靈芝瓊脂固體菌種超聲均質(zhì)效果及其發(fā)酵工藝

劉盛榮++張維瑞++戴金玉++余浩++鄭春源

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.106

摘要：建立一種靈芝均一性菌種制作方法及其發(fā)酵工藝。超聲破碎靈芝瓊脂固體平板培養(yǎng)物，采用鏡檢和涂布平板法分析超聲均質(zhì)效果，以生物量和胞外多糖為指標(biāo)優(yōu)化其發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：靈芝瓊脂固體菌種破碎完全、均一性好，菌落數(shù)達(dá)到186.00 CFU/個（瓊脂塊直徑0.5 cm）；以超聲均質(zhì)化菌種為接種物于恒搖床發(fā)酵，生物量、胞外多糖分別為9.24、0.62 g/L，低于瓊脂塊菌種（分別為13.37、1.16 g/L）；采用靜置加搖床兩階段發(fā)酵方法（共10 d），以靜置 3 d、搖床7 d為最優(yōu)，生物量、胞外多糖含量分別達(dá)到15.14、0.86 g/L；與瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵相比分別提高2996%、16.21%；超聲均質(zhì)菌種優(yōu)化后的接種量為7 mL。

關(guān)鍵詞：靈芝；瓊脂菌種；超聲波；液體發(fā)酵；發(fā)酵工藝

中圖分類號： S567.3+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0363-04

收稿日期：2015-08-08

基金項(xiàng)目：寧德師范學(xué)院校企科研合作項(xiàng)目（編號：AF-003）；寧德師范學(xué)院人才啟動項(xiàng)目（編號：2013Y008）。

作者簡介：劉盛榮（1973—），男，福建三明人，博士，講師，主要從事食用菌及藥用菌液體發(fā)酵研究。E-mail：fjhost@163.com。靈芝別稱瑞草、萬年蕈、不老草、仙草、神芝，屬擔(dān)子菌門層菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬，在我國主要指赤芝（Ganoderma lucidum）、紫芝（G. sinense）、松杉靈芝（G. tsugae）等具有較高藥用價值的芝類。靈芝是我國、日本、韓國、泰國等東方國家的傳統(tǒng)珍貴草藥，其中靈芝多糖、靈芝酸是靈芝藥效的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]，主要用于肝炎、高血壓、高血脂、胃癌等疾病的治療。

野生靈芝資源極其稀少，人工代料栽培是目前靈芝生產(chǎn)的主要方法，但其栽培周期長，且不同批次產(chǎn)品的活性成分及其含量有較大差異，不利于靈芝產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、應(yīng)用、推廣。不同于前者，靈芝液體發(fā)酵具有周期短、過程易控制、生產(chǎn)自動化水平高等優(yōu)點(diǎn)，且發(fā)酵組分活性與子實(shí)體相近[4-8]，因此研究人員以生物量、多糖、三萜為目標(biāo)對發(fā)酵培養(yǎng)基、真菌激發(fā)子、中藥提取物強(qiáng)化活性物質(zhì)生物合成等進(jìn)行研究[9-12]。

液體發(fā)酵是當(dāng)前食藥用菌研究的熱點(diǎn)，其瓊脂平板培養(yǎng)物常作為液體發(fā)酵[13]或液體菌種生產(chǎn)的接種物[14-15]，其優(yōu)點(diǎn)在于可縮短菌種制備時間，但發(fā)酵周期長。Xing等采用小型攪拌機(jī)均質(zhì)化灰樹花（Grifola frondosa）瓊脂平板培養(yǎng)物，作為漆酶液體發(fā)酵接種物[16]。靈芝液體培養(yǎng)菌種接種前，也常采用攪拌機(jī)均質(zhì)后再用于接種[17]。研究靈芝瓊脂固體菌種超聲破碎效果，并優(yōu)化其作為接種物的發(fā)酵工藝，為均一性菌種制備及其發(fā)酵提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株赤芝購自中國科學(xué)院微生物研究所，編號為CCMCC 5.535。

1.1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂18 g、去離子水1 000 mL，于121 ℃下滅菌20 min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35.0 g、蛋白胨4.0 g、酵母粉4.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 0.01 g、去離子水 1 000 mL，于121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3主要儀器JY-96 IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司），UV5800-PC型紫外可見分光光度儀（上海元析分析儀器有限公司），NRY-2102C型恒溫?fù)u床（上海南榮實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司），PHS-3C型精密pH值計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），DM750型顯微鏡（配LEICA DMC2900型相機(jī)，LEICA公司）。

