摻鉭羥基磷灰石涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附和增殖的影響*

路榮建 賀慧霞 鄂玲玲 張桂蘭 寧成云 劉洪臣

鈦及其合金是臨床最常用的牙種植體材料，具有良好的機(jī)械性能和生物相容性。羥基磷灰石憑借較強(qiáng)的生物活性和骨誘導(dǎo)能力，被廣泛用作人骨組織替代材料。羥基磷灰石涂層可有效改善鈦的生物惰性，提高種植體的骨結(jié)合性能力。但是羥基磷灰石機(jī)械性能差，且與鈦基體的結(jié)合力不足，易崩解脫落而影響涂層種植體的遠(yuǎn)期固位效果，最終導(dǎo)致種植體失敗[1]。為此，研究者們致力于改進(jìn)涂層方法和制備工藝，以提高羥基磷灰石涂層種植體的力學(xué)性能。在羥基磷灰石涂層中摻雜無(wú)機(jī)元素是種植體材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明摻鍶(Sr)[2]、鋅(Zn)[3]、鎂(Mg)[4]等均能夠降低羥基磷灰石涂層的脆性，還可提高涂層-基體的結(jié)合強(qiáng)度。多孔鉭因其優(yōu)良的力學(xué)和生物學(xué)相容性在關(guān)節(jié)外科取得了理想的臨床療效，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，鉭作為金屬植入體的涂層材料引起研究者廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于摻鉭羥基磷灰石涂層的研究鮮有報(bào)道。本研究利用大氣等離子噴涂技術(shù)在純鈦表面制備摻鉭羥基磷灰石復(fù)合涂層，體外研究表面特征，并評(píng)價(jià)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附、鋪展、增殖等生物學(xué)行為的影響，為新型種植體涂層材料的研制和應(yīng)用提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 鉭粉(東方鉭業(yè)股份有限公司,99.9%,粒徑35-75μm)，羥基磷灰石粉(仁邦生物科技有限公司,99.9%,粒徑35-75μm)，圓形純鈦片(北京富樂(lè)科技有限公司)，掃描電鏡(FEI,荷蘭)，大氣等離子噴涂機(jī)(Chemplex,美國(guó))，X射線衍射儀(Shimadzu,日本)，表面輪廓儀(Breitmeier,德國(guó))，萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(Instron,美國(guó))，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Tek,美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó))，激光共聚焦顯微鏡(LSM,德國(guó))，MTS試劑盒(Promega,美國(guó))，Hochest(Sigma, 美國(guó))。

1.2 材料制備及表征 圓形鈦片(直徑10mm，厚1mm)經(jīng)丙酮、乙醇和去離子水超聲清洗，0.8MPa下Al2O3噴砂處理后作為基體。將Ta和HA混粉球磨4小時(shí)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分。等離子噴涂機(jī)內(nèi)將混粉熔融、噴涂至鈦基體表面，制備摻鉭羥基磷灰石涂層。在課題組研究基礎(chǔ)上[5]優(yōu)化參數(shù)，噴涂功率設(shè)為30KW，送粉速率為14g/min，距離為110mm，以氬氣和氦氣作為保護(hù)氣體。

按鉭和羥基磷灰石不同質(zhì)量比分為：Ta∶HA=8∶2(a 組)，Ta∶HA=6∶4(b 組)，100%HA(c組)，純鈦?zhàn)鳛閷?duì)照(d組)。利用掃描電鏡SEM、X線衍射儀、表面粗糙度儀和接觸角測(cè)試儀分別檢測(cè)試樣的表面形貌、物相組成、粗糙度和表面接觸角。

1.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)分離、培養(yǎng)及鑒定 全骨髓貼壁法獲取rBMSCs：2周齡SD大鼠脫頸處死，分離四肢骨，剝離附著軟組織，切除兩端骨骺。在盛有L-DMEM培養(yǎng)基(含雙抗及20%胎牛血清)的培養(yǎng)皿內(nèi)，用1ml注射器(25號(hào)針頭)吸取培養(yǎng)液快速反復(fù)沖洗骨髓腔，至髓腔發(fā)白。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2的溫箱內(nèi)孵育，每隔2-3d全換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)(10天左右)，用0.25%胰酶按1∶2消化傳代，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種培養(yǎng)瓶。取第3代細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。

