瓜類細(xì)菌性果斑病研究新進展

蔡馥宇，關(guān) 巍，喬 培，閆建培，楊玉文，趙廷昌

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 長沙 410128； 2.植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室·中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 北京 100193）

瓜類細(xì)菌性果斑病研究新進展

蔡馥宇1,2，關(guān) 巍2，喬 培2，閆建培2，楊玉文2，趙廷昌1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 長沙 410128； 2.植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室·中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 北京 100193）

瓜類細(xì)菌性果斑病是一種植物細(xì)菌性病害，是近年來傳入我國的檢疫性細(xì)菌病害，病原菌為西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）。瓜類細(xì)菌性果斑病是典型的種傳細(xì)菌性病害，主要侵染西瓜、甜瓜等葫蘆科作物，給西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了重大損失。筆者從該病害病原菌的傳播發(fā)生途徑、檢測鑒定及其相關(guān)致病機制、防控管理等方面對瓜類細(xì)菌性果斑病的研究進展進行綜述，為今后對該病害進行有效的檢測及防治提供參考。

西瓜噬酸菌；檢測；鑒定；致病機制；防控管理

瓜類細(xì)菌性果斑病是危害西瓜、甜瓜等多種葫蘆科作物的一種重要的種傳細(xì)菌性病害。其病原菌是西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli），是一種活體營養(yǎng)型細(xì)菌，屬于革蘭氏染色陰性菌。該病害廣泛分布于世界各地，近年來傳入中國。由于其具有較高的破壞性，對西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅，影響瓜農(nóng)經(jīng)濟收益，是危害我國西瓜、甜瓜生產(chǎn)的重要病害。2007年，西瓜噬酸菌被列入《中華人民共和國進境植物有害性生物名錄》中。由于西瓜噬酸菌種內(nèi)的多樣性及與寄主之間關(guān)系復(fù)雜，使得對該病害的防控十分困難，目前仍沒有找到有效的防治手段。

當(dāng)前的研究多集中于病害檢測和防治、傳播方式以及致病機制等方面。筆者從西瓜噬酸菌檢測鑒定、致病機制、防治管理等方面，對其國內(nèi)外研究進展及防治方法予以概述，以期為對其進行有效的檢測及防治提供理論參考。

1 傳播發(fā)生

瓜類細(xì)菌性果斑病為種傳病害，其病原菌可以附著在種子表面，種子發(fā)芽后可感染子葉和真葉。帶菌種子是該病主要初侵染來源，感病果實分泌的菌膿可造成二次侵染。Chalupowicz等[1]通過使用掃描電鏡、熒光標(biāo)記等技術(shù)證實，在西瓜育苗棚中子葉為主要的二級侵染源。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一些新的傳播方式，Choi等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨（two-spotted spider mite，TSSM）可以作為西瓜噬酸菌的傳播媒介，通過轉(zhuǎn)座子構(gòu)建綠色熒光標(biāo)記的西瓜噬酸菌突變體菌株，發(fā)現(xiàn)TSSM可以將西瓜噬酸菌從感病西瓜植株傳播至健康植株上；B.Dutta等[3]研究表明，西瓜噬酸菌從植株柱頭侵入可以比從果皮侵入更快地在西瓜胚珠定殖，在這個過程中，花粉管起到了重要作用。這些侵染傳播途徑的發(fā)現(xiàn)可以為瓜類細(xì)菌性果斑病的防控提供新的思路。

2 鑒定檢測

瓜類細(xì)菌性果斑病是我國的檢疫性病害，目前主要使用的檢測方法有血清學(xué)檢測以及基于PCR的檢測等。近年來的研究報道多集中于基于PCR的檢測研究。

Wu等[4]研究表明，在隔熱等溫PCR（insulatedisothermal PCR，TiiPCR）的條件下構(gòu)建TaqMan探針可實現(xiàn)對A.citrulli的檢測，在熒光信號強度超過1.8的條件下，每個細(xì)菌反應(yīng)管可達100%的檢測率，成功開發(fā)了基于TiiPCR的特異性，能夠快速和敏銳地檢測A.citrulli。Tian等[5]研究表明，構(gòu)建PLP探針和點雜交技術(shù)比常規(guī)PCR更有效，可用于種子健康測試。Kim等[6]構(gòu)建了檢測A.citrulli的巢式PCR系統(tǒng)，在檢測病菌方面具有較高的靈敏度。Zeng等[7]研究表明，通過篩選高特異性單克隆抗體6D，將單一6D用作納米金標(biāo)記抗體和測試抗體，以開發(fā)出self-paired colloidal gold immunochromatographic test strip（Sa-GICS）；使用 Sa-GICS 方法獲得的檢測閾值為105CFU·mL-1，可檢出A.citrulli的8個菌株，且不與其他病原微生物發(fā)生交叉反應(yīng)。

