TUBB3的表達(dá)對(duì)晚期胃癌紫杉類藥物化療療效和預(yù)后的影響*

劉新福 尹嬋 張輝 劉騰飛

據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，胃癌居世界最常見的惡性腫瘤第4位，死亡率居第2位［1］。中國(guó)屬胃癌高發(fā)區(qū)域，占世界發(fā)病人數(shù)的42%，多數(shù)病例常在晚期才會(huì)被確診，單純手術(shù)的療效差，術(shù)后5年生存率低，因此化學(xué)治療在晚期胃癌的綜合治療中占有重要地位。目前，晚期胃癌的化療仍然缺乏國(guó)際上廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，多以氟尿嘧啶、紫杉醇、鉑類、伊立替康、蒽環(huán)類藥物較為常見。大部分研究表明β-微管蛋白Ⅲ（ClassⅢ β-tubulin，TUBB3）在肺癌、卵巢癌、頭頸部等多種腫瘤中表達(dá)，其表達(dá)水平與抗微管類化療藥（如紫杉醇、多西紫杉醇等）療效及患者的生存預(yù)后密切相關(guān)［2-6］。但目前還存在一些爭(zhēng)議，有研究表明，肺癌中TUBB3的表達(dá)不能預(yù)測(cè)患者預(yù)后［7-8］，然而TUBB3在胃癌中研究相對(duì)較少。本研究從臨床實(shí)際出發(fā)，收集臨床晚期胃癌病例，檢測(cè)胃癌組織中TUBB3的表達(dá)水平，分析其與化療敏感性及預(yù)后相關(guān)性，從而為制定個(gè)體化化療方案及判斷預(yù)后提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取邵陽市中心醫(yī)院2008年12月至2011年12月臨床及隨訪資料完整并經(jīng)病理學(xué)確診的晚期胃癌患者49例進(jìn)行回顧性分析（包括失去手術(shù)指征的晚期胃癌及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的胃癌患者）。入組標(biāo)準(zhǔn)：1）所有患者均經(jīng)病理確診，隨訪資料完整且病理標(biāo)本充足；2）所有患者按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進(jìn)行評(píng)定，均屬于Ⅳ期，體力狀況ECOG評(píng)分≤2分，預(yù)計(jì)生存期在3個(gè)月以上；3）無重要器官功能嚴(yán)重受損，血常規(guī)、肝腎功能均在正常范圍內(nèi)，無明顯化療禁忌證，可耐受化療；4）治療前3個(gè)月內(nèi)均未接受放化療、生物治療及中藥治療；5）經(jīng)CT、MRI、胃鏡及超聲內(nèi)鏡等檢查方法證實(shí)具有至少一個(gè)可測(cè)量的腫瘤病灶，以便化療后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，能進(jìn)行隨訪并預(yù)計(jì)依從性好；6）至少接受2個(gè)周期以上的化療周期。在49例晚期胃癌組織中，有3例患者因組織標(biāo)本太少被剔除，本研究共入組晚期胃癌有效病例數(shù)46例，全組病例臨床資料見表1，各組基線之間具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）哺乳期、妊娠婦女患者；2）有對(duì)研究藥物過敏史或高過敏體質(zhì)者；3）有其他嚴(yán)重心腦疾病，嚴(yán)重肝腎功能不全患者；4）近3個(gè)月內(nèi)接受過放化療及生物治療；5）病理標(biāo)本、病史資料或影像學(xué)資料保存不全者。同時(shí)收集所有患者臨床資料，包括患者病區(qū)、性別、年齡、術(shù)后病檢報(bào)告、影像學(xué)報(bào)告等。

1.2 方法

1.2.1 化療方案及臨床療效評(píng)價(jià) 患者均簽署化療知情同意書，接受紫杉醇（海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）或多西紫杉醇（艾素，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）為基礎(chǔ)的化療，具體用法：多西紫杉醇75 mg/m2，靜脈滴注d1或紫杉醇150～175 mg/m2，靜脈滴注，d1，每3周重復(fù)，化療前均予地塞米松、非那根等預(yù)處理，防止過敏反應(yīng)發(fā)生。其中DCF方案（多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶）36例，TP方案（紫杉醇/多西紫杉醇+順鉑）11例，多西他賽單藥方案2例；對(duì)于年齡＞70歲、PS評(píng)分為2分或一般情況較差的患者化療藥物的劑量稍微減量，對(duì)能夠耐受的患者給予4～6個(gè)周期化療，未完成2個(gè)周期化療或失訪的患者作為脫落病例，至少2個(gè)周期化療后納入療效評(píng)價(jià)。每例患者治療2個(gè)周期后，重新復(fù)查胸部+全腹部+盆腔增強(qiáng)CT、胃鏡，部分患者復(fù)查超聲內(nèi)鏡、消化道鋇餐及全身骨掃描檢測(cè)。參照RECIST 1.1實(shí)體瘤評(píng)價(jià)療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和進(jìn)展（progression disease，PD），定義如下：CR定義為臨床癥狀完全消失并且CT檢查病灶完全消失；PR定義為CT檢查所有的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑及其垂直徑乘積縮小50%以上，并且沒有新的病灶出現(xiàn)；SD定義為所有的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑及其垂直徑乘積縮小不超過50%，增加不超過25%；PD定義為所有的腫瘤病灶最長(zhǎng)徑及其垂直徑乘積增大超過25%以上或者出現(xiàn)新的病灶。所有患者評(píng)估時(shí)間一致，如出現(xiàn)CR、PR和SD為臨床受益，繼續(xù)同方案化療2～4個(gè)周期，最多為6個(gè)周期，如出現(xiàn)PD，則更改治療方案?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為從研究入組開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。無進(jìn)展生存期（pro?gression-free survival，PFS）定義為從研究入組開始至疾病進(jìn)展的時(shí)間，采用門診、電話等隨訪方式，末次隨訪時(shí)間為2014年12月。

