APP695K595N/M596L突變轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和病理表型動態(tài)分析

王冬梅，李萬波，袁樹民，全雄志，張海濤，馬春梅，曹興水，張連峰

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在人體多種組織中均有表達，研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下的APP參與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷后修復與再生、突觸發(fā)生和學習記憶能力等，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的生理作用［1］。而發(fā)生突變的APP與家族性阿爾茨海默癥（Alzheimer＇s disease，AD）關(guān)系密切，突變的APP通過淀粉樣加工途徑產(chǎn)生過多的Aβ，而Aβ也是AD中老年斑的主要成份。本文通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人的APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠體內(nèi)，構(gòu)建了神經(jīng)特異性表達人APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過行為學及神經(jīng)病理學方法對該動物模型進行評價。

1 材料和方法

1.1 APP表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

本文所研究的PrP-hAPP695K595N/M596L突變轉(zhuǎn)基因動物模型由本所遺傳中心構(gòu)建，利用點突變方法使人APP695cDNA在596堿基和597堿基兩個位點產(chǎn)生G-C和A-C的突變，編碼氨基酸由賴氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺，蛋氨酸突變?yōu)榱涟彼?，稱為瑞士突變。把APP基因克隆到小鼠阮蛋白啟動子（PrP）的下游構(gòu)建APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因表達載體。轉(zhuǎn)基因載體用Xba I線性化（寶生物工程有限公司），調(diào)整濃度至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SCXK京2009-0007），用ICR小鼠作假孕體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（GC-07-2055）。

1.2 PCR鑒定APP轉(zhuǎn)基因動物的基因表型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，用PCR檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR上游引物為5’-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3’，下游引物為5’-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3’（上海生物工程技術(shù)有限公司），PCR試劑購自寶生物工程有限公司。PCR反應條件：94℃預變性5 m in，94℃變性30 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)。hAPP片段為344 bp。

1.3 Westernblotting鑒定APP基因在蛋白水平的表達

選用1月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，迅速取出腦組織置勻漿器中，加入1 m L的RIPA蛋白裂解液（碧云天公司），蛋白濃度通過BCA法測定（Pierce公司Pierce BCA Kit試劑盒），取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素NC膜上。膜先用5％脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入羊抗hAPP蛋白抗體（1：500稀釋，Santa Crutz），4℃雜交過夜。將膜轉(zhuǎn)移到HRP標記的兔抗山羊抗體（1∶15 000，Pierce Biotechnology）中，室溫雜交1 h。將膜置于化學發(fā)光液中，曝光、顯影及定影。

1.4 APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠模型的病理學動態(tài)觀察

選用5、7、9、11、12月齡APP695K595N/M596L小鼠及同月齡野生小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，取腦后用中性甲醛溶液固定24 h，取材、脫水、包埋、切片、thioflavin-S（購自美國Sigma公司）熒光檢測老年斑情況，光學顯微鏡（Nikon，日本）及熒光顯微鏡觀察（Olympus，日本）。

1.5 Morris水迷宮檢測APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學變化

選用5、7、9、11月齡APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因陽性小鼠每組10只及同月齡的野生型C57/6J小鼠每組10只，利用Morris水迷宮進行小鼠行為學分析（Ethovision XT監(jiān)測分析軟件，Morris水迷宮系統(tǒng)，Noldus公司，荷蘭）。水迷宮實驗過程分為連續(xù)5天的隱藏平臺獲得實驗和第6天的空間探索實驗兩部分。每天訓練4次，每次使小鼠在不同區(qū)域下水，水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區(qū)域，平臺即第五區(qū)域，位于第4區(qū)域內(nèi)。每次游泳時間為60 s，每次訓練間隔1 h左右。小鼠沒有找到平臺的按60 s計算潛伏期。平臺隱藏獲得實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力。

1.6 統(tǒng)計學方法

利用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，平臺隱藏獲得實驗中的逃避潛伏期采用多重測量的方差分析學習試驗；空間探索實驗中的各象限的游泳時間和穿越目標次數(shù)采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差，差異顯著水平設(shè)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 APP表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