1.4 細(xì)胞粘附能力檢測(cè) 試樣經(jīng)60Co照射消毒后，置于24孔板。取第4代rBMSCs(2×104個(gè)/ml)接種于試樣表面，每孔1ml培養(yǎng)基。溫箱內(nèi)分別孵育60、120和180min后，吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次去除未粘附細(xì)胞。利用4%多聚甲醛原位固定20分鐘后，hochest33342染色細(xì)胞核。熒光顯微鏡下，每個(gè)試樣隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Pro Plus6.0軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 將第4代細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/孔)接種于各組試樣表面，溫箱內(nèi)培養(yǎng)1d后，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。PBS漂洗3次，2.5%戊二醛固定過(guò)夜。梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后觀察。

1.6 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 將試樣置于24孔板，每組各9枚。取第4代細(xì)胞(2×104個(gè)/ml)接種于試樣表面，每孔1ml培養(yǎng)基。共培養(yǎng)1、3和5d后檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。每組各取3孔，吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次后置于新的24孔板。每孔加入1ml培養(yǎng)基和預(yù)溫的200μlMTS，于孵箱內(nèi)孵育4小時(shí)，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有定量數(shù)據(jù)測(cè)量3次取平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)各組間差異，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 摻鉭羥基磷灰石涂層的表征 掃描電鏡觀察摻鉭羥基磷灰石涂層表面形貌(圖1)，低倍鏡下(500×)涂層表面明顯粗糙不平，由不規(guī)則的顆粒堆疊形成大量孔隙。隨著鉭比例的增加，涂層粗糙程度越高。高倍鏡下(2500×)觀察，熔融和半熔融顆粒相互連接構(gòu)成不規(guī)則的淺碟形坑或孔隙，直徑為20-110μm。摻鉭羥基磷灰石涂層致密均勻，與基體緊密結(jié)合，厚度為100-120μm。

圖1 涂層試樣表面形貌SEM圖

不同摻鉭比例的復(fù)合涂層的XRD圖譜(圖2)顯示，摻鉭羥基磷灰石涂層表面衍射峰主要為Ta和HA，以及少量Ta2O5、TaO2和Ca3(PO4)2非晶相。在大氣等離子噴涂過(guò)程中，Ta會(huì)被空氣中的氧化生成TaO2，后者在基體表面又被進(jìn)一步氧化成Ta2O5。Ca3(PO4)2則是HA在噴涂過(guò)程中分解產(chǎn)生。隨著摻鉭質(zhì)量比上升，復(fù)合涂層的Ta衍射峰逐漸增強(qiáng)，而HA和Ca3(PO4)2的衍射峰越來(lái)越弱。

圖2 摻鉭羥基磷灰石涂層涂層的X線衍射圖譜

表面粗糙度儀分析摻鉭羥基磷灰石涂層的粗糙度結(jié)果如圖3所示，復(fù)合涂層的粗糙程度明顯高于光滑鈦和羥基磷灰石涂層，隨著Ta混合比的增加，涂層的粗糙度呈增大趨勢(shì)。

圖3 表面粗糙度儀分析試樣粗糙度

接觸角分析儀測(cè)定去離子水(親水性)和二碘甲烷(親油性)在試件表面接觸角，計(jì)算其表面能。由表1可知，摻鉭羥基磷灰石涂層接觸角最小，表面能最大，純鈦表面能最小。各試件的接觸角隨鉭含量的增加而遞增，純鈦表面能最小。相比較純鈦，摻鉭羥基磷灰石涂層親水性更佳。

表1 摻鉭HA涂層、HA涂層和純鈦的表面接觸角和表面能

2.2 摻鉭羥基磷灰石涂層與鈦的結(jié)合強(qiáng)度測(cè)定涂層斷裂時(shí)作為涂層的結(jié)合強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)圖4，各涂層與鈦基體結(jié)合強(qiáng)度均良好，摻鉭羥基磷灰石涂層結(jié)合強(qiáng)度最大，達(dá)到30MPa，高出羥基磷灰石涂層(20MPa)約1.5倍。不同摻鉭比的復(fù)合涂層組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

