患者的治療方案中，11例曲妥珠單抗治療包括曲妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇（HT）、卡培他濱（HX）、長(zhǎng)春瑞濱（HN）及紫杉醇和卡培他濱（HTX），25例聯(lián)合化療方案包括吉西他濱聯(lián)合順鉑（GP）、吉西他濱聯(lián)合紫杉醇（GT）、紫杉醇聯(lián)合卡培他濱（TX）、長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合卡培他濱（NX）和長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合順鉑（NP），37例單藥化療方案包括紫杉醇（T）、卡培他濱（X）和長(zhǎng)春瑞濱（N）等，治療方案與患者療效無相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

2.3 晚期乳腺癌患者行化療前和化療第1個(gè)療程后的氨基酸含量水平的比較

32種氨基酸含量水平為3～180 000 pmol/L。與基線相比，好轉(zhuǎn)組的甘氨酸（圖1A）和L-谷氨酰胺含量水平顯著上升，而惡化組顯著下降，可以作為區(qū)分療效的主要標(biāo)志物；好轉(zhuǎn)組的肌氨酸（圖1B）含量水平顯著下降，而惡化組變化不明顯；好轉(zhuǎn)組的2-吡咯甲酸（圖1C）、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、O-乙酰絲氨酸、DL-蛋氨酸亞砜、L-苯丙氨酸、L-瓜氨酸、L-酪氨酸和L-犬尿氨酸共9個(gè)氨基酸含量水平顯著上升，而惡化組變化不明顯；好轉(zhuǎn)組的L-丙氨酸（圖1D）和L-組氨酸的含量水平變化不明顯，而惡化組顯著下降；好轉(zhuǎn)組的L-天冬酰胺（圖1E）和L-脯氨酸的含量水平變化不明顯，而惡化組顯著上升；好轉(zhuǎn)組和惡化組的L-蘇氨酸（圖1F）、?；撬?、亞氨基二乙酸和L-谷氨酸的含量水平均顯著上升；好轉(zhuǎn)組和惡化組的α-甲基-β-丙氨酸、亞磺酸、L-纈氨酸、4-羥基-L-脯氨酸、L-絲氨酸、4-胍基丁酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、N-乙酰-L-天門冬氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸和羥基苯乙酰甘氨酸含量水平均無明顯變化（表3）。

表2 73例晚期乳腺癌患者的治療方案與化療療效相關(guān)性Table 2 Correlation between the therapy regime and response to chemotherapy of 73 patients with advanced breast cancer

圖1 73例晚期乳腺癌患者惡化組和好轉(zhuǎn)組中基線與預(yù)后代表性氨基酸含量水平比較Figure 1 Comparison of the representative aminoacid levels between the baseline and prognosis in the deterioration and improvement groups in 73 patients with advanced breast cancer

表3 73例晚期乳腺癌患者的好轉(zhuǎn)組和惡化組基線與預(yù)后的氨基酸含量水平比較Table 3 Comparison of the aminoacid levels between the baseline and prognosis in the improvement and deterioration groups in 73 patients with advanced breast cancer

3 討論

LC-MS/MS作為遺傳代謝性疾病的早期檢測(cè)和診斷平臺(tái)，結(jié)合色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高鑒別特點(diǎn)，具有高特異性、高精準(zhǔn)度和高自動(dòng)化程度的優(yōu)勢(shì)。目前乳腺癌的化療療效評(píng)價(jià)主要是依靠影像學(xué)，通過觀察腫瘤體積判斷治療效果，但影像學(xué)監(jiān)測(cè)腫瘤疾病進(jìn)展至少需要化療2～4個(gè)療程。研究顯示，化療后腫瘤自身以及腫瘤微環(huán)境中氨基酸代謝水平的變化可能早于腫瘤體積變化［6-7］，因此可根據(jù)腫瘤微環(huán)境中氨基酸代謝組學(xué)的變化來反映腫瘤組織的變化。氨基酸的影響因素為多方面，包括疾病狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況和飲食等。本研究結(jié)果顯示，好轉(zhuǎn)組的甘氨酸和L-谷氨酰胺含量水平顯著上升，而惡化組顯著下降，可以作為區(qū)分療效的主要標(biāo)志物；好轉(zhuǎn)組的肌氨酸含量水平顯著下降，而惡化組變化不明顯。甘氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸這3個(gè)代謝指標(biāo)可用來指導(dǎo)乳腺癌患者的預(yù)后，為優(yōu)化晚期乳腺癌個(gè)體化治療策略提供依據(jù)。乳腺癌患者的谷氨酸和天門冬氨酸含量水平顯著低于健康人群的含量水平［8-9］。關(guān)于氨基酸含量水平變化與乳腺癌療效相關(guān)性研究，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)術(shù)前氨基酸含量水平與乳腺癌新輔助化療療效呈正相關(guān)［10］，且在惡性黑色素瘤患者中可見部分氨基酸成分與蒽環(huán)藥物化療療效呈正相關(guān)，其中基于月桂酰胺和白三烯B4二甲基酰胺建立預(yù)測(cè)化療有效率的模型具有較高的敏感性和特異性［5］。Yoon等［11］研究顯示，與乳腺癌不同分子分型有關(guān)的肌氨酸的代謝蛋白GNMT、SARDH和PIPOX表達(dá)存在顯著性差異，有助于分子分型診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)。

綜上所述，本研究初步結(jié)果表明，甘氨酸、L-谷氨酰胺和肌氨酸的含量水平在化療第1個(gè)療程后的變化對(duì)晚期乳腺癌化療療效具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，較影像學(xué)檢查可能更早預(yù)測(cè)化療療效，有助于優(yōu)化晚期乳腺癌的治療策略。本研究尚存在一定的局限性，病例數(shù)相對(duì)較少，涉及化療方案較多。因此，本研究的可重復(fù)性和可靠性還有待在大樣本的前瞻性研究中進(jìn)一步證實(shí)。

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