將人APP695K595N/M596L突變基因插入小鼠阮蛋白啟動子（mouse prion protein）的下游，構(gòu)建APP轉(zhuǎn)基因載體（圖1A）。顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠（圖1B）。

2.2 Westernblotting檢測APP基因在蛋白水平的表達

A： APP695K595N/M 596L轉(zhuǎn)基因表達載體；B：轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定。注：1：空白對照；2：陰性對照；3：陽性對照； 4：DNA分子標記DL2000；5-17：轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA樣品。圖1 APP695K595N/M 596L基因表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定圖A：APP695K595N/M596L transgenic expression construct； B：PCR genotyping of APP695K595N/M 596L transgenic mice Note：1：Blank control；2：Negative control； 3：Positive control；4：DL2000 DNA marker； 5-17：Genomic DNA samples from transgenic mice.Fig.1 APP695K595N/M596L transgenic expressionconstruct and PCR genotyping of APP695K595N/M596L transgenic mice

分別提取首建鼠F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠的腦組織總蛋白，進行Western blotting分析，結(jié)果顯示7號轉(zhuǎn)基因陽性小鼠腦腦組織中人APP蛋白表達量明顯高于同齡陰性對照小鼠（圖2），選取該品系的小鼠用于繁殖并進行病理學和行為學分析。

注：WT：同窩陰性對照小鼠； F07：轉(zhuǎn)基因陽性品系；GAPDH：內(nèi)參圖2 人APP蛋白在APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達Note：WT：The wild type mouse；F07：The transgenic line； GAPDH：Loading normalization.Fig.2 Expression of human APP695K595N/M596L in the brain tissues of trangenic mice

2.3 病理學檢驗

Thioflavin-S熒光結(jié)果均顯示5月、7月齡動物海馬區(qū)均未檢測到明顯老年斑出現(xiàn)，9月齡時轉(zhuǎn)基因陽性小鼠在海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑，11月，12月呈年齡依賴性增多（圖3見彩插2）。

2.4 行為學結(jié)果

經(jīng)過檢驗前5 d學習有效，所有小鼠都能較快的找到平臺。隨后第6天撤出平臺，進行空間探索實驗。Ethovision XT監(jiān)監(jiān)測分析軟件記錄小鼠在目標區(qū)域（即第4從5區(qū)）的穿梭次數(shù)和停留時間。Morris水迷宮試驗發(fā)現(xiàn)5月、7月、9月、11月齡轉(zhuǎn)基因小鼠空間探索實驗結(jié)果與同月齡野生型小鼠相比有顯著差異，較同月齡野生型C57BL/6J小鼠學習及記憶能力降低（P＜0.05）（圖4～5）。

3 討論

全球預計有3 700萬癡呆癥患者，阿爾茨海默病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，疾病早期出現(xiàn)軸突病變（軸突腫脹，軸突運輸障礙）以及突觸功能缺陷，晚期臨床表現(xiàn)為進行性記憶減退和認知障礙，主要神經(jīng)病理特征是大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)細胞喪失，細胞外存在大量由淀粉樣蛋白組成的老年斑（senile plaques，sp）、神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，nfts）以及皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性［2］。在家族性A D家系中最早發(fā)現(xiàn)的突變基因是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein），其后發(fā)現(xiàn)的突變基因還包括早老素（presenilin），轉(zhuǎn)脂蛋白（apoe），tau蛋白等。

A：5月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；B：7月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；C：9月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；D：11月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期比較；E：5-11月齡野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠第4天尋找隱藏平臺的潛伏期差值比較。* P＜0.05圖4 不同年齡小鼠水迷宮實驗分析A：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 5-month old age；B：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 7-month old age；C：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at 9-month old age；D：Comparison of escape latency between transgenic and controlmice at11-month old age；E：Comparison of average value of the 4th day escape latency between transgenic and controlmice at 5-11-month old ages.* P＜0.05Fig.4 Determination of escape latency in hidden platform acquisition training of the mice at different ages