圖4 摻鉭HA涂層、HA涂層與基體的結(jié)合強(qiáng)度，對(duì)比HA涂層 ＊P＜0.05

2.3 rBMSCs的培養(yǎng)和鑒定 第3代rBMSCs流式分子鑒定(圖5)顯示，CD90、CD29呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34和CD45的表達(dá)為陰性，符合BMSCs分子表型。根據(jù)分子表型鑒定結(jié)果，全骨髓培養(yǎng)法分離的原代rBMSCs符合干細(xì)胞生物學(xué)特性，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(第3代)表面分子表型

2.4 rBMSCs在試樣表面的粘附 rBMSCs與試件共孵育60、120和180min后，熒光顯微鏡觀察染色胞核以計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞(圖6和圖7)發(fā)現(xiàn)，各材料粘附細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增，涂層表面增加更明顯。不同檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，涂層試樣表面的粘附細(xì)胞均顯著多于純鈦。摻鉭羥基磷灰石復(fù)合涂層粘附細(xì)胞能力強(qiáng)于單一羥基磷灰石涂層，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 培養(yǎng)120min后材料粘附rBMSCs的熒光顯示圖

圖7 培養(yǎng)60、12和180min各材料表面粘附細(xì)胞數(shù)，對(duì)比純鈦 ＊P＜0.05

2.5 rBMSCs在試樣表面的形態(tài) 培養(yǎng)24小時(shí)后，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖8)，低倍鏡下見(jiàn)純鈦表面細(xì)胞呈類圓形，涂層組細(xì)胞呈條索狀貼附于材料表面。高倍鏡觀察(5000×)，純鈦組細(xì)胞伸展不足，偶見(jiàn)短而小的偽足。涂層表面細(xì)胞呈扁平狀密集分布，呈多角形或長(zhǎng)梭形，與材料接觸面積更大。且伸出大量偽足，粗大的板狀偽足牢固地附于涂層表面的孔隙中，偽足之間相互交織連接，復(fù)合涂層組尤為明顯。

圖8 培養(yǎng)24h后，試樣表面細(xì)胞形態(tài)的SEM圖

2.6 rBMSCs在試樣表面的增殖活性 材料表面細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果，如圖9所示，各組試樣表面細(xì)胞增殖活力呈時(shí)間依賴關(guān)系。第1d時(shí)，羥基磷灰石涂層及復(fù)合涂層表面細(xì)胞活性高于純鈦組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第3d開(kāi)始，涂層組細(xì)胞活力均顯著高于純鈦組，各涂層組之間無(wú)明顯差別。第5天時(shí)，各組試樣表面細(xì)胞活性均達(dá)到最高值。

圖9 培養(yǎng)1、3和5d后，MTS法檢測(cè)試樣表面細(xì)胞的增殖活性，對(duì)比純鈦 ＊P＜0.05

3.討論

隨著種植牙技術(shù)的日趨成熟，人工種植牙已成為牙齒缺失的的首選修復(fù)方式。它能夠恢復(fù)90%以上的咀嚼率，最大程度改善缺牙患者的生活質(zhì)量。種植體與牙槽骨快速且穩(wěn)固的骨結(jié)合是種植修復(fù)成功的前提，其受頜骨質(zhì)骨量、種植體材料和外形設(shè)計(jì)等因素的影響[6]。理想的種植體材料應(yīng)具有良好的生物相容性、機(jī)械性能以及骨整合性。鈦及其合金是目前應(yīng)用最廣泛牙種植生物材料,而其缺乏生物活性，骨整合率低，難以與骨組織形成強(qiáng)有力的化學(xué)結(jié)合，影響了種植修復(fù)的臨床成功率[7]。

羥基磷灰石類似人骨組織的無(wú)機(jī)成分，可引導(dǎo)周圍骨與植入體形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵合[8]。在鈦及合金表面構(gòu)建羥基磷灰石涂層，結(jié)合了金屬材料良好的力學(xué)性能和生物陶瓷的骨結(jié)合能力，是提高種植體臨床成功率的有效途徑。研究表明羥基磷灰石涂層種植體能夠刺激骨的再生，顯著增強(qiáng)了其中、短期固位效果[9]。但羥基磷灰石脆性大，且與基體結(jié)合強(qiáng)度弱,遠(yuǎn)期臨床療效差。學(xué)者們致力于改進(jìn)涂層技術(shù)來(lái)改善涂層種植體的力學(xué)性能，但效果并不理想。

