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    鎘暴露對蛋雞卵巢的毒性損傷及酵母硒的保護(hù)效應(yīng)

    2017-02-05 15:00:35王倩倩陳大偉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:蛋雞卵巢

    王倩倩++陳大偉

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.077

    摘要:將90羽40周齡海蘭褐蛋雞隨機(jī)分為3組,每組30羽,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10羽。采用飲水染毒方式對蛋雞進(jìn)行Cd暴露(50 mg/L)和酵母硒保護(hù)試驗(yàn)(飼料中添加3%酵母硒),試驗(yàn)周期為8周。結(jié)果表明:與對照組比較,Cd組血清E2、P4含量呈類似變化,分別自第2、4周顯著下降(P<0.05);卵巢組織中SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),MDA含量極顯著升高(P<0.01);Cd組SOD活性下降了3245%(P<0.01),GSH-Px活性下降了26.26%(P<0.01),GSH含量下降了19.83%(P<0.01),MDA含量升高了37.03%(P<0.01);卵巢Cd含量極顯著升高。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)Cd組卵巢顆粒細(xì)胞染色質(zhì)邊集、線粒體嵴斷裂、空泡化、微絨毛斷裂等損傷變化。與Cd組相比,Se保護(hù)組血清E2、P4含量自第6周顯著升高,卵巢SOD活性、GSH含量均顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。卵巢硒含量極顯著升高,Cd含量差異不顯著,卵巢微絨毛、線粒體、細(xì)胞核等損傷變化輕于Cd組。綜上所述,Cd引起的氧化應(yīng)激是Cd致蛋雞卵巢損傷的重要原因,氧化應(yīng)激引起的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡可能是造成蛋雞血清雌激素水平下降的原因之一。酵母硒通過緩解卵巢組織脂質(zhì)過氧化損傷,減輕Cd對卵巢細(xì)胞微絨毛及線粒體的損傷,對蛋雞Cd暴露引起的卵巢損傷具有一定緩解作用。

    關(guān)鍵詞:蛋雞;鎘暴露;酵母硒;卵巢;保護(hù)效應(yīng)

    中圖分類號: S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0278-03

    收稿日期:2015-12-09

    基金項(xiàng)目:江蘇省家禽科學(xué)研究所博士基金(編號:JQ201201);江蘇省自然科學(xué)基金(編號:BK20131235)。

    作者簡介:王倩倩(1984—),女,江蘇南通人,獸醫(yī)師,主要從事畜禽疾病防控。E-mail:158373585@qq.com。

    通信作者:陳大偉,助理研究員。E-mail:ydcdw83@sina.com。鎘(cadmium,Cd)是一種毒性很強(qiáng)的有色重金屬元素,少量Cd持續(xù)進(jìn)入體內(nèi)便可能引發(fā)嚴(yán)重的中毒癥狀,各種動(dòng)物均能發(fā)生Cd中毒。有關(guān)Cd對肝臟、腎臟、睪丸等器官的毒性研究報(bào)道[1-4]較多,但Cd對雌性家禽生殖毒性的研究報(bào)道相對較少。Cd作為一種高度可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,已引起人們的廣泛關(guān)注。體外試驗(yàn)表明,Cd可降低大鼠血清中孕酮、雌二醇水平,抑制類固醇合成,可能直接影響顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的功能[5-6]。

    硒是動(dòng)物必需的一種微量營養(yǎng)物質(zhì),在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng),作為硒蛋白、含硒酶的必要成分在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用,抑制脂質(zhì)過氧化,消除過多自由基,從而保護(hù)生物體的膜結(jié)構(gòu)與功能。近年來研究發(fā)現(xiàn),硒還具有抗應(yīng)激、提高免疫力、促生長、改善肉質(zhì)、提高動(dòng)物繁殖能力等重要作用[7-8]。目前應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的硒主要為亞硒酸鈉等無機(jī)硒,而無機(jī)硒的使用會(huì)帶來諸多弊端。與無機(jī)硒相比,來源于植物或富硒酵母的有機(jī)硒具有很多優(yōu)勢,在飼料中添加應(yīng)用毒性較小,具有抗氧化特性及較高的組織沉積率、生物利用率,從而減少對環(huán)境的污染[9],因此提倡在飼料中添加應(yīng)用有機(jī)硒源的硒。而關(guān)于有機(jī)硒源對蛋雞Cd暴露后卵巢保護(hù)效應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。

    本研究通過飲水染毒進(jìn)行Cd暴露,同時(shí)在飼料中添加酵母硒,探討有機(jī)硒對Cd暴露蛋雞體內(nèi)激素、卵巢脂質(zhì)過氧化水平及超微結(jié)構(gòu)、Cd蓄積的影響,旨在觀察Cd對產(chǎn)蛋雞的生殖毒性特點(diǎn),并為以有機(jī)硒為主的環(huán)保型Cd拮抗劑在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    氯化鎘(CdCl2)購自國藥集團(tuán),分析純,含量大于99%;酵母硒(拉曼硒)。試驗(yàn)于農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(揚(yáng)州)生產(chǎn)性能測定站進(jìn)行,試驗(yàn)動(dòng)物為商品海蘭褐殼蛋雞。

