鹽單胞菌Fosmid文庫構(gòu)建及群體感應(yīng)淬滅酶的篩選

薛鵬飛++柳鵬福++史吉平++李麗霞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.020

摘要：通過構(gòu)建鹽單胞菌Fosmid基因組文庫，以求篩選到群體感應(yīng)淬滅酶（AHL降解酶）。采用改良的SDS-CTAB法提取1株鹽單胞菌基因組DNA，經(jīng)平末端連接、包裝和轉(zhuǎn)染后，成功構(gòu)建鹽單胞菌Fosmid基因組文庫。該文庫庫容1 700個克隆，平均插入片段約35 kb，共包含約60 Mb的DNA容量，覆蓋該菌基因組10倍以上。然后以加 X-gal的MM基本培養(yǎng)基篩選AHL降解酶陽性克隆，對文庫進行功能驅(qū)動的藍白斑篩選。通過初篩，篩選到3個Fosmid陽性克隆，證實了所構(gòu)建的Fosmid基因組文庫能夠應(yīng)用于AHL降解酶的活性篩選。同時該Fosmid文庫亦可進一步用于其他功能基因的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：鹽單胞菌；Fosmid基因組文庫；藍白斑篩選；群體感應(yīng)淬滅酶

中圖分類號： Q785文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0088-04

收稿日期：2015-10-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：41306142）。

作者簡介：薛鵬飛（1991—），男，河北南和人，碩士研究生，從事海洋環(huán)境中群體感應(yīng)淬滅酶資源發(fā)掘及酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)研究。E-mail：xpflying@yeah.net。

通信作者：李麗霞，副教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)、植物蛋白質(zhì)組學(xué)和海洋藻類生態(tài)毒理學(xué)等研究。植物的細菌性病害是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一。病害的發(fā)生往往造成作物大面積減產(chǎn)，并在農(nóng)產(chǎn)品貯藏、加工、運輸過程中進一步造成更大危害，帶來巨大損失。目前主要采用化學(xué)藥物來防治細菌性病害。這些化學(xué)藥物的使用顯著減輕了病害的危害程度，減少了經(jīng)濟損失，但也帶來了環(huán)境污染、細菌耐藥性增加及化學(xué)藥物殘留等諸多問題。近年來，隨著對環(huán)保意識的提高，人們越來越崇尚自然健康的生活方式，對植物病害的防治也提出了更高的要求，生物防治日益受到重視。

很多植物病原菌的致病性受一種被稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)的機制調(diào)控 [1]。很多病原菌的致病能力受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控[2-4]，也能被群體淬滅（quorum quenching，QQ）機制干擾和減弱。以細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)的群體淬滅已被證明是防治這一類細菌性病害的有效策略。具有群體淬滅功能的信號分子降解酶能水解信號分子，進而干擾致病基因的表達，起到防治病害的作用[5]。2000年，Dong等篩選到1株能特異性降解AHL類信號分子的芽孢桿菌（Bacillus sp.）240B1，并從中分離到aiiA基因，將其轉(zhuǎn)入致病菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）SCG1后，顯著減少了后者AHL類信號分子的產(chǎn)生，降低了其對馬鈴薯、胡蘿卜等的致病性。將該基因轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯后，這些植物對胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1導(dǎo)致的軟腐病抗性大大增強[6]。從第1個內(nèi)酯酶AiiA被發(fā)現(xiàn)至今，已有約20種內(nèi)酯酶基因得到了克隆與鑒定。篩選有實際應(yīng)用價值的高活性信號降解酶是目前生物防治領(lǐng)域的研究熱點之一。

目前，穩(wěn)定的大片段基因組文庫可以作為研究基因組學(xué)及功能基因的重要材料[7]。Fosmid 載體是現(xiàn)在流行的用于替代Cosmid載體構(gòu)建大片段文庫的新載體。與BAC文庫構(gòu)建相比，F(xiàn)osmid文庫的構(gòu)建更簡單、快速，可利用其進行全基因組物理圖譜構(gòu)建、研究基因功能和表達調(diào)控、重要性狀基因的圖位克隆和基因結(jié)構(gòu)及功能分析等。Fosmid文庫中重組載體在宿主菌中以單拷貝形式存在，穩(wěn)定性好，需要時可誘導(dǎo)達到高拷貝；且其隨機性好，保證了每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。近年來，F(xiàn)osmid文庫已被廣泛應(yīng)用于基因圖位克隆、物理圖譜的構(gòu)建、比較基因組及功能基因的篩選與研究。

