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    熱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)TasHSP16.9擬南芥幼苗生長(zhǎng)生理特性的影響

    2017-02-05 18:13:36李靜婷趙旭耀劉超凡秦永興
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:耐熱性丙二醛脯氨酸

    李靜婷++趙旭耀++劉超凡++秦永興

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.027

    摘要:首先研究小麥16.9 ku小分子熱激蛋白(small heat shock protein,簡(jiǎn)稱sHSP)基因(sHSP16.9)3′-UTR中微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable elements,簡(jiǎn)稱MITE)插入對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響,結(jié)果顯示:熱脅迫下,具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉(zhuǎn)錄水平較無(wú)MITE插入的基因型明顯提高,而MITE是一類特殊的DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子,推測(cè)其參與基因表達(dá)調(diào)控。隨后研究MITE參與基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制,構(gòu)建2種不同的植物表達(dá)載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉(zhuǎn)化擬南芥,結(jié)果顯示:sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,sHSP16.9基因表達(dá)量較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高;高溫脅迫下,sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中種子發(fā)芽率、幼苗存活率、游離脯氨酸含量均較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高,而丙二醛含量升高的幅度明顯低于sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。由結(jié)果可知,sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性水平較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥高,推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)該基因的表達(dá)。

    關(guān)鍵詞:MITE;TasHSP16.9;3′-UTR;擬南芥;基因調(diào)控;小麥;耐熱性;生理指標(biāo)

    中圖分類號(hào): S188;Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)10-0113-03

    收稿日期:2016-03-28

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31501310);平頂山學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):2011015G)。

    作者簡(jiǎn)介:李靜婷(1983—),女,內(nèi)蒙古包頭人,博士,講師,主要從事小麥遺傳育種學(xué)研究。E-mail:jingting_lee@163.com。在熱脅迫條件下,高等植物中誘導(dǎo)合成大量熱激蛋白,最豐富的為小分子熱激蛋白(small heat shock protein,簡(jiǎn)稱sHSP)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),高等植物中的sHSP還可在其他環(huán)境脅迫條件(如低溫、重金屬、高鹽、干旱等)下誘導(dǎo)合成,而在正常生長(zhǎng)環(huán)境條件下表達(dá)量很低,表明sHSP可能在植物耐脅迫方面發(fā)揮重要作用[1-2]。同時(shí),大量研究表明,將sHSP基因轉(zhuǎn)入植物體后,可以顯著提高植物的耐熱性。Sanmiya等將番茄線粒體sHSPs基因轉(zhuǎn)化煙草,顯著提高了煙草的耐熱性[3];張路等用灰?guī)r皺葉報(bào)春sHSP17-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱能力明顯提高[4]。熱脅迫影響植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能,發(fā)芽率、幼苗存活率、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸含量等指標(biāo)均能在一定程度上反映植物對(duì)高溫的抗性水平。

    微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable elements,簡(jiǎn)稱MITE)是一類特殊的DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子,經(jīng)常插入到基因的編碼區(qū)、內(nèi)含子、啟動(dòng)子、非翻譯區(qū)(UTR)而與基因緊密相關(guān)。但是,關(guān)于MITE插入與基因表達(dá)二者之間本質(zhì)關(guān)系的研究還比較少[5-9]。筆者所在課題組前期研究中通過單倍體分析發(fā)現(xiàn),小麥中存在2種單倍型的sHSP16.9基因,即在sHSP16.9基因3′-UTR存在1個(gè) 276 bp MITE的插入/缺失??寺?種單倍型小麥的sHSP169基因全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)子區(qū)僅有單堿基突變差異,對(duì)關(guān)鍵順式作用元件并無(wú)影響,主要差異在于3′-UTR內(nèi) 276 bp MITE的插入/缺失。在高溫、低溫脅迫條件下,具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉(zhuǎn)錄水平較無(wú)MITE插入的基因型顯著提高[10]。進(jìn)一步分別構(gòu)建2種不同的植物表達(dá)載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè),獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純系[11]。