    1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    將90羽體質(zhì)量生產(chǎn)性能基本一致的40周齡海蘭褐殼蛋雞隨機(jī)分為3組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10羽雞。Cd組在飲水中添加Cd 50 mg/L;硒保護(hù)組在飲水中添加Cd 50 mg/L,同時(shí)在飼料中添加3%的酵母硒(Cd添加質(zhì)量濃度參考GB 5749—2006《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》,Cd≤0.05 mg/L,在此限量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提高1 000倍);對照組飲用純凈水。根據(jù)NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》中蛋雞的營養(yǎng)需要配制常規(guī)玉米-豆粕型飼糧,作為試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧。經(jīng)測定,該飼糧中Cd含量為(0.065±0.003) mg/kg,酵母硒中硒含量為(2 004±1.24) mg/kg。采用3層全階梯籠養(yǎng),自由采食和飲水,預(yù)試驗(yàn)期為1周,正式試驗(yàn)期為8周。

    1.3指標(biāo)及測定方法

    1.3.1性腺激素含量的測定分別于試驗(yàn)第2、4、6、8周末進(jìn)行翅靜脈采血,分離血清,采用化學(xué)發(fā)光法測定血清中E2、P4含量?;瘜W(xué)發(fā)光測定試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

    1.3.2卵巢抗氧化指標(biāo)的測定染毒結(jié)束后,將蛋雞頸動(dòng)脈放血處死;摘取雙側(cè)卵巢,去除蛋黃,準(zhǔn)確稱取0.2 g卵巢組織,加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,于冰浴條件下采用高速電動(dòng)勻漿機(jī)制備10%組織勻漿;將勻漿液以3 000 r/min離心20 min后取上清。主要測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,試劑配制和試驗(yàn)操作均按說明書進(jìn)行。

    1.3.3卵巢超微結(jié)構(gòu)觀察迅速采集剛處死蛋雞的卵巢組織,將其切為約1 mm3的小塊,采用新鮮配制的25 g/L戊二醛溶液固定后,常規(guī)制備超薄切片。采用JEM-100CXⅡ型透射電鏡(Philips公司)觀察并拍照。

    1.3.4卵巢中Cd、硒含量的測定試驗(yàn)結(jié)束后,以頸動(dòng)脈放血處死雞并采集卵巢。采用微波消解法處理制備樣品,采用ICP-MS(XseriesⅡ,美國Thermo scientific)法測定樣品中的硒、Cd含量。

    1.4數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析,采用LSD及Duncans多重比較對各處理間的平均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

    2結(jié)果與分析

    2.1血清中性腺激素含量

    由表1可知,與對照組相比,Cd組E2含量自第4周顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),保護(hù)組自第6周顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,Cd組E2含量分別降低了6.28%、12.48%、15.30%、17.69%,硒保護(hù)組分別降低了505%、9.70%、10.59%、12.91%。血清中P4含量的變化與E2相似,與對照組相比,Cd組自第4周顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),保護(hù)組自第6周顯著降低(P<005)。與對照組相比,Cd組P4含量分別降低了8.82%、1336%、20.94%、20.71%,硒保護(hù)組分別降低了7.14%、769%、12.82%、13.63%。添加酵母硒一定程度上恢復(fù)了Cd引起的血清E2和P4水平的下降。

    2.2卵巢組織抗氧化指標(biāo)

    由表2可知,與對照組相比,染Cd組和酵母硒保護(hù)組的SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),MDA含量顯著或極顯著升高(P<005或P<0.01);與染Cd組相比,酵母硒保護(hù)組的SOD活性、GSH含量均顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。其中,Cd組和保護(hù)組的SOD活性分別低于對照組32.45%、16.81%,GSH-Px活性分別低于對照組2626%、16.07%,GSH含量分別低于對照組19.83%、851%,MDA含量分別高于對照組37.03%、17.07%??梢?,Cd染毒使卵巢發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),酵母硒通過增強(qiáng)抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生緩解Cd對蛋雞卵巢的氧化損傷。

    2.3卵巢超微結(jié)構(gòu)變化

    超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),對照組卵巢細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,線粒體結(jié)構(gòu)清晰完整,卵母細(xì)胞微絨毛排列緊密、結(jié)構(gòu)完整(圖1-A、圖1-D)。Cd組部分卵母細(xì)胞微絨毛散亂、稀疏、斷裂,顆粒細(xì)胞染色質(zhì)邊集,線粒體膜不完整,部分嵴斷裂空泡化(圖1-B、圖1-E)。硒保護(hù)組線粒體結(jié)構(gòu)基本完整,微絨毛排列略顯稀疏,但排列整齊,且較少斷裂(圖1-C、圖1-F)??梢姡Wo(hù)組的損傷程度低于Cd染毒組(圖1中“↑”所示)。