1.2.2 免疫組織化學(xué)及結(jié)果判斷 胃癌組織標(biāo)本用10%福爾馬林固定、石蠟包埋、組織切片（4 μm），采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ERCC1、TS和TUBB3蛋白，操作按免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作陽性對(duì)照。由2位病理科高級(jí)職稱醫(yī)師進(jìn)行單盲閱片，對(duì)標(biāo)本染色結(jié)果進(jìn)行判斷。所有評(píng)分分為0、1、2、3和4分，＞2分定義為高表達(dá)，≤2分為低表達(dá)［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TUBB3表達(dá)與化療療效的相關(guān)性進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，生存曲線采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行描述，TUBB3表達(dá)與生存的關(guān)系采用log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 TUBB3表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系及單因素分析Table 1 Characteristics of chemotherapy-treated patients and distribution according to TUBB3 expression status and the univariate analysis

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中TUBB3蛋白的表達(dá)

TUBB3蛋白在46例患者組織中有不同程度的表達(dá)，TUBB3蛋白陽性表達(dá)主要位于腫瘤組織的胞核，成棕黃色細(xì)顆粒狀分布（圖1）；TUBB3低表達(dá)組占54.35%（25/46），TUBB3高表達(dá)組占45.65%（21/46）。

2.2 晚期胃癌TUBB3表達(dá)與化療療效的關(guān)系

在46例有效病例中，紫杉類化療藥物療效達(dá)CR 1例，PR 17例，SD 22例，PD 6例，化療總有效率（CR+PR）為39.13%（18/46）；TUBB3低表達(dá)組有效率為54.17%，TUBB3高表達(dá)組有效率為22.73%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.736，P=0.029）。

圖1 胃癌組織中TUBB3蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)（DAB×200）Figure 1 Immunohistochemical expression of TUBB3 protein in gastric carcinoma(DAB×200)

2.3 晚期胃癌TUBB3表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系

截至末次隨訪時(shí)間，全部患者無1例失訪，46例患者全部死亡，TUBB3低表達(dá)組患者的中位PFS和OS分別為5.9個(gè)月和11.6個(gè)月，TUBB3高表達(dá)組患者的中位PFS和OS分別為3.9個(gè)月和7.9個(gè)月，TUBB3低表達(dá)組較高表達(dá)組的PFS和OS均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PFS：P=0.032；OS：P=0.001，圖2）。

2.4 晚期胃癌患者OS單因素分析

對(duì)7個(gè)變量（年齡、性別、ECOG評(píng)分、組織學(xué)分化程度、轉(zhuǎn)移臟器數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TUBB3表達(dá)水平）進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與中位OS無顯著相關(guān)（P＞0.05），而ECOG評(píng)分、組織學(xué)分化程度、轉(zhuǎn)移臟器數(shù)目和TUBB3表達(dá)水平與中位OS顯著相關(guān)（P＜0.05，表1，圖2）。

2.5 晚期胃癌患者OS多因素分析

對(duì)以上4個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（ECOG評(píng)分、組織學(xué)分化程度、轉(zhuǎn)移臟器數(shù)目和TUBB3表達(dá)水平）再納入Cox模型進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果顯示：按照其作用強(qiáng)度得出影響晚期胃癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素依次為：TUBB3表達(dá)水平、組織學(xué)分化程度、轉(zhuǎn)移臟器數(shù)目和ECOG評(píng)分，其中TUBB3高表達(dá)死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的4.988倍（95%CI：2.222～11.200；P＜0.05，表2）。

圖2 TUBB3表達(dá)與患者預(yù)后的曲線Figure 2 The relationship between the expression of TUBB3 and the prognosis of patients

表2 影響晚期胃癌患者預(yù)后的Cox回歸分析Talbe 2 Multivariate overal survival analysis by Cox proportional hazard regression model