    本試驗(yàn)利用已篩選獲得的2種不同植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的擬南芥純系進(jìn)行熱脅迫處理,測(cè)定種子發(fā)芽率、幼苗存活率、丙二醛和游離脯氨酸含量等生長(zhǎng)生理指標(biāo),分析2種類型轉(zhuǎn)基因植株的耐熱能力,進(jìn)而推測(cè)MITE對(duì)sHSP16.9基因表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1材料

    供試品種是轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥純系、轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥純系,由筆者所在課題組前期篩選獲得;此外還有哥倫比亞野生型擬南芥(WT)。

    1.2方法

    1.2.1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株熱脅迫條件的設(shè)定將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用5%次氯酸鈉溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%的 TritonX-100)處理5 min進(jìn)行表面消毒,用蒸餾水沖洗6遍。4 ℃春化處理3 d后,將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于含 25 μg/mL 潮霉素的MS培養(yǎng)基上,在溫室中培養(yǎng),光—暗周期為16 h—8 h,晝—夜溫度周期為22 ℃—18 ℃,濕度60%。培養(yǎng)10 d后選取長(zhǎng)勢(shì)好的幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中,培養(yǎng)4周后,選取生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行42 ℃高溫脅迫處理,處理時(shí)間分別為2、4、8、12、24 h,光—暗周期為16 h—8 h。分別以2種供試類型的正常生長(zhǎng)條件轉(zhuǎn)基因擬南芥植株為對(duì)照,每個(gè)處理組進(jìn)行3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

    1.2.2種子萌發(fā)的熱脅迫處理將消毒處理后的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子春化處理3 d后,在48 ℃水浴中處理2、3、4、5 h,分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養(yǎng)基上,于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2周后觀察種子的萌發(fā)情況,拍照并統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。

    1.2.3幼苗的熱脅迫處理將消毒、春化處理后的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養(yǎng)基上,在組培瓶中培養(yǎng)3周后,對(duì)轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥幼苗進(jìn)行獲得耐熱性檢測(cè),即首先在38 ℃預(yù)處理2 h,隨后轉(zhuǎn)移至45 ℃致死高溫下分別處理1、2、3 h。處理后的擬南芥仍放回光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長(zhǎng)6 d,觀察表型并且拍照統(tǒng)計(jì)成活率。

    1.2.4生理指標(biāo)測(cè)定取上述熱脅迫處理的轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥植物的葉片進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取平均值。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[12-13]測(cè)定;游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取比色法[12-13]測(cè)定。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2007、SPSS 18.0進(jìn)行分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1轉(zhuǎn)基因擬南芥中sHSP16.9的表達(dá)模式

    對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代純系進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn),sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提高(圖1)。推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)了sHSP16.9基因的表達(dá)。

    2.2熱脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響

    分別統(tǒng)計(jì)處理不同時(shí)間點(diǎn)的種子萌發(fā)率,由表1可以看出:在48 ℃熱脅迫下,擬南芥種子的萌發(fā)受到破壞或抑制,隨著熱激處理時(shí)間延長(zhǎng),種子萌發(fā)率逐漸下降,在熱激處理5 h后,2種類型轉(zhuǎn)基因、野生型擬南芥種子都未萌發(fā);在同一熱激處理時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥種子萌發(fā)率最高,轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥次之,WT的萌發(fā)率最低。本試驗(yàn)結(jié)果表明,sHSP16.9超表達(dá)能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性,而且sHSP16.9+MITE超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥較sHSP16.9超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性高。結(jié)果同時(shí)也表明,轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

    2.3熱脅迫對(duì)幼苗的影響

    分別統(tǒng)計(jì)處理不同時(shí)間點(diǎn)的幼苗存活率,由表2、圖2可以看出:隨著45 ℃熱激處理時(shí)間延長(zhǎng),擬南芥植株成活率逐漸下降;45 ℃致死高溫處理3 h,野生型擬南芥幼苗已完全白化、死亡,轉(zhuǎn)基因擬南芥部分幼苗也出現(xiàn)白化,部分幼苗葉片大面積出現(xiàn)黃綠色,但仍然能夠生長(zhǎng),轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥幼苗成活率最高。本試驗(yàn)結(jié)果表明:sHSP16.9超表達(dá)能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐熱性,而且轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥耐熱性較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高;同時(shí)表明,轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達(dá)量較轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

