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    紅豆杉種質(zhì)資源遺傳多樣性的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分析

    2017-02-05 18:16:26陳明輝張志錄楊雨華佟偉霜
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:親緣關(guān)系遺傳多樣性紅豆杉

    陳明輝++張志錄++楊雨華++佟偉霜++楊風(fēng)嶺

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.028

    摘要:采用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分子標(biāo)記技術(shù),研究紅豆杉18份種質(zhì)的遺傳多樣性及種質(zhì)間的遺傳關(guān)系,為紅豆杉資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。以18份紅豆杉種質(zhì)資源為材料,從80條引物中篩選出19條重復(fù)性好、條帶清晰的引物進(jìn)行PCR擴增,利用NTSYS-pc2.10e軟件對其擴增位點多態(tài)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:19條引物共擴增出134條帶,其中97條具有多態(tài)性,多態(tài)性帶比率為72.39%。18個紅豆杉種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在031~0.89之間,說明SCoT標(biāo)記能夠揭示材料間較高的遺傳多樣性。利用UPGMA進(jìn)行系統(tǒng)的聚類分析顯示,在相似系數(shù)0.53處可將18份紅豆杉資源分成兩大類;主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。紅豆杉資源具有較豐富的遺傳多樣性,SCoT分子標(biāo)記技術(shù)可有效地從分子水平揭示紅豆杉種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:紅豆杉;目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT);遺傳多樣性;聚類分析;親緣關(guān)系

    中圖分類號: S791.490.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2016)10-0116-04

    收稿日期:2015-09-25

    基金項目:河南省科學(xué)攻關(guān)計劃 (編號:122102310652);河南省環(huán)境科學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目(編號:Pxy-zdxk-2013003)。

    作者簡介:陳明輝(1974—),男,河南平頂山人,博士,講師,主要從事植物生理生化及分子生物學(xué)研究。E-mail:cmh_abc@126.com。

    通信作者:楊風(fēng)玲,博士,教授,主要從事植物化學(xué)研究。E-mail:yangfl0001@163.com。紅豆杉[Taxus chinensis (Pilger) Rehd.]是第四世紀(jì)孑遺植物,已在地球上生活250萬年,是我國Ⅰ級重點保護野生植物,被稱為活化石[1-2]。1971年,美國科學(xué)家Wani等首次從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中提取獲得抗癌藥物紫杉醇(Taxol)[3],此后紅豆杉的藥用價值及其開發(fā)在我國廣泛開展。紅豆杉生長緩慢,極少成林,資源極其貧乏,而且紫杉醇含量僅為0.01%,由于紅豆杉資源遭到嚴(yán)重破壞而數(shù)量急劇下降,目前天然紅豆杉已處于嚴(yán)重瀕危狀態(tài);所以,關(guān)于紅豆杉的繁殖、保護與利用已成為當(dāng)前多個學(xué)科的研究熱點[4-11]。

    目前紅豆杉分子標(biāo)記研究取得了一定的成果。張雪梅等通過對南方紅豆杉18個居群進(jìn)行了RFLP分析,發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉現(xiàn)在的遺傳結(jié)構(gòu)可能源于居群的片段化效應(yīng)[12];Miao等利用SSR技術(shù)對14個居群的南方紅豆杉生境斷裂譜系和遺傳效應(yīng)進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)生境斷裂導(dǎo)致了云南紅豆杉近親繁殖和種群分化[13];吳瓊等利用基于紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序進(jìn)而發(fā)掘基因表達(dá)譜多態(tài)性標(biāo)記[14]。但這些分子標(biāo)記方法成本較高,操作復(fù)雜。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism,SCoT)分子標(biāo)記技術(shù)是Collard等[15]開發(fā)的一種基于SPAR(單引物擴增反應(yīng))的目的基因分子標(biāo)記新技術(shù)。SCoT依據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性,設(shè)計單引物并對基因組進(jìn)行擴增[16]。SCoT標(biāo)記結(jié)合ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點,操作簡單、成本低廉、多態(tài)性豐富,能有效地產(chǎn)生與性狀聯(lián)系的標(biāo)記,是一種能跟蹤性狀的新的分子標(biāo)記,有利于分子輔助育種[17-18]。該分子標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于花生[19]、龍眼[20]、芒果[21-22]等植物。本研究利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù),從DNA水平研究了紅豆杉18份種質(zhì)的遺傳多樣性及種質(zhì)間的遺傳關(guān)系,以期對其親緣關(guān)系有更全面了解,為資源的保護、利用以及遺傳育種提供依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    試驗材料為2013—2014年采自不同地區(qū)的18份紅豆杉種質(zhì)資源(表1),取其幼嫩葉片迅速置于液氮中速凍,帶回實驗室后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。試驗用?0對SCoT分子標(biāo)記引物序列分別參照Collard等[15]和Luo等[22]設(shè)計的引物合成,所有引物由上海生工生物工程公司合成。dNTPs、DL2000 marker和TaqDNA聚合酶以及其他試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.2方法