羥基磷灰石涂層與金屬基體結(jié)合強(qiáng)度低，主要由于其熱膨脹系數(shù)不匹配以及熱穩(wěn)定性差[10]。為了緩和兩者熱膨脹系數(shù)失配的現(xiàn)象，通常在其中摻雜熱膨脹系數(shù)小于基體的無(wú)機(jī)材料，或改變熱處理方式以降低熱失配導(dǎo)致的界面殘余應(yīng)力，從而提高涂層與鈦基體的結(jié)合力。Cho[11]等研究發(fā)現(xiàn)摻鋯羥基磷灰石涂層的機(jī)械強(qiáng)度及其與鈦基體的結(jié)合力有所提高。Li等[12]將摻鍶羥基磷灰石復(fù)合涂層種植體植入去勢(shì)大鼠脛骨內(nèi)，發(fā)現(xiàn)種植體的骨結(jié)合速度及強(qiáng)度均有明顯提高。另有研究[13,14]證實(shí)，摻雜硅和鋅能夠降低HA晶體的溶解速率，而增強(qiáng)羥基磷灰石涂層骨植入材料的遠(yuǎn)期固位效果。

鉭以親生物性著稱，是一種理想的生物醫(yī)用材料。特別是多孔鉭在關(guān)節(jié)外科領(lǐng)域取得了顯著的臨床療效，被視為可替代鈦的新一代生物金屬材料[15]。然而鉭成本高，加工技術(shù)難度大等弊端，限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。隨著加工技術(shù)的發(fā)展，鉭作為種植體的表面涂層材料，逐漸引起研究者們的關(guān)注。Balla[16]等采用激光熔覆技術(shù)在純鈦表面制備的多孔鉭涂層，研究發(fā)現(xiàn)多孔鉭的表面能和親水性較好，有利于成骨細(xì)胞的黏附和增生長(zhǎng)，從而改善了鈦的骨整合性。鉭的熱膨脹系數(shù)低于羥基磷灰石及純鈦，作為添加劑可降低熱膨脹系數(shù)失配導(dǎo)致的界面殘余應(yīng)力，從而增強(qiáng)HA涂層與純鈦基體的結(jié)合強(qiáng)度[17]。

我們采用大氣等離子噴涂技術(shù)，在純鈦表面制備了多孔隙的鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層。發(fā)現(xiàn)復(fù)合涂層致密均勻，其粗糙度與鉭的混合比呈正相關(guān)，這由于鉭和羥基磷灰石不同的熔點(diǎn)導(dǎo)致。鉭的熔點(diǎn)遠(yuǎn)高于HA，在相同的噴涂功率下，未完全熔融的Ta連同幾乎完全融化的羥基磷灰石，被高速噴射到純鈦基體表面。復(fù)合涂層的粗糙度高于HA涂層，親水性優(yōu)于鉭涂層，而結(jié)合強(qiáng)度較HA涂層有了明顯提高。鉭的熱膨脹系數(shù)為(6.5×10-6/K)，小于鈦(8-9×10-6/K)以及羥基磷灰石的(13.6-15×10-6/K)，緩解了羥基磷灰石和鈦熱膨脹系數(shù)的急劇變化，使涂層/基體界面的殘余應(yīng)力降低，復(fù)合涂層與鈦的結(jié)合強(qiáng)度得到了顯著提高。另外，鉭、羥基磷灰石和鈦在高溫下的化學(xué)結(jié)合，也可能提升復(fù)合涂層/基體的界面結(jié)合力。