近年來，對西瓜嗜酸菌遺傳特異性方面的研究也有了初步進展。Zhong等[8]通過研究設(shè)計出pilL基因的特異性引物，實現(xiàn)了對西瓜噬酸菌2個亞組的區(qū)分。Yan等[9]研究表明，通過使用PFGE和MLST對西瓜噬酸菌118個菌株進行遺傳差異性分析，發(fā)現(xiàn)MLST可以更好地區(qū)分不同亞組。Song等[10]通過使用5個保守的基因位點(16S rRNA、adk、gltA、glyA、pilT)對韓國的西瓜噬酸菌進行分組，證實了韓國西瓜噬酸菌種群的不同，韓國的A.citrulli種群之間存在遺傳分化。

3 致病機制

目前尚未找到對瓜類細(xì)菌性果斑病具有較高抗性或免疫的品種，所以對其病原菌西瓜嗜酸菌的致病機制的研究尤為重要。目前對其的研究分為分泌系統(tǒng)、IV型菌毛、群體感應(yīng)、趨化性、毒素-抗毒素系統(tǒng)、基因組轉(zhuǎn)錄組分析等幾個方面。

3.1 分泌系統(tǒng)

西瓜噬酸菌屬于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陰性菌通過幾種固定的蛋白分泌系統(tǒng)來分泌效應(yīng)因子[11]。目前研究較為集中的主要有Ⅰ～VI型6種蛋白分泌系統(tǒng)，它們與病原菌的致病性密切相關(guān)。近年來在西瓜噬酸菌中研究較多的為II、Ⅲ、VI分泌系統(tǒng)。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢ secretion system，T3SS）廣泛存在于動、植物病原細(xì)菌中[11]。T3SS由hrp基因編碼，hrp基因簇由20多個基因組成[13]。陳亮等[13]通過研究篩選到了可以誘導(dǎo)T3SS的培養(yǎng)基，建立了TTSS抑制劑高通量篩選體系，采用qRT-PCR技術(shù)對經(jīng)過丙二腈肟醚類化合物處理的菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)對TTSS編碼基因簇hrp/hrc中的保守基因hrcU、hrcC、hrcJ，外泌裝置基因hrpE以及泌出物基因hopDl的表達量有明顯影響，部分基因的表達量減少80%以上，由此可推測丙二腈肟醚類化合物可能是一種新的TTSS抑制劑，可影響西瓜嗜酸菌的致病性。hrcN基因?qū)儆贏AA+ATPase家族，產(chǎn)物為ATPase，該家族蛋白可以利用水解ATP的能量重塑多種底物蛋白[14]。嚴(yán)婉榮等[15]為明確hrcN基因與其他基因的關(guān)系，通過實時熒光定量PCR法定量檢測了 hrpA、hrcV、hrcU、LuxI、LuxR 共 5 個基因的表達量。結(jié)果顯示，與野生型相比，突變體致病力和致敏性明顯減弱，致病時間延遲，群體感應(yīng)信號減弱，生長能力明顯下降，運動性減弱，互補菌株只能恢復(fù)部分功能，5個基因在突變體中的表達量均上調(diào)?？芍猦rcN基因與這5個基因之間均為負(fù)調(diào)控關(guān)系。Noam Eckshtain-Levi等[16]對西瓜噬酸菌I、II型菌株的T3SS效應(yīng)蛋白進行比較分析，通過DNA指紋圖譜、DNA雜交、氣相色譜等技術(shù)對22個菌株進行分型，發(fā)現(xiàn)I、II型菌株的效應(yīng)蛋白確實存在不同，并鑒定到一個III型菌株ZUM4000。

Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌的毒性蛋白能夠破壞寄主細(xì)胞，進而引起組織壞死或感病。T2SS需要通過一般分泌途徑（Sec-pathway）或雙精氨酸分泌途徑（Tat-pathway）將蛋白轉(zhuǎn)運出細(xì)胞內(nèi)膜，并且它們需要識別分泌蛋白N-端信號肽序列[17]。潘宏等[18]通過利用KEGG和string，并結(jié)合文獻報道對西瓜噬酸菌T2SS分泌的效應(yīng)蛋白進行預(yù)測，預(yù)測出23個同源基因序列，這些序列按蛋白功能可分為細(xì)胞壁降解酶、菌毛和鞭毛蛋白及其他毒力因子。蔣潔等[19]通過對雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)基因進行研究，發(fā)現(xiàn)Tat系統(tǒng)相關(guān)基因tatB的缺失會影響西瓜噬酸菌的生物學(xué)特性，并導(dǎo)致病菌致病能力降低。由此可以推測，基因的差異會導(dǎo)致西瓜嗜酸菌致病性的不同。

VI型分泌系統(tǒng)也對革蘭氏陰性菌的致病力具有重要作用，可以增強細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性，并參與病原菌對寄主的致病力調(diào)節(jié)。Tian等[20]通過研究構(gòu)建了VI型分泌系統(tǒng)核心基因△vasD、△impk、△impJ、△impF的突變株，并對其致病力表型進行了測定，發(fā)現(xiàn)突變株與野生型相比，在病情指數(shù)、定殖能力等方面均下降，生物膜形成受到影響，這表明T6SS對于西瓜噬酸菌的定殖傳播具有重要意義。

3.2 IV型菌毛

Ⅳ型菌毛是由菌毛蛋白組成可彎曲的絲狀物，長度為5～8 nm，在革蘭氏陰性及陽性菌中均有發(fā)現(xiàn)，普遍存在于細(xì)胞的一極或兩極，并調(diào)節(jié)細(xì)菌表面一種運動——顫動，這種運動不依賴于細(xì)菌鞭毛的存在可以獨立進行。林振亞等[21]研究表明，通過對7個西瓜嗜酸菌pilL菌毛基因的序列分析，Aac-5、pslbtw37和W1 pilL基因都存在一個類型為SPI的信號肽，其分泌蛋白所到達的亞細(xì)胞位點為s(即分泌到周質(zhì)空間)。王敏鑫等[22]研究表明，pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接參與Ⅳ型菌毛的合成，是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因，同時也進一步證明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛與其顫動性、致病性、游動性及生物膜形成能力相關(guān)。王健超等[23]研究表明，通過轉(zhuǎn)座子構(gòu)建突變體文庫，獲得pilN突變株，結(jié)果證明該基因功能主要與菌毛(pili)生物合成相關(guān)，其突變體相較于野生型的致病性、游動性、胞外纖維素酶活性降低，同時喪失煙草過敏性反應(yīng)。

3.3 群體感應(yīng)

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生理行為。具有群體感應(yīng)的細(xì)菌能產(chǎn)生并釋放一種或多種稱為自體誘導(dǎo)物（autoinducers，AI）的信號分子，它隨著細(xì)胞密度增加而同步增加。當(dāng)自體誘導(dǎo)物積累到一定濃度時會改變細(xì)菌特定基因的表達以調(diào)節(jié)菌體的群體行為。王鐵霖等[24]通過構(gòu)建瓜類果斑病菌luxR/luxI群體感應(yīng)系統(tǒng)功能基因突變體并對群體感應(yīng)信號的檢測，明確了luxI基因是自誘導(dǎo)物合成酶的基因，而luxR是合成信號受體的基因，且這2個基因可影響西瓜噬酸菌的致病力。

3.4 趨化性

細(xì)菌趨化性是指有運動能力的細(xì)菌對物質(zhì)化學(xué)濃度梯度作出的反應(yīng)，使細(xì)菌趨向有益刺激，逃避有害刺激。楊姍姍等[25]研究表明，通過測定碳源、氨基酸、有機酸等對西瓜噬酸菌趨化性的影響，證明麥芽糖、葡萄糖、L-亮氨酸、L-異亮氨酸等對西瓜噬酸菌的趨化性有促進作用，并通過構(gòu)建趨化基因cheA和cheY的突變體，發(fā)現(xiàn)這2個基因可影響西瓜噬酸菌的致病表型。