    1.2.1DNA提取與檢測采用改良的CTAB法[23]提取DNA,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,同時用島津BioSpec-nano型超微量分光光度計分析儀檢測DNA樣品質(zhì)量和濃度。模板DNA稀釋至50 ng/μL,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2SCoT-PCR擴增PCR擴增在ABI Veriti 梯度 PCR擴增儀上進(jìn)行。采用20 μL的反應(yīng)體系,其中含50 ng/μL模板DNA 1.0 μL、10×buffer(含Mg2+)2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL、10 μmol/L dNTPs 0.5 μL,加ddH2O至20 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性50 s,復(fù)性退火(溫度隨引物而定)1 min,72 ℃ 延伸5 min,共36個循環(huán);72 ℃延伸8 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,電泳緩沖液為1×TAE,染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

    1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    SCoT產(chǎn)物按條帶的有無分別賦值,在相同遷移位置有帶記為1,無帶記為0,建立SCoT標(biāo)記的0、1矩陣。把得到的0、1矩陣輸入NTSYS-pc2.10e計算遺傳相似性系數(shù),并進(jìn)行UPGMA聚類分析,構(gòu)建樹狀圖,分析樣品間親緣關(guān)系。利用NTSYS-pc2.10e軟件將遺傳相似系數(shù)進(jìn)行Dcenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化,求其特征量和特征向量,得到主坐標(biāo)分析圖,進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1SCoT擴增片段多態(tài)性分析

    從80條引物中篩選出重復(fù)性好、擴增條帶清晰、多態(tài)性強的SCoT引物19條。利用這19條引物對18份紅豆杉種質(zhì)資源進(jìn)行擴增,每條引物可擴增出4~14條帶,平均多態(tài)性條帶為5~10條。擴增出的DNA帶的大小介于100~1 800 bp,其中代表性擴增圖譜見圖1。19條引物共擴增出134個DNA位點,其中97個位點具有多態(tài)性,多態(tài)性比例為72.4%,說明供試的樣品遺傳多樣性比較豐富,多態(tài)性最高的是引物SCoT8和SCoT31,均達(dá)到100%,多態(tài)性最低的是引物SCoT17,為4286%(表2)。

    2.2相似系數(shù)分析

    用NTSYS-pc2.10e軟件計算紅豆杉種質(zhì)間的Jaccard遺傳相似系數(shù)(表3)。表3結(jié)果表明:18個不同地區(qū)紅豆杉種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.31~0.89之間。其中河南濟源黑龍溝的4號與河南濟源西坪村的5號相似系數(shù)為089,河南盧氏縣柴家溝的6號與河南盧氏縣毛河村的10號、甘肅徽縣北禪寺-2的14號的相似系數(shù)都為0.89,表明4號與5號、6號與10號、6號與14號的親緣關(guān)系較近。河南獲嘉縣的3號與重慶貓兒山的18號相似系數(shù)為最小,為031,說明3號與18號親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

