鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究*

彭智華，羅紹強

（肇慶市國有葵垌林場，廣東 廣寧526332）

鐵皮石斛（Dendrobium catenatum），又名黑節(jié)草、云南鐵皮，為蘭科石斛屬多年生附生草本藥用植物[1]。其主要分布在亞熱帶地區(qū)，而在我國主要分布于廣西壯族自治區(qū)西北部、云南省東南部、安徽省西南部、浙江省東部、福建省西部等地[2]。在道家醫(yī)學典籍《道藏》中，鐵皮石斛被列為“中華九大仙草”之首，并且在李時珍的《本草綱目》中也有記載[3]。鐵皮石斛內含有多種石斛堿、石斛多糖等[4]?，F代醫(yī)學研究發(fā)現,鐵皮石斛的藥用有效成分具有降低血糖、增強機體免疫力的作用[5]，并且具有良好的抗腫瘤、抗衰老作用[6]。但是鐵皮石斛對自然生長條件要求非常苛刻，需要與某些真菌共生，繁殖率極低，為此何春梅等[7]還針對菌根真菌對鐵皮石斛的共生專一性與促進作用進行研究。所以對鐵皮石斛進行組培快繁研究進而大量繁殖，是推動其產業(yè)發(fā)展、發(fā)揮其藥用價值的重要途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣東省林業(yè)科學研究院培育的鐵皮石斛3 a生健壯實生苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 從植株上剪取長度4～10 cm的中間莖段，用肥皂水輕輕擦洗，在流水下沖洗1 h。然后在超凈工作臺上用75%的酒精消毒1 min后進行外植體消毒試驗，不同消毒處理分別為：0.1%的HgCl2溶液消毒3、5、7、9 min和NaClO3溶液消毒5、10、15、20 min。再用無菌水沖洗4～5次，置于滅菌后的濾紙上吸干水分，將帶芽莖段剪成1.5 cm左右接種于基礎MS培養(yǎng)基上。每個處理30瓶，每瓶1莖段。

1.2.2 誘導培養(yǎng)基的篩選 試驗設置6種誘導培養(yǎng)基，分別為：

（1）MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（2）MS+6-BA0.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（3）MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（4）MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（5）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（6）MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

每個處理30瓶，每瓶接種3莖段。觀察記錄，30 d后統(tǒng)計外植體的生長狀況。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基的篩選 待新芽長成后，將其剪成1.5 cm左右?guī)а壳o段，轉接到繼代培養(yǎng)基中。試驗設置4種繼代培養(yǎng)基，分別為：

（1）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 香蕉提取液+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（2）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 香蕉提取液+ KT0.2 mg/L+5%水解酪蛋白500 mg/L+3%蔗糖

（3）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 馬鈴薯提取液+KT0.2 mg/L+3%蔗糖

（4）MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+5% 馬鈴薯提取液+KT0.2 mg/L+5%水解酪蛋白500 mg/L+3%蔗糖

其中香蕉提取液是取成熟香蕉去皮，加適量蒸餾水煮熟后，用4層紗布過濾后的汁液。馬鈴薯提取液是將馬鈴薯洗凈切片，加適量蒸餾水煮熟后，用4層紗布過濾后所形成的汁液。

每個處理30瓶，每瓶接種3莖段。觀察記錄，30 d后統(tǒng)計生長狀況。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選 選取高1.5 cm以上生長健壯的幼苗，接種于生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基設5種激素組合，分別為:

（1）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.3 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（2）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.5 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（3）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA0.7 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（4）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

（5）1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.5 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖

每個處理20瓶，每瓶接種3莖段，觀察記錄生根情況，50 d后統(tǒng)計生根率。

1.2.5 煉苗移栽 生根培養(yǎng)60 d后，將培養(yǎng)瓶移至溫室中煉苗1～3 d，挑取生根健壯的組培苗，用清水洗去根部附著的培養(yǎng)基，移栽入配比好的基質中，澆透水后用塑料覆蓋以保濕保溫，每日進行透氣，保持濕度。7 d后撤走覆蓋物，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑和消毒時間對鐵皮石斛嫩莖誘導影響