3.5 毒素-抗毒素系統(tǒng)

毒素-抗毒素（toxin–antitoxin，TA）系統(tǒng)常見于細(xì)菌和古細(xì)菌的質(zhì)粒和染色體上，可保護細(xì)菌免受毒素的破壞。Shavit等[26]研究表明，在西瓜噬酸菌中發(fā)現(xiàn)一個與TA同源的系統(tǒng)——vapB–vapC系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)氨基酸缺失和氯霉素可以誘導(dǎo)vapBC基因座轉(zhuǎn)錄而且VapB和VapC蛋白與脅迫響應(yīng)以及寄主病原互作有關(guān)。

3.6 基因組轉(zhuǎn)錄組分析

孫柏欣[27]研究表明，利用第二代測序技術(shù)對西瓜噬酸菌亞群I菌株pslb65和亞群II菌株pslbtw6進行基因組測序及組裝，研究發(fā)現(xiàn)pslb65菌株和I組測序菌株M6進化關(guān)系接近，可分于同一組。張艷艷等[28]對西瓜噬酸菌不同菌株與甜瓜幼苗早期互作的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行了研究，分析了2個西瓜噬酸菌菌株(pslb65和AAC00-1)分別誘導(dǎo)甜瓜感病‘IVF667’幼苗6 h和12 h后的基因表達譜，揭示了西瓜噬酸菌2個不同菌株與寄主互作在轉(zhuǎn)錄水平上的表達差異。

3.7 其他

王健超等[29]通過Tn5轉(zhuǎn)座子獲得了西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)營養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株致病性顯著下降，生長能力、游動性明顯降低，無法正常形成鞭毛和產(chǎn)生生物膜，通過外源添加VB6可恢復(fù)其致病性和生長能力等主要表型。Ren等[30]通過Tn5轉(zhuǎn)座子突變庫構(gòu)建了leuB基因缺失突變體菌株，并對其進行了基因功能研究，結(jié)果表明，突變體與野生型相比游動性、致病力下降，但突變體生物膜的形成未受到影響，且同樣可以引起非寄主的過敏性壞死反應(yīng)，說明亮氨酸的生物合成參與了西瓜噬酸菌的致病過程。劉星[31]研究表明，RND外排泵相關(guān)基因cusB的突變會影響西瓜噬酸菌的某些生物學(xué)特性，并導(dǎo)致病菌對銅十分敏感。李晶[32]對AAA ATPases基因相關(guān)的moxR和ruvB，董春玲[33]對色素基因fabG、aroE，王真[34]對RND多耐藥外排泵相關(guān)蛋白的編碼基因marC、nodT、hlyD、rpsL的致病性分別進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些基因均可對西瓜噬酸菌的致病力產(chǎn)生影響。

4 防控管理

西瓜噬酸菌是一種典型的種傳細(xì)菌性病害?，F(xiàn)階段尚未有較好的抗病種質(zhì)資源及特效的防治藥劑。目前，果斑病的防治主要集中在種子檢疫、抗病品種的選育、化學(xué)生物防治以及農(nóng)業(yè)措施管理方面。

李樂書等[35]研究發(fā)現(xiàn)，以芽孢桿菌（Bacillus sp.）TS8的發(fā)酵液為活性成分進行生物種衣劑的研制，溫室栽培試驗結(jié)果表明，西瓜和甜瓜幼苗細(xì)菌性果斑病的防病效果分別提高70.63%和80.59%。與此同時，近年來的研究發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)物質(zhì)和微量元素對于植株的抗性有增強的作用。Li等[36]研究表明，殼聚糖對西瓜噬酸菌具有良好的抗菌效果，使西瓜免受果斑病的危害，尤其是殼聚糖A在0.40 mg·mL-1質(zhì)量濃度下，對西瓜噬酸菌具有顯著的抑制作用。Ferreira等[37]通過研究各微量元素對瓜類細(xì)菌性果斑病的影響，發(fā)現(xiàn)施加硅元素可以增強西瓜植株的抗性，并提升植物組織對鈣和鎂的吸收。De Melo等[38]研究表明，從60個生防酵母菌株中篩選到 LMA1(Rhodotorula aurantiaca)、CC-2(Pichia anomala)和LMS(Rhodotorula glutinis)3株可以對種苗產(chǎn)生有效保護作用的菌種，這3個菌株可在病害發(fā)生的不同階段發(fā)揮防治效果，可根據(jù)具體情況綜合施用。Concei??o等[39]又將這3個菌和硅元素綜合使用，發(fā)現(xiàn)單獨噴施硅元素、生防酵母菌與混合后噴施效果基本無差異，都有一定的生防效果，所用生防酵母菌中LMA1優(yōu)于LMS。