本實驗室分離了大量細菌，并從中篩選出一系列具有信號分子降解活性的細菌，鑒定后發(fā)現(xiàn)其中有1株鹽單胞菌1A01339（Halomonas salaria）首次被發(fā)現(xiàn)具有信號降解的活性。本研究對該菌株構(gòu)建合格的Fosmid基因組文庫。利用實驗室構(gòu)建的高通量篩選平臺，通過功能驅(qū)動的藍白斑篩選得到Fosmid陽性克隆，以期為后續(xù)分離純化該群體感應(yīng)淬滅酶及深入研究其酶學(xué)性質(zhì)和催化機制奠定基礎(chǔ)。同時該文庫可用于其他功能基因的開發(fā)與研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源鹽單胞菌1A01339（Halomonas salaria）購自于中國海洋微生物菌種保藏管理中心，經(jīng)鑒定具有群體感應(yīng)淬滅活性；根癌農(nóng)桿菌NTI（traR；tra：：lacZ749）由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器溶菌酶、蛋白酶K、Not Ⅰ購自Thermo Scientific公司；λ/Hind Ⅲ Digest DNA Marker低熔點瓊脂糖酶β-Agarase購自于TaKaRa公司；文庫構(gòu)建試劑盒Copy Control Fosmid Library Production Kit、大腸桿菌EPI300-T1購自Epicentre公司；小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自于Axygen公司；X-gal、IPTG、OOHL（3-oxo-C8-HSL）購自Sigma公司；核酸電泳儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-RAD）；各型規(guī)格移液器、小型離心機（Eppenendorf）；恒溫培養(yǎng)箱 （上海智城分析儀器）；純水制備系統(tǒng)（Milipore）。

1.1.3主要培養(yǎng)基高鹽LB培養(yǎng)基：含3%質(zhì)量濃度NaCl的LB培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：加有20 mg/mL X-gal的1.5%質(zhì)量濃度瓊脂固體MM基本培養(yǎng)基，所用抗生素終濃度為卡那霉素50 μg/mL。

1.2鹽單胞菌Fosmid文庫的構(gòu)建及鑒定

1.2.1鹽單胞菌基因組DNA的提?。ǜ牧糞DS-CTAB法）為了能順利獲得較為完整的鹽單胞菌基因組，本研究采用改良的SDS-CTAB法提取。具體操作步驟如下：挑取鹽單胞菌1A01339接種于50 mL高鹽LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)；取1.5 mL上述菌液于2 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄去上清；菌體洗滌2次，5 000 r/min離心5 min，棄去上清；加入564 μL的TE重置懸浮，然后加入約10 μg溶菌酶，輕輕混勻，37 ℃溫育1 h；再加入50 μL 10% SDS和 3 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），輕輕混勻，37 ℃溫育2 h；加入100 μL 5 mol/L NaCl，混合均勻，65 ℃反應(yīng)2 min；加入80 μL CTAB-NaCl，混合均勻，65 ℃反應(yīng)10 min；加入等體積的氯仿-異戊醇（24 ∶1），振蕩均勻，9 000 r/min離心10 min；上清移至另一離心管中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25 ∶24 ∶1），輕輕混勻，10 000 r/min離心10 min；上清移至另一離心管加入0.6倍體積異丙醇（貼壁加入），輕輕顛倒混勻，靜置10 min，9 000 r/min 離心5 min；棄上清，用70%乙醇洗滌2次，10 000 r/min 離心5 min；離心管倒立于鋪開的紙巾上，數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA；干燥DNA溶于 50 μL TE中。-20 ℃保存。

1.2.2基因組Fosmid文庫的構(gòu)建研究依照Copy Control Fosmid Library Production Kit說明構(gòu)建Fosmid文庫。因為構(gòu)建Fosmid基因組文庫所需要的最合適的DNA大小范圍為 30～40 kb，所以需將將大片段的高質(zhì)量基因組DNA隨機剪切成大小均勻的片段（控制在25～40 kb之間）。為保證對基因組DNA處理的隨機性，本研究未使用限制性內(nèi)切酶進行處理。采用200 μL小孔徑Tip反復(fù)吹吸50、100、150、200、250次，通過調(diào)整吹吸次數(shù)來獲得最合適的DNA片段。電壓 30～35 V電泳過夜，檢測隨機剪切程度，切下30～40 kb相應(yīng)區(qū)間片段，用低熔點瓊脂糖酶 β-Agarase對DNA片段進行消化回收。利用End-Repair Enzyme將DNA片段進行平末端處理和5′磷酸化修飾。利用連接酶Fast-Link DNA Ligase將獲得的DNA片段連接于Fosmid黏粒載體上。連接液用噬菌體蛋白λ Packaging Extracts包裝，加入氯仿輕柔混勻，包裝液經(jīng)梯度稀釋后侵染宿主EPI300-T1感受態(tài)細胞，確定合適的稀釋比例。以經(jīng)過適當(dāng)稀釋的包裝液侵染宿主EPI300-T1感受態(tài)細胞，37 ℃孵育1 h。最后將包裝完成的菌液涂布于含12.5 μg/ mL氯霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，構(gòu)建成Fosmid基因組文庫。