目前在家族性A D病人中已鑒別出多個A P P基因的突變位點，這些突變使得APP代謝途徑發(fā)生異常改變，是家族性A D的主要病因。本文所研究的瑞士突變帶來的蛋白構(gòu)象變化使A P P蛋白更容易被β-分泌酶切割，導致其通過淀粉樣代謝途徑生成的Aβ增多，增多的Aβ異常聚集，形成老年斑，進而影響認知行為。

神經(jīng)特異性啟動子通常在進行神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療和神經(jīng)生物學研究方面具有非常重要的意義［3］。其中，小鼠朊蛋白（mouse prion protein，PrP），人血小板源性生長因子（p latelet-derived grow th factor，PDGF），鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶IIα（calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα，CaMKIIα），小鼠甲狀腺素-1（thyroxine-1，Thy-1）是研究者經(jīng)常使用的神經(jīng)組織特異啟動子。Thy-1和CaMKIIα啟動子能夠使下游目的基因在海馬、胼胝體、前皮層神經(jīng)元內(nèi)特異性高表達［4，5］，而PDGF和PrP啟動子可以使目的基因在小腦、大腦、脊索的神經(jīng)元廣泛高表達［6，7］。PrP啟動子更為突出的優(yōu)點是在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中也具有活性，而其余3個啟動子不具有這樣的功能［6-7］。所以我們選擇PrP啟動子，在其下游插入突變的APP基因建立阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease，AD）動物模型。

圖5 Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果比較A：Comparison of target zone duration between 5-11-month old transgenic and controlmice；B：Comparison of target zonefrequency between 5-11-month old transgenicand controlmice.*P＜0.05Fig.5 Results of 6th day probe trial testing by Morris watermaze

在9月齡時，該轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑，11月，12月呈年齡依賴性增多，這和hsiao等［7］報道的結(jié)果相一致。Morris水迷宮結(jié)果顯示5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同月齡野生小鼠有差異，說明5月齡轉(zhuǎn)基因小鼠在出現(xiàn)明顯老年斑之前就出現(xiàn)了學習記憶能力障礙。與此相一致，臨床上AD患者神經(jīng)病理學改變之前，就會出現(xiàn)輕度的認知障礙［8］。研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)元功能活動調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源性Aβ可能是正常機體對神經(jīng)元持續(xù)興奮的反應，通過從對神經(jīng)元興奮性的負反饋調(diào)節(jié)，控制神經(jīng)元興奮毒性的發(fā)生［9，10］。而當可溶性的Aβ過多，聚集成的Aβ寡聚體，能夠破壞海馬腦片及動物的長時程增強效應（long-term potentiation，LTP），降低海馬的樹突棘密度；干擾與記憶相關(guān)的即刻早期基因的表達；通過破壞神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導，引起神經(jīng)元功能障礙、變性、死亡，直接影響大腦學習記憶［11-13］。Morris水迷宮尋找平臺隱藏實驗中第3天是檢測小鼠學習記憶能力是否存在差異的關(guān)鍵時間點，本實驗中發(fā)現(xiàn)11月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，在第4天仍然存在差異，說明轉(zhuǎn)基因體小鼠學習記憶能力呈現(xiàn)漸進性加重。

綜上，本文報道的PrP-APP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠在5月齡開始出現(xiàn)學習記憶能力缺陷和漸進性加重。在9月齡出現(xiàn)老年斑并呈年齡依賴性增多。該轉(zhuǎn)基因小鼠的病理表型可以再現(xiàn)人類AD患者的漸進性病理表型，是具有應用價值的阿爾茨海默病小鼠轉(zhuǎn)基因動物模型。PrP-hAPP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠與PDGF-hAPP770V717I、PDGF-hAPP695V642I/K595N/M596L［14］、PDGF-hAPP695K595N/M596L轉(zhuǎn)基因小鼠相比，由于PrP啟動子在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中也具有活性，使得該轉(zhuǎn)基因小鼠可用于阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥機制方面的研究，具有更廣泛的用途。

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