同時，更多的具有生防潛力的菌株被篩選發(fā)現(xiàn)，給瓜類細(xì)菌性果斑病的防治提供了更多的途徑。Jiang等[40]通過研究從200個生防菌株中篩選出對果斑病有較高生防潛力的菌株Bacillus amyloliquefaciens，該菌株可有效控制瓜類細(xì)菌性果斑病防御相關(guān)基因PR1的表達，并促進植株的生長。孫柏欣等[27]通過研究，分離篩選出1株對西瓜噬酸菌有拮抗功能的生防菌株，經(jīng)鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，命名為JD001，通過室內(nèi)抑菌試驗驗證了其對西瓜噬酸菌有較好的抑制效果。Adhikari等[41]通過研究從根際細(xì)菌中分離到2株對瓜類細(xì)菌性果斑病具有較高抑制性的細(xì)菌Paenibacillus polymyxa(SN-22)、Sinomonas atrocyanea(NSB-27)，且對西瓜葉綠素含量、株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的提升均有刺激作用。

此外，在瓜類細(xì)菌性果斑病防治過程中，通常也會涉及抗病遺傳型的選擇。Francisco等[42]研究表明，遺傳型BGCIA979、BGCIA34和SugarBaby在植株生長的多數(shù)階段可以對瓜類細(xì)菌性果斑病表現(xiàn)出較高的抗性。

5 討論

目前，瓜類細(xì)菌性果斑病的研究主要集中在檢測鑒定以及相關(guān)致病力調(diào)控上，其研究在逐步深入，生物和化學(xué)防治的資源也在不斷擴大，未來應(yīng)用前景十分廣闊。但仍存在一些亟待解決的問題：（1）抗病品種的選育上，未能篩選培育出高抗病的商業(yè)化品種。（2）田間檢測手段還達不到便捷化、實用化，相關(guān)防治藥劑未能商業(yè)化。（3）對于瓜類的抗性機制方面研究不足且不系統(tǒng)，防治難度大。因此，應(yīng)加大對瓜類細(xì)菌性果斑病的研究，從選育抗病品種、轉(zhuǎn)基因育種、生產(chǎn)防治藥劑等多方面入手，對今后瓜類細(xì)菌性果斑病有效檢測及防治起到促進作用。

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Research advances of bacterial fruit blotch of cucurbits

CAI Fuyu1,2,GUAN Wei2,QIAO Pei2,YAN Jianpei2,YANG Yuwen2,ZHAO Tingchang1,2
(1.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan,China;2.State Key Laboratory of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

Bacterial fruit blotch of cucurbits（Acidovorax citrulli）(BFB)was a kind of quarantine bacteria which introduced into China in recent years.BFB mainly infects watermelon,melon and other crops,resulting in significant losses.In this paper,the pathogenesis,detection,identification,control management are reviewed.

Acidovorax citrulli；Detection；Identification；Pathogenesis；Control management

2017-09-07；

2017-10-19

北京市自然科學(xué)基金(6162023)；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25）；農(nóng)業(yè)部財政項目；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程

蔡馥宇，女，在讀本科生，研究方向為分子植物病理學(xué)。E-mail：caifuyu96@163.com

并列第一作者：關(guān) 巍，男，助理研究員，主要從事植物細(xì)菌性病害研究。E-mail：wyngwan@yahoo.com

趙廷昌，男，研究員，主要從事瓜菜細(xì)菌病害防控研究。E-mail：zhaotgcg@163.com