細(xì)胞在種植體表面的生物學(xué)行為受表面形貌、粗糙度、親水性以及表面能的影響[18]。種植體與骨的整合始于骨祖細(xì)胞的早期粘附、叢集，是胞外基質(zhì)和粘附因子通過(guò)信號(hào)通路介導(dǎo)的復(fù)雜程序[19]。多孔隙結(jié)構(gòu)類似天然骨，有利于骨組織的修復(fù)再生[20]。Cipriano[21]等認(rèn)為微米孔隙有利于成骨細(xì)胞在種植體表面的粘附。學(xué)者[22]在鈦表面制備多孔隙結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞粘附，有利于種植體的骨結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)復(fù)合涂層粘附BMSCs的能力明顯強(qiáng)于純鈦，與羥基磷灰石涂層涂層的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。這可能由于多孔復(fù)合涂層更容易吸附蛋白，如纖連蛋白和玻連蛋白等促細(xì)胞粘附因子[23]。相關(guān)的研究及其機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。此外，摻鉭羥基磷灰石涂層較高的細(xì)胞粘附能力還與其良好親水性有關(guān)。

細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞功能密切相關(guān)，據(jù)報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞的伸展程度與其分化能力呈正[24]。微絲是細(xì)胞骨架的重要組成部分，其主要成分是肌動(dòng)蛋白，與維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞黏附有關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)中摻鉭羥基磷灰石涂層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞充分伸展，并且伸出粗壯的偽足,細(xì)胞骨架排列有序，微絲致密粗大，說(shuō)明細(xì)胞在復(fù)合涂層表面的粘附力強(qiáng)。

細(xì)胞增殖是基本生理活動(dòng)，粗糙表面有利于成骨細(xì)胞的增殖及胞外基質(zhì)蛋白表。Teixeira[26]等發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在大孔隙(312μm)表面的增殖活性高于較小孔隙(62μm)。學(xué)者們認(rèn)為納米及微納結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的鋪展和增殖[27]。本研究中，rBMSCs在摻鉭羥基磷灰石涂層的增殖能力明顯強(qiáng)于純鈦，這與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[28]。細(xì)胞增殖活力隨時(shí)間而逐漸增強(qiáng)，Ta8HA2組變化尤為明顯?？傮w來(lái)說(shuō)，摻鉭羥基磷灰石復(fù)合涂層促進(jìn)rBMSCs的增殖活性。

4.結(jié)論

摻鉭羥基磷灰石復(fù)合涂層均勻致密，具有較高的粗糙度和親水性。相比羥基磷灰石涂層，其與鈦的結(jié)合強(qiáng)度顯著提高，改善羥基磷灰石涂層的機(jī)械性能。體外實(shí)驗(yàn)表明，摻鉭羥基磷灰石復(fù)合涂層能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖活性，具有良好的細(xì)胞相容性。

[1] Lazarinis S,K?rrholm J,Hailer NP.Effects of hydroxyapatite coating of cups used in hip revision arthroplasty[J].Acta Orthop,2012,83:427-435

[2] Krishnan V,Bhatia A,Varma H.Development,characterization and comparison of two strontium doped nano hydroxyapatite molecules for enamel repair/regeneration[J].Dent Mater,2016,32(5):646-659

[3] Tao ZS,Zhou WS,He XW,et al.A comparative study of zinc,magnesium,strontium-incorporated hydroxyapatite-coated titanium implants for osseointegration of osteopenic rats[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2016,62:226-232

[4] Caneva M,Botticelli D,Stellini E,et al.Magnesium-enriched hydroxyapatite at immediate implants:a histomorphometric study in dogs[J].Clin Oral Implants Res,2011,22(5):512-517

[5]李 英，魯 放，寧成云，等.鈦基微納多級(jí)結(jié)構(gòu)鉭涂層的構(gòu)建及其表面特征研究[J].稀有金屬材料與工程,2016,45(8):2020-2025

[6] Frandsen CJ,Brammer KS,Noh K,et al.Tantalum coating on TiO2nanotubes induces superior rate of matrix mineralization and osteofunctionality in human osteoblasts[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2014,37:332-341

[7] Chrcanovic BR,Albrektsson T,Wennerberg A.Immediate nonfunctional versus immediate functional loading and dental implant failure rates:a systematic review and meta-analysis[J].J Dent,2014,42(9):1052-1059

