阿魏中阿魏酸的提取方法及抑菌作用研究

阿來·海拉希，德麗達(dá)·木拉提別克，迪麗努爾·馬力克

?

阿魏中阿魏酸的提取方法及抑菌作用研究

阿來·海拉希，德麗達(dá)·木拉提別克，迪麗努爾·馬力克*

（新疆師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830054）

研究阿魏中阿魏酸的提取工藝及其抑菌作用。用L9(34)正交試驗(yàn)超聲波和微波輔助乙醇提取阿魏酸；用平板打孔法和試管稀釋法研究不同質(zhì)量濃度阿魏酸提取物對3種供試菌的抑菌作用。超聲提取的最佳工藝條件是料液比1∶30（g/mL）、超聲功率200 W、超聲溫度50 ℃和超聲時間20 min；在此條件下，提取率達(dá)到0.542 mg/g。微波提取的最佳工藝條件是以80%的乙醇為提取溶劑、料液比1∶30（g/mL）、微波功率450 W和微波時間10 min，提取率可達(dá)0.556 mg/g。抑菌試驗(yàn)顯示優(yōu)選的微波提取的阿魏酸提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為阿魏中阿魏酸提取工藝的確定及在抑菌方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

超聲波；微波；阿魏酸；抑菌作用；正交試驗(yàn)

阿魏為傘形科植物新疆阿魏［1］Ferula sinkiang- ensis K. M. Shen，最早的藥用記錄可追溯至明朝李時珍的《本草綱目》。其主要成分阿魏酸［2］(ferulic acid簡稱FA)作為一種酚酸類物質(zhì)廣泛存在于植物界中。研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸具有抗菌、抗抑郁、降壓［3-5］等活性。不僅具有明顯的抗氧化和自由基清除作用［6］，還可預(yù)防和減少此波長紫外線對皮膚的損傷［7］。從植物中提取阿魏酸的方法有很多種，其中超聲法具有節(jié)能和高效的特點(diǎn)，是通過空化、機(jī)械和熱效應(yīng)等作用使藥材的有效成分充分轉(zhuǎn)移到溶劑中的過程［8］。其容易受到超聲波頻率、超聲波發(fā)生器類型、液體的界面性質(zhì)及聲強(qiáng)等的影響［9］。微波法具有高效和污染低特點(diǎn)，是利用微波能同時加熱和藥材相接觸的溶劑，可使有效成分從藥材里轉(zhuǎn)移至溶劑中［10］。本研究是以阿魏為原料，用乙醇作為提取溶劑通過微波法和超聲法提取阿魏中的阿魏酸并做對比，并對優(yōu)選出的微波提取的阿魏酸提取物的抑菌作用進(jìn)行了探究，為阿魏植物的發(fā)展奠定了必要的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏（采自新疆和田地區(qū)）；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；蛋白胨、瓊脂粉、酵母膏、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(均由新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供)，其余試劑均為分析純。

XH-300B微波超聲波組合合成/萃取儀；UV-2100紫外可見光分光光度計(jì)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-D循環(huán)水式真空泵；HWS-26電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏中阿魏酸提取液的制備

準(zhǔn)確稱取過16目篩、石油醚回流脫脂的阿魏根粉末1.00 g，按一定的比例加入75%乙醇，置于超聲-微波協(xié)同萃取儀中，按一定的條件下進(jìn)行超聲和微波提取。提取液抽濾、離心、減壓濃縮至浸膏狀回收溶劑并用75%乙醇定容，測定所得提取液的阿魏酸含量。

1.2.2 阿魏酸含量的測定

稱取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇定容至100 mL，所得阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶度為0.1 mg/mL。分別移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇定容，測定310 nm處的吸光度。每個質(zhì)量濃度做3次平行并取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度與阿魏酸溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）之間的回歸方程為=0.6683-0.0024，2=0.9998，質(zhì)量濃度與吸光度成良好的線性關(guān)系（圖1）。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 阿魏酸提取率的測定

稀釋樣品提取液一定的倍數(shù)后，測定310 nm處的吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算得出阿魏中阿魏酸的濃度，按下式得到阿魏酸的提取率( mg/g)。

阿魏酸提取率=（1）

式中：—阿魏酸濃度，mg /mL；

—溶液體積，mL；

—稀釋倍數(shù)；

—稱取樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)對超聲提取阿魏酸條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的阿魏根粉末1.00g，以75%乙醇為提取溶劑，固定微波功率0，考察表1中的各因素對阿魏酸提取率的影響。按照各單因素條件，進(jìn)行單因素條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表1 超聲提取單因素條件優(yōu)化表