如表1所示，不同的消毒試劑以及消毒時間對外植體的誘導有著明顯的影響。用HgCl2處理的嫩莖隨著消毒時間的增加，污染數不斷減少，消毒9 min的嫩莖僅有2個污染，但是隨著消毒時間的增加，外植體的死亡數也不斷增加。結合污染率與死亡率可知，在用HgCl2消毒時，消毒5～7 min最適宜。用NaClO3處理的嫩莖污染數也隨著消毒時間的增加而減少，嫩莖死亡數增加，處理約15 min的污染率與死亡率最小。但是與HgCl2處理相比，用NaClO3處理的嫩莖污染率較高，死亡率較小。綜合考慮，用HgCl2試劑消毒5～7 min效果最好。

2.2 不同激素水平對鐵皮石斛嫩莖誘導的影響

從表2可以看出不同生長激素的配比對鐵皮石斛嫩莖的誘導有著明顯影響。在6-BA質量體積濃度為0.5 mg/L時，鐵皮石斛苗生長緩慢，并且芽較少，有的苗還產生了愈傷組織。隨著6-BA質量體積濃度的提高，芽多且小苗萌動加快，在所有的誘導培養(yǎng)基中，當6-BA質量體積濃度為1.5、NAA為0.5 mg/L時，芽最多并且小苗生長茁壯，誘導率達到了96%，再加上0.2 mg/L的KT，這個生長激素的配比最有利于芽的萌動和伸長。綜上所述，最適宜鐵皮石斛嫩莖誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖。

2.3 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛繼代增殖的影響

從表3可以看到，鐵皮石斛組培苗在添加5%香蕉提取液的培養(yǎng)基中長勢要好于添加5%馬鈴薯提取液的培養(yǎng)基。在添加5%馬鈴薯提取液的培養(yǎng)基中，小苗芽較少，長勢較弱，增值系數較低，并且伴隨有玻璃化的現象。而在添加5%香蕉提取液的培養(yǎng)基中加入5%的水解酪蛋白更有助于組培苗的增殖，增值系數達到8.0，并且小苗葉片舒展，生長健壯。所以，最適宜鐵皮石斛組培苗繼代的培養(yǎng)基是MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+5%香蕉提取液+5%水解酪蛋白+3%蔗糖。

2.4 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛的生根影響

在生根培養(yǎng)中，5種處理對鐵皮石斛的根誘導效果差異明顯。從表4中可以看出，隨著培養(yǎng)基中IBA質量體積濃度的提高，鐵皮石斛的生根率也提高，但是過高的IBA質量體積濃度又抑制了鐵皮石斛的生根。其中，在IBA質量體積濃度為1.0 mg/L時，鐵皮石斛的生根率最高，達到了97%，并且試管苗長勢良好，莖粗壯，主根又長又粗，最粗可達0.2 cm，側根多而壯。綜上所述，最適宜鐵皮石斛組培苗生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖。

表1 不同消毒試劑及消毒時間對鐵皮石斛嫩莖誘導的影響Tab.1 Effect of different disinfectant and disinfection time on the tender stems of Dendrobium catenatum

表2 不同激素水平對鐵皮石斛嫩莖誘導的影響Tab.2 Effect of different hormone levels on the induction of the tender stems of D. catenatum

表3 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛繼代增殖的影響Tab.3 Effects of different media on subculture proliferation of D. catenatum

表4 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛的生根影響Tab.4 Effect of different culture medium on rooting of D. catenatum

2.5 煉苗移栽

將煉好的苗移栽到溫室中，30 d之后統(tǒng)計的成活率高達90%以上，植株生長迅速，葉片舒展，生根速度快，莖段明顯健壯，為室外移栽的成活打下了良好的基礎。

3 結論與討論

3.1 試驗表明，鐵皮石斛外植體嫩莖用HgCl2試劑消毒5～7 min效果最好，最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+3%蔗糖，最佳繼代培養(yǎng)基是MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+KT0.2 mg/L+5%香蕉提取液+5%水解酪蛋白+3%蔗糖（增殖系數達8.0），最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.1 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%香蕉提取液+2%蔗糖（生根率達97%），煉苗后移栽成活率高達90%以上。

3.2 本實驗在培養(yǎng)基中加入了香蕉提取液、馬鈴薯提取液以及水解酪蛋白等，前人在研究中也曾嘗試加入不同的天然提取液，得到的結果也大不相同。張明等[8]和羅萬業(yè)等[9]認為椰子汁對鐵皮石斛的增殖效果最好，而蔣林等[10]和張華通等[11]認為蘋果汁和香蕉汁更能促進試管苗根的生長。本實驗研究發(fā)現，5%香蕉提取液加上5%的水解酪蛋白更有助于鐵皮石斛苗的增殖。

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