    2.4熱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥生理指標(biāo)的影響

    2.4.1高溫脅迫下丙二醛含量的變化由圖3可以看出,在高溫脅迫下,2種類型轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中MDA含量均明顯增加,都明顯高于相應(yīng)對(duì)照;但是轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片MDA含量在各處理時(shí)間點(diǎn)都低于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥,表明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥的膜脂過氧化作用較小,因而具有更強(qiáng)的耐熱能力。

    在熱脅迫前4 h,2種類型轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片MDA含量均升高,可能是由于高溫造成植物體內(nèi)的自由基代謝平衡失調(diào)、MDA積累;熱脅迫8 h,MDA含量均迅速下降,可能是擬南芥內(nèi)源熱激蛋白被誘導(dǎo)大量表達(dá),協(xié)助熱變性的蛋白進(jìn)行正確折疊,并保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,導(dǎo)致MDA含量均迅速下降;隨后MDA含量均迅速上升,可能由于擬南芥誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源熱激蛋白開始降解,膜脂過氧化程度加劇,膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量迅速上升。

    2.4.2高溫脅迫下游離脯氨酸含量的變化由圖4可以看出,高溫脅迫會(huì)使擬南芥葉片游離脯氨酸含量明顯提高,都明顯高于對(duì)照水平,但轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片游離脯氨酸含量在各處理時(shí)間點(diǎn)上都高于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥。可見轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥對(duì)高溫脅迫有更積極的響應(yīng)和應(yīng)對(duì),表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性。在前4 h的熱處理中,轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量緩慢提高,2種類型轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥差異不明顯;但是在熱處理4 h以后,2種類型轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量迅速提高,且差異明顯,可能是擬南芥內(nèi)源熱激蛋白被誘導(dǎo)大量表達(dá),提高了細(xì)胞穩(wěn)定性,促使合成大量游離脯氨酸,從而提高了細(xì)胞的耐熱性。

    3討論與結(jié)論

    小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位,但是隨著工業(yè)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展,溫室氣體大量排放,全球溫度逐漸上升,嚴(yán)重影響了小麥的正常生長(zhǎng)發(fā)育。由于干熱風(fēng)的影響,一般年份小麥減產(chǎn)10%~20%,嚴(yán)重年份減產(chǎn)30%以上。為此,我國(guó)育種學(xué)家一直致力于小麥耐熱品種的選育和相關(guān)耐熱基因的功能研究。

    在逆境下,植物細(xì)胞內(nèi)氧自由基平衡遭到破壞,發(fā)生膜脂過氧化作用,而丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物,可以反映細(xì)胞膜的損傷程度,丙二醛含量越高,說(shuō)明質(zhì)膜受損越嚴(yán)重。因此,逆境下的丙二醛含量可以顯示質(zhì)膜受損程度,反映植物的耐性大小。大量研究表明,在高溫脅迫下,植物體內(nèi)丙二醛含量顯著增加,但是耐熱品種中丙二醛含量低于熱敏感品種[14-15]。在熱脅迫下,報(bào)春PFsHSPs17-1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于野生型對(duì)照,表現(xiàn)出較高的抗膜脂過氧化能力,因而具有更強(qiáng)的高溫適應(yīng)能力[4]。

    在高溫脅迫下,植物為防止細(xì)胞脫水而受害,會(huì)生成并積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),提高原生質(zhì)親水性,有助于細(xì)胞持水,保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。游離脯氨酸便是一類重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),因此可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。大量研究表明,在高溫脅迫下,細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量會(huì)明顯增加,以增強(qiáng)植物的耐熱性[15-16]。在高溫脅迫下,報(bào)春PFsHSPs17-1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中游離脯氨酸含量明顯高于野生型對(duì)照,轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫脅迫有更積極的響應(yīng),表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性[4]。