3 討論

抗微管類化療藥是作用于細(xì)胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂的一類廣譜化療藥。目前常用的抗微管類藥物主要有紫杉醇、多西紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱等。胃癌的化療始于20世紀(jì)60年代，在眾多的化療藥物中紫杉醇類藥物是胃癌化療的基本用藥。紫杉醇可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管。在接觸紫杉醇后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量微管，從而干擾細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止，從而起到抗腫瘤效果，多西紫杉醇的藥理機(jī)制與紫杉醇相似。據(jù)研究顯示，TUBB3是微管蛋白家族中的一種亞型，與抗微管化療藥紫杉醇耐藥的關(guān)系最密切［10-12］。一項(xiàng)納入1 149例非小細(xì)胞肺癌術(shù)后患者進(jìn)行輔助化療的4個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的交叉效度研究顯示，TUBB3高表達(dá)則生存預(yù)后差，但未證實(shí)TUBB3預(yù)測(cè)輔助化療的療效［7］。一項(xiàng)研究納入56例復(fù)發(fā)的非小細(xì)胞肺癌患者，結(jié)果提示TUBB3陽性表達(dá)，選用紫杉醇為基礎(chǔ)的化療療效更差，TUBB3表達(dá)可以預(yù)測(cè)多西紫杉醇的化療敏感性［3］，在卵巢癌、頭頸部腫瘤及胸腺上皮腫瘤均得到相似結(jié)果［4-6］。

TUBB3的表達(dá)與晚期胃癌患者的生存關(guān)系目前研究資料尚少，有研究用紫杉醇為基礎(chǔ)一線治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移胃癌患者，結(jié)果顯示TUBB3可以預(yù)測(cè)化療的療效，TUBB3低表達(dá)則PFS更長(zhǎng)，但與OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［13］。本研究結(jié)果顯示TUBB3低表達(dá)組有效率為54.17%，TUBB3高表達(dá)組有效率為22.73%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.736，P=0.029）。TUBB3低表達(dá)組患者的中位PFS和OS分別為5.9個(gè)月和11.6個(gè)月，TUBB3高表達(dá)組患者的中位PFS和OS分別為3.9個(gè)月和7.9個(gè)月，TUBB3低表達(dá)組較高表達(dá)組的PFS和OS均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PFS：P=0.032；OS：P=0.001）。單因素及多因素分析得出，TUBB3均為晚期胃癌的預(yù)后因素。提示晚期胃癌患者的TUBB3低表達(dá)用紫杉醇或多西紫杉醇為基礎(chǔ)的化療緩解率高，預(yù)后更好。Cox回歸分析顯示TUBB3表達(dá)水平為晚期胃癌患者獨(dú)立預(yù)后因素，TUBB3高表達(dá)死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的 4.988倍（95%CI：2.222～11.200，P＜0.05），提示晚期胃癌組織中TUBB3的表達(dá)是一種判斷患者生存預(yù)后的標(biāo)記物；TUBB3低表達(dá)組選擇紫杉醇類藥物可提高化療療效，TUBB3蛋白可作為晚期胃癌選用紫杉醇類藥物化療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

目前有多種檢測(cè)TUBB3的方法，免疫組織化學(xué)技術(shù)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）等是最常用的方法，免疫組織化學(xué)技術(shù)能迅速檢測(cè)TUBB3蛋白的表達(dá)，廣泛使用于臨床，經(jīng)濟(jì)適用，但存在較差重復(fù)性及客觀性。RT-PCR技術(shù)是目前檢測(cè)TUBB3 mRNA表達(dá)水平最敏感的方法之一，但是基層醫(yī)院難以實(shí)施，主要因?yàn)闄z測(cè)成本較高、操作難。采用免疫組織化學(xué)半定量方法檢查胃癌組織中TUBB3的表達(dá)是本研究的潛在不足點(diǎn)，為了最大程度降低誤差，本研究采用雙盲方法選擇了2位病理學(xué)專家，均對(duì)研究不知情，所有標(biāo)本評(píng)分參照以前驗(yàn)證的免疫組織化學(xué)研究評(píng)分系統(tǒng)。盡管RT-PCR方法檢測(cè)生物標(biāo)志物信使RNA水平能提供更多的信息，但是免疫組織化學(xué)方法使用更廣泛，更容易在臨床上被接受。為了今后進(jìn)一步研究的深入，免疫組織化學(xué)檢測(cè)TUBB3的表達(dá)時(shí)，尋找一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化、公認(rèn)的、最佳的腫瘤陽性表達(dá)的定義至關(guān)重要。此外，還需要一些大樣本前瞻性研究來證實(shí)胃癌患者中TUBB3蛋白的表達(dá)與患者生存預(yù)后及與紫杉醇類藥物化療療效的關(guān)系。

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