1.2.3文庫重組克隆子的鑒定插入片段大小鑒定：在平板上隨機挑取14個克隆子培養(yǎng)并根據(jù)Fosmid文庫構(gòu)建說明加入多拷貝誘導(dǎo)液對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其獲得高拷貝數(shù)質(zhì)粒。采用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，Not Ⅰ酶切，如上條件進行低電壓普通電泳，檢測插入片段的大小分布情況，鑒定Fosmid文庫質(zhì)量?？寺》€(wěn)定性檢測：隨機挑取5個克隆，分別接種于3 mL含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)5 d，分別提取第50代（培養(yǎng)3 d）和第100代（培養(yǎng)5 d）菌液中的質(zhì)粒，Not Ⅰ酶切后，電泳檢測。

1.2.4Fosmid文庫保存（1）短期保存：Fosmid文庫克隆在平板上培養(yǎng)后可暫時保存1～2個月。（2）長期保存：用無菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于96孔培養(yǎng)板中，每個菌落1個孔格，每孔加入含氯霉素的 12.5 mg/L 液體培養(yǎng)基，用封口膜密封，37 ℃恒溫箱箱中培養(yǎng)過夜。加入終濃度為10%的甘油，保存于-80 ℃。

1.3群體感應(yīng)淬滅酶陽性克隆的篩選

本研究采用根癌農(nóng)桿菌NTI（traR，tra：：lacZ749）對文庫進行篩選。將文庫單克隆接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。再加至終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h菌液與等體積2 μmol/L OOHL（3-oxo-C8-HSL）混合并反應(yīng)2 h作為待測樣品（本研究以O(shè)OHL作為AHL分子標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測）。以加有X-gal的MM瓊脂固體培養(yǎng)基為生測培養(yǎng)基，用無菌小刀將培養(yǎng)基瓊脂切成間隔的細條狀，在細條的上端加入待測的樣品，在樣品的下面連續(xù)點接農(nóng)桿菌NTI，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄試驗結(jié)果。當(dāng)樣品中存在AHL分子時，隨著分子在培養(yǎng)基內(nèi)不斷向下擴散，激活生測菌株中l(wèi)acZ基因的表達，可使菌落呈現(xiàn)藍色； AHL分子濃度越大，擴散距離越遠，就有越多的指示菌變藍。通過觀察變藍的數(shù)量就可判斷AHL分子的濃度。本研究分別以O(shè)OHL分子與無菌水作為陽性對照與陰性對照，通過指示菌變色程度篩選陽性克隆。

2結(jié)果與分析

2.1鹽單胞菌基因組DNA的提取

本研究中鹽單胞菌1A01339基因組DNA提取采用改良的CTAB-NaCl法提取后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。高質(zhì)量的基因組DNA為后續(xù)構(gòu)建Fosmid文庫提供良好的樣品。

2.2Fosmid文庫構(gòu)建質(zhì)量鑒定與評價

由于構(gòu)建Fosmid文庫需要將大片段的高質(zhì)量基因組DNA剪切成大小均勻的片段（30～40 kb），而本試驗提取的鹽單胞菌基因組DNA片段完整，因此要對DNA進行剪切。電壓30～35 V電泳過夜，電泳檢測結(jié)果見圖2，可確定經(jīng)250次剪切效果最佳。故以經(jīng)250次剪切的基因組DNA為材料，采用低熔點瓊脂糖酶β-Agarase對DNA片段進行消化回收。經(jīng)電泳檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)回收片段介于23～42 kb之間，符合建庫要求，可以用于構(gòu)建Fosmid文庫。

本試驗共獲得約1 700個克隆。隨機挑取14個克隆分析插入片段的大小。Not Ⅰ酶切片段進行低電壓普通瓊脂糖凝膠電泳。從圖4可以看到，14個陽性菌落的酶切產(chǎn)物中均有1條同樣大小的條帶，此條帶極為pCC1FOS載體（8.1 kb）?？寺∽又胁迦胱铋L片段約為42 kb，最短片段約為25 kb；將所有片段進行統(tǒng)計得到插入片段平均長度為35 kb，插入率為100%?？寺∑慰値烊葸_到60 Mb，假設(shè)該鹽單胞菌基因組以4.5 Mb為計，則整個文庫包含的DNA量超過該菌基因組的10倍，且克隆質(zhì)粒酶切帶型多態(tài)性較強，說明了文庫克隆的隨機性大。