1.2方法

1.2.1菌種活化及平板培養(yǎng)將4 ℃冷箱保藏的斜面菌種轉(zhuǎn)至新配制的PDA斜面，于25 ℃下活化培養(yǎng)7 d，活化菌種接至PDA平板培養(yǎng)7 d。

1.2.2菌種超聲波破碎采用無菌打孔器（直徑0.5 cm）在平板菌落近邊緣打孔，挑取20個瓊脂塊至裝有20 mL無菌水的50 mL離心管。超聲前采用75%乙醇、無菌水依次擦拭超聲波細(xì)胞破碎儀變幅桿；將其浸于懸液開始超聲破碎，每次10 s，共6次（合計(jì)時間1 min），功率250 W，形成1 mL懸液的生物量約相當(dāng)于1個瓊脂塊所含生物量，即為超聲均質(zhì)菌種。

1.2.3顯微觀察吸取50 μL超聲均質(zhì)菌種至載玻片，蓋上蓋玻片，于10倍物鏡下觀察并拍照。

1.2.4菌落計(jì)數(shù)吸取200 μL超聲均質(zhì)菌種懸液至9 cm PDA平板上，采用涂布棒均勻涂布，于25 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察計(jì)數(shù)。

1.2.5恒搖床發(fā)酵吸取3 mL均質(zhì)菌種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，接種3個瓊脂固體菌種作為對照。于30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)10 d。

1.2.6靜置加搖床兩階段發(fā)酵吸取3 mL超聲均質(zhì)菌種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，于30 ℃下靜置培養(yǎng)1～4 d，之后于160 r/min搖床培養(yǎng)，合計(jì)培養(yǎng)10 d，優(yōu)化其發(fā)酵；接種3個瓊脂菌種作為對照，同時設(shè)瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵?；趦?yōu)化的兩階段發(fā)酵，接種量分別為1～10 mL，接種至裝有50 mL培養(yǎng)基的150 mL搖瓶中，以優(yōu)化超聲均質(zhì)菌種接種量。

1.2.7發(fā)酵參數(shù)分析（1）生物量（干質(zhì)量法）。將發(fā)酵液以3 500 r/min離心，收集菌絲并去除瓊脂塊培養(yǎng)基，上清用于pH值、胞外多糖含量、殘葡萄糖含量的測定；菌絲用去離子水洗滌，離心收集，重復(fù)2次。菌絲轉(zhuǎn)至60目紗布，于 70 ℃ 下烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算生物量。（2）殘葡萄糖含量。采用3，5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液的殘葡萄糖含量。（3）pH值。采用數(shù)顯pH計(jì)測定發(fā)酵液的pH值。（4）多糖含量。參照文獻(xiàn)[7，18]進(jìn)行測定。胞外多糖含量。吸取10 mL離心發(fā)酵液上清于透析膜（分子截留量10 000 u）中，流動自來水透析24 h以去除葡萄糖等小分子，向收集的透析液加入 40 mL 95%乙醇，充分混合后于4 ℃冰箱過夜。過夜沉淀液以3 500 r/min離心10 min并棄上清，將沉淀懸于25 mL 1 mol/L NaOH溶液，于60 ℃下水浴1 h，離心收集上清。胞內(nèi)多糖：干菌絲于研缽中研碎，稱取100 mg至25 mL 1 mol/L NaOH 溶液，于60 ℃下水浴1 h，離心收集上清。采用苯酚-硫酸法測定2種上清液的多糖。

1.2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為顯著性差異。試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1超聲均質(zhì)菌種顯微觀察

由靈芝瓊脂固體菌種超聲均質(zhì)顯微圖（圖1）可知，菌種破碎完全，可看到均一性菌絲體及少量短菌絲?？梢?，超聲波破碎是一種有效的瓊脂固體菌種均質(zhì)方法，可用于制備均一性菌種。此外，降低培養(yǎng)基瓊脂含量可提高超聲破碎效果并縮短超聲時間。

2.2超聲均質(zhì)菌種菌落計(jì)數(shù)