    在本試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥,而前者游離脯氨酸含量、種子發(fā)芽率和幼苗成活率均明顯高于后者,表明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥具有更強(qiáng)的耐熱性。同時(shí)研究表明,將sHSP轉(zhuǎn)基因超表達(dá)后,可以顯著提高植物的耐熱性[3-4]。也證明轉(zhuǎn)sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9表達(dá)量高于轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥,進(jìn)而推測(cè)sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強(qiáng)了sHSP16.9 基因的表達(dá)。同時(shí),本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)sHSP16.9基因擬南芥種子發(fā)芽率、幼苗成活率均明顯高于野生型擬南芥,證明sHSP對(duì)提高植物耐熱性具有重要的作用,為小麥耐熱性育種研究提供了新思路。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Sato Y,Yokoya S. Enhanced tolerance to drought stress in transgenic rice plants overexpressing a small heat-shock protein,sHSP17.7[J]. Plant Cell Reports,2008,27(2):329-334.

    [2]Mahmood T,Safdar W,Abbasi B H,et al. An overview on the small heat shock proteins[J]. African Journal of Biotechnology,2009,8(25):7290-7302.

    [3]Sanmiya K,Suzuki K,Egawa Y,et al. Mitochondrial small heat-shock protein enhances thermos tolerance in tobacco plants[J]. FEBS Letters,2004,557(1/2/3):265-268.

    [4]張路,胡偉娟,張啟翔,等. 報(bào)春PF sHSP 17-1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及耐熱鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2011(11):177-181.

    [5]Yang G,Dong J,Chandrasekharan M B,et al. Kiddo,a new transposable element family closely associated with rice genes[J]. Molecular Genetics and Genomics,2001,266(3):417-424.

    [6]Patel M,Jung S,Moore K,et al. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the FAD2 gene[J]. Theoretical and Applied Genetics,2004,108(8):1492-1502.

    [7]Yang G,Lee Y H,Jiang Y,et al. A two-edged role for the transposable element Kiddo in the rice ubiquitin2 promoter[J]. The Plant Cell,2005,17(5):1559-1568.

    [8]Magalhaes J V,Liu J,Guimares C T,et al. A gene in the multidrug

    and toxic compound extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum[J]. Nature Genetics,2007,39(9):1156-1161.

    [9] Hou J N,Long Y,Raman H,et al. A Tourist-like MITE insertion in the upstream region of the BnFLC.A10 gene is associated with vernalization requirement in rapeseed (Brassica napus L.)[J]. BMC Plant Biology,2012,12(1):463-480.

    [10]Li J T,Wang Z Z,Peng H R,et al. A MITE insertion into the 3′-UTR regulates the transcription of TaHSP16.9 in common wheat[J]. Crop Journal,2014,2(6):381-387.

    [11]李靜婷,王健勝,楊風(fēng)玲.小麥MITE轉(zhuǎn)座子對(duì)sHSP基因的表達(dá)調(diào)控研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(12):29-32.

    [12]陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 廣州:華南理工大學(xué)出版社,2002.

    [13]侯福林.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京:科學(xué)出版社,2004.

    [14]葉凡,侯喜林,袁建玉.高溫脅迫對(duì)不結(jié)球白菜幼苗抗氧化酶活性和膜脂過氧化作用的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,23(2):154-156.

    [15]彭華婷,高悅,杜紅梅,等. 高溫脅迫對(duì)大花三色堇幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2012,30(6):66-71.

    [16]萬(wàn)里強(qiáng),李向林,何峰,等. 熱脅迫下兩種禾草抗性生理指標(biāo)的變化[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,25(4):1468-1472.陳明輝,張志錄,楊雨華,等. 紅豆杉種質(zhì)資源遺傳多樣性的目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(10):116-119.

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