通過克隆的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)第100代酶切圖譜與第0代無任何明顯差異，未發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排，說明所構(gòu)建的Fosmid文庫是穩(wěn)定的。高質(zhì)量的Fosmid文庫提供了后續(xù)功能篩選陽性克隆的基礎(chǔ)。

2.3群體感應(yīng)淬滅酶陽性克隆篩選

研究表明，對基因文庫進行活性篩選要比序列篩選容易獲得更新型的基因[7]。因此，從Fosmid文庫中挑取克隆子，利用功能驅(qū)動的藍白斑篩選AHL降解酶，并以此驗證活性篩選Fosmid文庫中生物催化劑的可行性。

常規(guī)研究多采用以β-葡萄糖苷酶為報告系統(tǒng)的基因重組菌株根癌農(nóng)桿菌NTI（traR，tra：：lacZ749）篩選產(chǎn)AHL降解酶的菌株，其原理為：根癌農(nóng)桿菌NTI中含有編碼受體蛋白TraR的traR基因和由tra啟動子控制表達的β-半乳糖甘酶基因tra：：lacZ749，同時自身缺失traI基因，不能合成AHL信號分子。當(dāng)外源的AHL信號分子被加入時，traR基因表達的蛋白TraR 與AHL分子結(jié)合后可激活lacZ基因的表達，產(chǎn)生β-半乳糖甘酶從而使加有X-gal的平板培養(yǎng)基顯藍色。通過前期篩選工作，已確定該株鹽單胞菌1A01339具有群體感應(yīng)淬滅活性（圖5）。

本研究對構(gòu)建的Fosmid文庫進行高通量活性初篩，共獲得3個有活性的陽性克?。?0B4、11G10和23A3（圖6）。經(jīng)后續(xù)驗證，這些Fosmid克隆均具有AHL降解酶活性，可為分離鑒定該菌株的群體感應(yīng)淬滅酶開展后續(xù)研究。

3討論

基因組文庫是上世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種研究基因組特性、分離新基因的技術(shù)手段，它包含了基因組的全套遺傳信息，人們可用相應(yīng)的基因探針從文庫中調(diào)取出任一特定的基因片段加以研究。通過構(gòu)建基因組文庫，再結(jié)合功能性篩選的方法，大量基因信息被發(fā)現(xiàn)。目前大部分研究傾向于

構(gòu)建小片段質(zhì)粒文庫，但與小片段文庫相比，大片段文庫如Fosmid文庫有明顯的優(yōu)點，因其插入片段長度較長（30～ 40 kb），單個克隆可涵蓋完整代謝途徑的多基因簇，可能更有利于基因及其周圍信息的發(fā)現(xiàn)，因而廣泛應(yīng)用于對生物活性物質(zhì)功能性篩選的研究中[9]，但用該方法篩選AHL降解酶基因的報道尚少見。因而，考慮到Fosmid文庫片段長度和容量上的優(yōu)勢，應(yīng)用Fosmid文庫的方法可能利于群體感應(yīng)淬滅酶的篩選和鑒定。

2000年，Dong等鑒定了2類分解AHL群體感應(yīng)信號的水解酶——AHL內(nèi)酯酶和酰胺酶，并發(fā)現(xiàn)將該類基因轉(zhuǎn)入植物病原菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌后，減弱了各種試驗植物軟腐病的癥狀，從而首次提出群體淬滅生物防治的新概念[6]。這些研究的主要成果發(fā)表在《Nature》和《PNAS》等權(quán)威學(xué)術(shù)刊物上，開辟了群體淬滅這一新的研究領(lǐng)域[10-12]。自此以后，世界各國很多學(xué)者都開展了篩選分離AHL信號分子降解酶的工作，并發(fā)現(xiàn)了一系列AHL降解酶[13]。

本研究通過Fosmid文庫構(gòu)建并成功篩選到具有群體感應(yīng)淬滅活性的陽性克隆。利用改良的SDS-CTAB法提取1株鹽單胞菌基因組DNA，并采用Epicentre公司的文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了鹽單胞菌高質(zhì)量的Fosmid基因組文庫，并通過功能驅(qū)動的藍白斑篩選群體感應(yīng)淬滅酶，最后成功獲得3個Fosmid陽性克隆子。表明構(gòu)建的Fosmid文庫能夠用于AHL降解酶的活性篩選，為后續(xù)開展分離鑒定該菌株的群體感應(yīng)淬滅酶奠定了基礎(chǔ)。同時所構(gòu)建的鹽單胞菌Fosmid文庫亦可進一步用于其他功能基因的開發(fā)。

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