圖2為瓊脂固體菌種超聲破碎懸液稀釋后涂布平板培養(yǎng)菌落，菌落大小一致，每個瓊脂塊菌種超聲后形成約 186.00±11.35個菌落，此為1 mL超聲均質(zhì)菌種發(fā)酵生長點(diǎn)。本試驗(yàn)條件（5 d培養(yǎng)時間）下，相當(dāng)數(shù)量的短菌絲片段可能未生長至可肉眼觀察的菌落，因此超聲均質(zhì)菌種發(fā)酵生長點(diǎn)應(yīng)高于該菌落值。

2.3超聲均質(zhì)菌種恒搖床發(fā)酵

由超聲均質(zhì)菌種及瓊脂塊菌種恒搖床發(fā)酵結(jié)果（表1）可知，超聲法破碎制備的均一菌種發(fā)酵終點(diǎn)生物量和胞外多糖均低于瓊脂塊菌種。2種菌種在葡萄糖利用方面也存在顯著差異（P<0.05），由于葡萄糖主要作為碳源提供細(xì)胞生長能量、參與合成細(xì)胞組成成分、合成代謝產(chǎn)物，超聲均質(zhì)菌種低葡萄糖消耗顯示其弱發(fā)酵力，這與其發(fā)酵低生物量和多糖吻合。

超聲均質(zhì)菌種所含生長點(diǎn)遠(yuǎn)高于瓊脂塊菌種，但發(fā)酵液所形成菌球數(shù)量少甚至低于后者，很顯然超聲均質(zhì)菌絲搖床過程發(fā)生聚集并降低其生長點(diǎn)，這是超聲均質(zhì)菌種發(fā)酵水平低的重要原因。此外，菌種超聲破碎過程其細(xì)胞必然受損傷，或影響超聲均質(zhì)菌種發(fā)酵性能。

2.4超聲均質(zhì)菌種不同靜置時間加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵

由超聲均質(zhì)菌種和瓊脂塊菌種作為接種物的不同靜置時間加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵結(jié)果（表2）可知，超聲均質(zhì)菌種不同靜置時間加搖床發(fā)酵以靜置3 d、搖床培養(yǎng)7 d的生物量和胞外多糖含量最高，分別為15.14、0.86 g/L，與其恒搖床發(fā)酵生物量、胞外多糖含量9.24、0.62 g/L（表1）相比分別提高 63.85%、38.71%?？梢姡o置3 d、搖床7 d兩階段發(fā)酵是超聲均質(zhì)菌種優(yōu)化的發(fā)酵工藝。

作為對照，瓊脂塊菌種靜置培養(yǎng)時間1～3 d加搖床培養(yǎng)兩階段發(fā)酵的生物量、胞外多糖含量均高于其恒搖床發(fā)酵（P<0.05）；靜置時間（1～3 d）對發(fā)酵結(jié)果無顯著影響（P>0.05），但靜置時間為4 d時生物量和胞外多糖明顯下降。靜置期（1～3 d）細(xì)胞可能以適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境和恢復(fù)性生長為主，即為遲滯期，細(xì)胞進(jìn)入生長期后需要豐富的氧分及營養(yǎng)供應(yīng)，而此時靜置培養(yǎng)氧質(zhì)及溶質(zhì)傳遞有限，成為其發(fā)酵的制約因素。

2.5超聲均質(zhì)菌種不同接種量靜置加搖床（3 d/7 d）兩階段發(fā)酵

采用優(yōu)化的靜置加搖床兩階段發(fā)酵工藝（3 d靜置培養(yǎng)，7 d搖床培養(yǎng)）對不同超聲均質(zhì)菌種接種量的發(fā)酵結(jié)果見表3。由表3可知，隨著接種量的增大，發(fā)酵終點(diǎn)生物量及胞外多糖含量相應(yīng)提高，于接種量為7 mL（約相當(dāng)于7個瓊脂塊菌種）時達(dá)到最高，生物量、胞外多糖含量分別為17.43、1.27 g/L；進(jìn)一步增大接種量，生物量、胞外多糖含量均未提高，表明該優(yōu)化發(fā)酵工藝下超聲均質(zhì)菌種的優(yōu)化接種量為7 mL。