    2.4卵巢中Cd和硒含量

    由表3可知,與對照組相比,Cd組卵巢中Cd含量極顯著升高,硒含量無顯著差異;硒保護(hù)組硒含量極顯著升高。與Cd組相比,硒保護(hù)組Cd含量略有升高,但差異不顯著,硒含量極顯著升高。添加酵母硒提高了卵巢中硒含量,可能促進(jìn)含硒抗氧化酶活性的提高,但不能減輕Cd在卵巢中的沉積。

    3結(jié)論與討論

    近年來,Cd的生殖內(nèi)分泌干擾作用引起了人們的廣泛關(guān)注。其中,Cd對孕激素合成的影響已成為研究熱點(diǎn)之一。Cd可降低血清中E2和P4濃度。Paksy等在體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞,向培養(yǎng)液中加入不同濃度的CdCl2溶液,觀察CdCl2對E2和P4的影響;結(jié)果表明,體外給予CdCl2可抑制顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞合成E2和P4[5]。在體試驗(yàn)也表明,Cd可降低大鼠血清內(nèi)E2和P4濃度,并存在劑量效應(yīng)[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,Cd組血清中E2、P4濃度均降低,且隨著染Cd時(shí)間的延長呈明顯時(shí)間效應(yīng),這與以往報(bào)道基本一致。

    氧化應(yīng)激是介導(dǎo)Cd毒性損傷作用的主要原因之一[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn),蛋雞Cd暴露后卵巢組織的MDA含量增加,抗氧化酶SOD活性、GSH-Px活性均降低,抗氧化物GSH含量下降,表明Cd引起的蛋雞卵巢損傷同樣與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。添加酵母硒對Cd引起的卵巢氧化損傷具有一定改善作用,這與在大鼠肝臟中的研究結(jié)果一致,硒通過降低MDA水平、增加抗氧化酶活性來拮抗Cd的毒性損傷[15]。硒保護(hù)組卵巢中硒含量增加,Cd含量與Cd暴露組相當(dāng),表明同時(shí)飼喂酵母不能減少Cd在卵巢中的蓄積;而硒保護(hù)組GSH-Px活性的升高與補(bǔ)硒直接相關(guān),表明補(bǔ)硒能通過增強(qiáng)組織中GSH-Px活性清除自由基來拮抗Cd的毒性損傷。

    進(jìn)一步通過超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)以凋亡為主的形態(tài)變化。筆者推斷,血清中E2、P4含量變化可能的原因?yàn)镃d損傷卵巢組織,抑制卵泡發(fā)育,使卵泡閉鎖增加,卵泡內(nèi)膜細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)均受到損傷。Cd可在卵巢組織中蓄積,可能通過與雌激素受體、孕酮受體等類固醇激素受體結(jié)合介導(dǎo)發(fā)揮其毒性作用,使血清中E2、P4水平降低[16]。

    超微結(jié)構(gòu)研究顯示,卵巢組織結(jié)構(gòu)受損,其中微絨毛的變化最為明顯。卵泡中各微細(xì)結(jié)構(gòu)的生理功能及其變化與卵泡發(fā)育存在密切關(guān)系。微絨毛是細(xì)胞表面的特定結(jié)構(gòu),是細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞表面伸出的指狀凸起,能夠使細(xì)胞的表面積增加幾十倍。卵母細(xì)胞通過微絨毛結(jié)構(gòu)與卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系,從而進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞,獲得養(yǎng)分和信息因子。在發(fā)育階段,卵母細(xì)胞代謝旺盛,微絨毛較多,以便更多吸收顆粒細(xì)胞輸送來的營養(yǎng)物質(zhì);同時(shí),對來自顆粒細(xì)胞的各種信息因子也最為敏感。如果卵泡細(xì)胞激素分泌發(fā)生變動(dòng)或營養(yǎng)供應(yīng)受阻,卵泡顆粒細(xì)胞先行退化,隨之微絨毛退化,從而引起卵母細(xì)胞閉鎖[17]。Cd組微絨毛散亂、稀疏,部分?jǐn)嗔眩雅蓊w粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均受到損傷,直接影響E2、P2的分泌;結(jié)合線粒體的結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激是Cd暴露引起卵母細(xì)胞損傷的主要原因。

    添加酵母硒可緩解Cd暴露引起的產(chǎn)蛋率下降,有效降低Cd暴露引起的卵巢組織脂質(zhì)過氧化損傷,同時(shí)提升血清中E2、P4的含量水平,有效改善Cd暴露引起的卵巢細(xì)胞微絨毛、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的損傷??梢姡湍肝赏ㄟ^減緩Cd暴露所致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來拮抗Cd對蛋雞卵巢的毒性損傷,飼料中添加酵母硒對Cd所致蛋雞卵巢毒性損傷具有一定的保護(hù)效果。

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