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)對微波提取阿魏酸條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的阿魏根粉末1.00 g，固定超聲功率0，微波溫度50 ℃，考察表2對阿魏酸提取率的影響。按照微波提取阿魏酸的各單因素條件，進(jìn)行單因素條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 微波提取單因素條件優(yōu)化表

1.2.6 超聲提取因素水平的選取

為了進(jìn)一步確定超聲波提取的最佳工藝參數(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，L9(34)正交試驗(yàn)分析料液比、功率、時間和溫度4種因素，因素水平如表3所示。

表3 超聲波正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.7 微波提取因素水平的選取

采用L9(34)正交驗(yàn)，考察乙醇濃度、料液比、功率和時間對阿魏中阿魏酸的提取率的影響，并確定實(shí)驗(yàn)因素的水平。見表4。

表4 微波正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.8 阿魏酸的抑菌作用

（1）培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基LB成分：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母粉5 g、去離子水定容至1000 mL，用1 mol/L NaOH調(diào)pH為7。LB固體培養(yǎng)基：將1.6%瓊脂粉加入到LB液體培養(yǎng)基，煮沸后定容，在120 ℃滅菌處理20 min。

（2）菌液的制備[11]

將細(xì)菌接種到37 ℃活化培養(yǎng)24 h的斜面培養(yǎng)基上，于36 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)17h。取0.1 mL菌液并用生理鹽水稀釋至10 000倍以備用。

（3）抑菌實(shí)驗(yàn)

打孔法：使用瓊脂打孔器（直徑6 mm）均勻打孔，每板各打4孔，去除孔內(nèi)瓊脂并且適當(dāng)封閉孔底。每孔均加阿魏中阿魏酸提取物并依次作標(biāo)記，1 h后置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h?？瞻讓φ战M加入等量的DMSO溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% )觀察結(jié)果。

試管稀釋法：取5支試管并標(biāo)記序號，首先在1號管中加入阿魏酸提取液和培養(yǎng)液各1 mL，混合均勻后準(zhǔn)確吸取1 mL加入2號管中，依次倍比稀釋至4號管，混勻后從4號管棄去1 mL。阿魏酸濃度分別為0.758、0.379、0.189和0.095 mg/mL (第5管為對照)。每管繼續(xù)加0.2 mL菌液于37 ℃下培養(yǎng)一晝夜后觀察結(jié)果。經(jīng)觀察后將每試管中吸取的0.2 mL培養(yǎng)物接種到無菌固體培養(yǎng)基上，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后觀察是否有菌生長。最低抑菌濃度(MIC)是完全沒有菌生長的平板所對應(yīng)的提取物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比的確定

實(shí)驗(yàn)條件同1.2.1節(jié)，料液比對提取率的影響見圖2。

圖 2 料液比對提取率的影響

如圖2，阿魏酸的提取率跟料液比呈正比，料液比為1:30 (g/mL)時，阿魏中阿魏酸的提取率最大；1:30 (g/mL)后提取率趨于下降，這是由于在超聲波的作用下溶出阿魏酸的同時還能溶出更多其他物質(zhì)，使提取液擴(kuò)散速度變慢，黏度變大，導(dǎo)致阿魏酸不易溶出。故料液比為1:30(g/mL)為宜。

2.1.2 超聲功率的確定

超聲功率對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲功率對提取率的影響

阿魏中阿魏酸的提取率隨著超聲功率的增大而升高，在200 W時趨近于最大值；當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大，阿魏中阿魏酸的提取率開始減少。這是由于超聲功率過大導(dǎo)致阿魏酸不太穩(wěn)定而分解，使得阿魏酸的提取率降低。故超聲功率選擇200 W為最佳。

2.1.3 超聲時間的確定

超聲時間對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在5～20 min時，提取率隨超聲時間的增加而逐漸升高。20 min 時，提取率達(dá)到最高值。超過20 min 時，阿魏酸的提取率開始有下降的趨勢；這是因?yàn)榘⑽核岜┞对诳諝庵腥菀妆谎趸茐腫12]，使得到的阿魏酸隨時間的延長而減少。所以，超聲時間選擇20 min為最佳。

2.1.4 超聲溫度的確定

超聲溫度對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲溫度對提取率的影響

溫度在30～50 ℃時，阿魏中阿魏酸的提取率隨著溫度的升高而不斷地增加，50 ℃時阿魏酸的提取率最高。原因是溫度升高，分子運(yùn)動速度加快使得植物細(xì)胞壁的破裂加速，阿魏酸更容易浸出，提取率升高。繼續(xù)升高溫度阿魏酸的提取率有所下降，這可能是溫度太高使植物組織軟化，利于加快溶解可溶性成分，多糖或其他溶出量增多致使阿魏酸提取率下降［13］。