3討論

超聲波是指頻率為2×104～2×109 Hz的聲波，是機(jī)械波的一種，因其超越了人類聽覺的上限而被稱為超聲波。超聲波在生物研究中的應(yīng)用主要以細(xì)胞破碎[19-20]、成分輔助提取[21-23]為主。細(xì)胞破碎是利用超聲波在液體中的空化作用產(chǎn)生密集小氣泡，依靠小氣泡的迅速炸裂將細(xì)胞破碎。本研究表明，超聲波可有效破碎靈芝瓊脂固體菌種。傳統(tǒng)的攪拌法通過高速攪拌子產(chǎn)生巨大的機(jī)械剪切力將細(xì)胞破碎，相比之下，超聲波法具有使用方便快捷、不易污染、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，且對細(xì)胞的損傷可能較小。超聲探頭（變幅桿）易與生物反應(yīng)器集成，由此可實(shí)現(xiàn)均一性菌種的即時制備，減少污染發(fā)生，使高均一性和高純度液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。

本研究利用超聲波破碎技術(shù)成功制備高均一性、高生長點(diǎn)的靈芝菌種，但其作為接種物搖床發(fā)酵的生物量和胞外多糖產(chǎn)率低于未破碎瓊脂塊菌種。主要因?yàn)槌暰|(zhì)菌種搖床過程菌絲發(fā)生聚集現(xiàn)象，降低了其發(fā)酵生長點(diǎn)；此外，靈芝細(xì)胞超聲破碎時受到損傷，這2種不利因素制約了其發(fā)酵水平。瓊脂塊菌種的起始生長點(diǎn)較少，但搖床培養(yǎng)過程中其自身逐漸碎片化，且新生長菌絲于原菌種脫落為新生長點(diǎn)，發(fā)酵液生長點(diǎn)不斷增多。盡管搖床發(fā)酵時瓊脂塊菌種的生長點(diǎn)少，但其發(fā)酵水平仍高于超聲均質(zhì)菌種。

兩階段發(fā)酵工藝是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)及科學(xué)研究的發(fā)酵技術(shù)。根據(jù)細(xì)胞生長及目標(biāo)產(chǎn)物生物合成條件的差異，兩階段發(fā)酵有多種不同的調(diào)控模式，以最大化目標(biāo)產(chǎn)物的合成。例如，ε-聚賴氨酸（ε-polylysine）兩階段pH值發(fā)酵，細(xì)胞生長期pH值控制在5.0以上，ε-聚賴氨酸合成期pH值控制為4.0[24]；凝膠多糖（curdlan）兩階段細(xì)胞密度控制發(fā)酵，前期采用高密度發(fā)酵技術(shù)，凝膠多糖合成階段采用低細(xì)胞密度[25]；蝦青素（astaxanthin）發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖濃度采用兩階段控制方式，生長期、合成期分別為20、50 g/L[26]。

崔建東等研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草多糖搖動加靜置兩階段發(fā)酵，搖動培養(yǎng)115 h后靜置培養(yǎng)120 h最優(yōu)，多糖產(chǎn)量分別為搖動培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)的1.5、2.0倍[27]。Fang等采用先搖動培養(yǎng)4 d、后靜置培養(yǎng)12 d的發(fā)酵方法，靈芝菌絲靈芝酸由恒搖床發(fā)酵的0.136 mg/g提高至0.319 mg/g[28]。Bigelis等采用靜置培養(yǎng)7 d、搖動培養(yǎng)7 d的兩階段發(fā)酵工藝，使抗癌疾先導(dǎo)化學(xué)物Flavomannin產(chǎn)率提高10～100倍[29]。本研究針對超聲均質(zhì)菌種傳統(tǒng)恒搖床過程中菌絲發(fā)生聚集的現(xiàn)象，采用先靜置培養(yǎng)以避免和減輕菌絲聚集，從而維持其多發(fā)酵生長點(diǎn)，使發(fā)酵水平大幅提高。

4結(jié)論

超聲波破碎可有效均質(zhì)化靈芝瓊脂固體菌種，每個瓊脂塊（直徑為0.5 cm）菌種超聲破碎可形成186.00個菌落。

采用超聲波破碎制備的均一性菌種，其搖床發(fā)酵生物量和胞外多糖低于傳統(tǒng)瓊脂塊菌種；靜置加搖床兩階段發(fā)酵以靜置3 d、搖床振蕩培養(yǎng)7 d為最優(yōu)發(fā)酵工藝。

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