[8] Geetha M,Singh AK,Asokamani R,et al.Ti based biomaterials,the ultimate choice for orthopaedic implants-a review[J].Prog.Mater.Sci,2009,54:397-425

[9] Shadanbaz S,Dias GJ.Calcium Phosphate Coatings on Magnesium Alloys for Biomedical Applications:a review[J].Acta Biomater,2012,8:20-30

[10]Luis Calvo J,Satorres M,Aguilar A,et al.Influence of surface treatment on osseointegration of dental implants:histological,histomorphometric and radiological analysis in vivo[J].Clin Oral Investig,2015,19(2):509-517

[11]Cho Y,Hong J,Ryoo H,et al.Osteogenic responses to zirconia with hydroxyapatite coating by aerosol deposition[J].J Dent Res.2015 Mar,94(3):491-499

[12]Li Y1,Li Q,Zhu S,et al.The effect of strontium-substituted hydroxyapatite coating on implant fixation in ovariectomized rats[J].Biomaterials.2010,31(34):9006-9014

[13]Bohner M.Silicon-substituted calcium phosphates-a critical view[J].Biomaterials,2009,30(32):6403-6406

[14]Bhowmick A,Banerjee SL,Pramanik N,et al.Organically modified clay supported chitosan/hydroxyapatite-zinc oxide nanocomposites with enhanced mechanical and biological properties for the application in bone tissue engineering[J].Int J Biol Macromol,2018,106:11-19

[15]Liu GH,Wang J,Yang SH,et al.Effect of a Porous Tantalum Rod on Early and Intermediate stages of Necrosis of the Femoral Head[J].Biomed.Mater,2010,5(6):065003

[16]Balla VK,Banerjee S,Bose S,et al.Direct laser processing of a tantalum coating on titanium for bone replacement structures[J].Acta Biomater,2010,6(6):2329-2334

[17]Cetin?rgü E,Baloukas B,Zabeida O,et al.Mechanical and thermoelastic characteristics of optical thin films deposited by dual ion beam sputtering[J].Appl Opt,2009,48(23):4536-4544

[18]Dohan Ehrenfest DM,Coelho PG,Kang BS,et al.Classification of osseointegrated implant surfaces:materials,chemistry and topography[J].Trends Biotechnol,2010,28:198-206

[19]Schwartz MA.Integrins and extracellular matrix in mechanotransduction[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2:a005066

[20]Stevens MM,George JH.Exploring and Engineering the cell surface interface[J].Science,2005,310:1135-1138

[21]Cipriano AF,De Howitt N,Gott SC,et al.Bone marrow stromal cell adhesion and morphology on micro-and sub-micropatterned titanium[J].J Biomed Nanotechnol,2014,10(4):660-668

[22]Hu J,Hardy C,Chen CM,et al.Enhanced cell adhesion and alignment on micro-wavy patterned surfaces[J].PLos One,2014,9(8):e104502

[23]Hindié M,Camand E,Agniel R,et al.Effects of human fibronectin and human serum albumin sequential adsorption on preosteoblastic cell adhesion[J].Biointerphases,2014,9(2):029008

[24]McBeath R,Pirone DM,Nelson CM,et al.Cell shape,cytoskeletal tension,and Rho A regulate stem cell lineage commitment[J].Dev.Cell,2004,6:483-495

[25]Baiula M,Galletti P,Martelli G,et al.New β-Lactam derivativesmodulate cell adhesion and signaling mediated by RGD-binding and leukocyte integrins[J].J Med Chem,2016,59(21):9721-9742

[26]Teixeira LN,Crippa GE,Lefebvre LP,et al.The influence of pore size on osteoblast phenotype expression in cultures grown on porous titanium[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2012,41(9):1097-1101

[27]Iwata N,Nozaki K,Horiuchi N,et al.Effects of controlled micro/nano surfaces on osteoblast proliferation[J].J Biomed Mater Res A,2017,105(9):2589-2596

[28]Cheng A,Humayun A,Cohen DJ,et al.Additively manufactured 3D porous Ti-6Al-4V constructs mimic trabecular bone structure and regulate osteoblast proliferation,differentiation and local factor production in a porosity and surface roughness dependent manner[J].Biofabrication,2014,6(4):045007