2.2 阿魏中阿魏酸的超聲提取正交試驗(yàn)

2.2.1 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平如表5所示。

表5 超聲輔助提取正交試驗(yàn)分析結(jié)果

由表5可知，超聲波提取阿魏中阿魏酸的最佳工藝條件為2212，即料液比為1∶30 (g/mL) 、超聲功率200 W、超聲溫度50 ℃和超聲時間20 min。各因素對阿魏酸提取率的影響程度依次為料液比（）＞超聲溫度（）＞超聲時間（）＞超聲功率（）。由表6方差分析可知料液比表現(xiàn)出顯著性差異，而功率、溫度和時間未表現(xiàn)出顯著性差異。

表6 超聲輔助提取方差結(jié)果

2.3 微波提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的確定

乙醇濃度對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 乙醇濃度對阿魏中阿魏酸提取率的影響

由圖6可知，阿魏中阿魏酸的提取率隨乙醇濃度的增加而增大，80%處出現(xiàn)最大值；再增大乙醇濃度，阿魏酸提取率反而有所下降；這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大阿魏酸化合物的溶解度也隨之增加，所以其提取率也增加；當(dāng)乙醇濃度過大時，一些醇溶性雜質(zhì)、色素等的浸出量也有所增加，這些成分會同乙醇-水分子結(jié)合，使得阿魏酸提取率降低［14］。綜合考慮，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%為最佳。

2.3.2 微波提取阿魏酸料液比的確定

料液比對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 料液比對提取率的影響

由圖7可知，阿魏酸提取率跟料液比成正比，料液比達(dá)到1∶30 (g/mL)時提取率最大；大于1∶30 (g/mL)時提取率趨于下降，這是由于原料一定時，水解效率會隨提取溶劑量的增加而增加；但是如果提取溶劑用量太大，一方面會使得溶液濃縮時能耗增大，另一方面，也會使得釋放出的阿魏酸在后續(xù)處理過程中更易受到氧化作用而被破壞，故選用1:30 (g/mL)為最佳。

2.3.3 微波時間的確定

微波時間對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

圖8 微波時間對提取率的影響

阿魏是熱敏性物質(zhì)，微波加熱10 min時含量達(dá)到最高值。當(dāng)微波時間大于10 min時阿魏中阿魏酸的提取率下降。繼續(xù)延長時間只會加快水分蒸發(fā)，從而使溶液中的雜質(zhì)增加，阿魏酸含量下降。因此，微波時間為10 min最佳。

2.3.4 微波功率的確定

圖9 微波功率對提取率的影響

微波功率對阿魏中阿魏酸提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。

阿魏酸提取率隨微波功率增大而增加，在450 W時趨于最大值，隨著功率的增加，物質(zhì)吸收的微波能越多，物質(zhì)升高溫的速率越快，越有利于浸出有效成分；但是當(dāng)功率>450 W時，功率過高可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降。故微波功率選取450 W為最佳。

2.4 微波提取正交試驗(yàn)

2.4.1 數(shù)據(jù)處理以及結(jié)果分析

表7 微波輔助提取正交試驗(yàn)分析結(jié)果

表8 微波輔助提取方差分析結(jié)果

由表7極差分析可知，超聲波提取阿魏中阿魏酸最佳工藝條件為2222即乙醇濃度80%、料液比1:30、微波功率450 W和微波時間10 min。各因素對阿魏酸提取率的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋ǎ疚⒉üβ剩ǎ疚⒉〞r間（）＞乙醇濃度（）。從表8方差分析可知，料液比和功率表現(xiàn)出顯著性差異，而乙醇濃度和時間未表現(xiàn)出顯著性差異。

2.5 兩種提取方法的最佳工藝參數(shù)的確定

為了確定超聲波和微波通過正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件的合理性，分別進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：按照2212的條件進(jìn)行超聲波提??；按照2222的條件進(jìn)行微波提取，結(jié)果如表9。

由表9可知，以微波最佳工藝條件進(jìn)行提取，得到阿魏中阿魏酸提取率為0.556 mg/g ，RSD 0.95%，與微波相比，超聲波最佳工藝條件得到的阿魏酸提取率略低為0.542 mg/g，RSD=1.12%。

表明正交試驗(yàn)優(yōu)化所得的工藝條件準(zhǔn)確可靠，且微波法提取阿魏酸的提取率均值(0.556 mg/g)優(yōu)于超聲波提取阿魏酸的提取率均值( 0.542 mg/g )，因此選取微波提取法最為合適。

2.6 阿魏中阿魏酸的提取液的抑菌活性研究

分析表10和圖10可知，阿魏中阿魏酸對枯草芽孢、桿菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用。其抑菌作用的影響程度分別為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌。