    2.3聚類分析

    根據(jù)遺傳相似系數(shù),采用UPGMA系統(tǒng)聚類法構(gòu)建了紅豆杉試材間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)。從聚類圖(圖2)來看,在相似系數(shù)0.53為閾值時,可將所有供試材料分為Ⅰ和Ⅱ兩大類。Ⅰ類包括4份材料,分別為神龍灣的1號、雙底村的2號、獲嘉縣的3號和平頂山-2的8號;Ⅱ類包括14份材料。在閾值約為0.61時,Ⅱ類又可分成Ⅱa和Ⅱb兩個亞類,其中Ⅱa亞類包括黑龍溝的4號、西坪村的5號、平頂山-1的7號、石鼓村的9號、宣恩縣的12號、貴陽的17號等6份材料;Ⅱb亞類包括柴家溝的6號、毛河村的10號、堯山的11號、北禪寺-1的13號、北禪寺-2的14號、天水的15號、兩當(dāng)縣的16號、貓兒山的18號等8份材料。2.4主坐標(biāo)分析

    根據(jù)18份紅豆杉材料SCoT標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析,繪制三維散點圖(圖3)。從主坐標(biāo)圖(圖3)可看出,18份紅豆杉材料被分為3組,第1組為1號、2號、3號和8號,位于主坐標(biāo)圖的右方;第2組為4號、5號、7號、9號、12號和17號,位于主坐標(biāo)圖的左方;第3組為6號、10號、11號、13號、14號、15號、16號和18號,分布在主坐標(biāo)圖的中間偏下方。其中第2、3組距離相對較近,它們與第1組距離較遠(yuǎn),但第3組的15號與第1組距離較近。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示,第1組紅豆杉與第2、3組紅豆杉在分子水平上表現(xiàn)出了較大的遺傳差異,主坐標(biāo)分析可以從不同方向、不同層面更加直觀地顯示各材料間的關(guān)系。

    3結(jié)論與討論

    SCoT標(biāo)記是一種基于翻譯起始位點的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù),SCoT單引物在PCR反應(yīng)中充當(dāng)上下游引物的角色,從而使得引物結(jié)合位點之間的片段得以有效擴增,可獲得豐富的遺傳信息[24-25],所以其在紅豆杉的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分類上具有一定的可靠性。本研究將SCoT標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于紅豆杉材料的DNA多態(tài)性鑒定,在紅豆杉各材料內(nèi)均檢測到較豐富的多態(tài)性,選用的19條SCoT引物具有很高的多態(tài)性,平均多態(tài)率達(dá)到73.19%。SCoT標(biāo)記與功能基因相關(guān),能在紅豆杉各材料之間檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性,這與紅豆杉各資源間具有較豐富的多態(tài)性相一致,是進(jìn)一步開發(fā)特定功能基因標(biāo)記和建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系的基礎(chǔ)。

    從本試驗聚類結(jié)果可以看出,在Ⅰ組的4個紅豆杉材料中,8號平頂山-2紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為東北紅豆杉,這4份紅豆杉材料聚為一個類群,說明它們親緣關(guān)系較近,同屬于東北紅豆杉體系;在第Ⅱ類的Ⅱa亞類中,有6份紅豆杉材料聚為一個類群,其中7號平頂山-1和9號石鼓村紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為南方紅豆杉,說明這個類群中的6份紅豆杉和南方紅豆杉具有密切的淵源,構(gòu)成獨特的遺傳資源。在第Ⅱ類的Ⅱb亞類中,有8份紅豆杉材料聚為一個類群,其中6號柴家溝紅豆杉經(jīng)中國科學(xué)院植物研究所鑒定為中國紅豆杉,說明這個類群中的8份紅豆杉和秦嶺一帶的中國紅豆杉遺傳關(guān)系較近。

    由以上分析可知,本試驗的SCoT分子標(biāo)記數(shù)據(jù)在一定程度上反映了不同材料紅豆杉地理分布情況,說明地理因素對紅豆杉的親緣關(guān)系有很大影響;但是,有些地理距離遠(yuǎn)而遺傳距離卻比較相近,這可能與其具有相似的環(huán)境條件和常年的引種有關(guān)。

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