表10 濾紙片擴(kuò)散方法測定阿魏酸的抑菌圈直徑(mm)

圖10 濾紙圓片擴(kuò)散法測定阿魏酸抑菌活性現(xiàn)場照

3 結(jié)論

本研究以阿魏為原料，采用超聲波法和微波法提取阿魏酸，是在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交的方差分析優(yōu)化提取工藝。比較了超聲波法和微波法提取阿魏酸的提取率。超聲波提取各因素對阿魏酸提取率的影響程度為：料液比（）＞超聲溫度（）＞超聲時間（）＞超聲功率（）；優(yōu)化的最佳超聲工藝條件為：料液比1∶30（g/mL）、超聲功率200 W、超聲溫度50 ℃和超聲時間20 min、提取率0.542 mg/g；微波提取各因素對阿魏酸提取率的影響程度為：料液比（）＞微波功率（）＞微波時間（）＞乙醇濃度（），優(yōu)化的最佳微波工藝條件為：乙醇濃度80%、料液比1∶30（g/mL）、微波功率450 W和微波時間10 min，阿魏酸提取率為0.556 mg/g。相對于超聲法而言，微波提取阿魏酸能有效縮短提取時間，且提取率高；優(yōu)選出的微波提取阿魏中阿魏酸提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌均有抑制作用。對菌株的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)；抑制效果順序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌。為工業(yè)化提取植物有效成分和開發(fā)利用阿魏酸的抑菌作用具有重要的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。

［1］李廣志, 李曉瑾, 曹麗, 等. 新疆阿魏種子化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥,2015,46(12):1730-1736.

［2］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2010: 175.

［3］Borges A, Ferreira C, Saavedra M J, et al. Antibacterial activity and mode of action of ferulic and gallic acids against pathogenic bacteria [J]. Microbial Drug Resistance, 2013, 19( 4) : 256 -265.

［4］Chen J L, Lin D, Zhang C, et al. Antidepressant -like effects of ferulic acid: involvement of serotonergic and norepinergic systems [J]. Metabolic Brain Disease, 2014, 30( 1) : 129 -136.

［5］Alam M A, Sernia C, Brown L. Ferulic acid improves cardiovascular and kidney structure and function in hypertensive rats[J]. Journal of ardiovascular Pharmacology, 2013, 61( 3) : 240 – 249.

［6］趙文紅, 鄧澤元, 范亞葦,等. 阿魏酸體外抗氧化作用研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(01):219-223.

［7］劉艷紅, 楊子佳, 祝鈞. 阿魏酸酯類衍生物的制備及其在化妝品中的應(yīng)用[J].化學(xué)世界, 2014( 11) :700－704.

［8］王賽君, 伍振峰, 楊明,等. 中藥提取新技術(shù)及其在國內(nèi)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究[J]. 中國中藥雜志, 2014,39( 8) : 1360 – 1367.

［9］郭永剛,王景芹. 超聲波在石油化工中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 當(dāng)代化工,2008,(01):5-7+10.

［10］高鐿萌, 徐愿堅(jiān), 杜洪飛,等.中藥提取新技術(shù)的研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014,16( 4) : 890－894.

［11］王彥杰,計(jì)紅芳,孫俊良.老鷹茶總皂苷的超聲提取及抑菌活性研究[J].食品科技,20l2,37(9): 226—229.

［12］謝瑋,嚴(yán)守雷,李春麗,等.響應(yīng)面法優(yōu)化蓮藕中結(jié)合態(tài)阿魏酸的提取工藝[J]. 食品科學(xué),2014,35(10):18-22.

［13］蘆歡,唐曉丹,李博. 超聲輔助萃取川芎中阿魏酸工藝的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,55(09):2335-2338.

［14］曹春艷.響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉黃酮提取工藝[J]. 中國食品學(xué)報,2014,14(04):78-86.

Study on Extraction Methods and Antibacterial Activity of Ferulic Acid From Ferula Asafoetida

，DILINUER Malike

（Department of Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China）

To investigate the extraction process and antimicrobial activity of ferulic acid (FA) from ferula asafetida, orthogonal array design was employed to optimize extraction conditions of ultrasonic and microwave. The antibacterial effect of FA extract at different concentrations on 3 strains was evaluated by agar diffusion and broth dilution methods. The results showed that, the best condition of ultrasonic extraction was as follows: the power 200 W, extraction temperature 50 ℃, extraction time 20 min and the ratio of material to liquid 1∶30 g/m. Under the optimized conditions, the extraction rate of FA was 0.542 mg/g. The best condition of microwave extraction was as follows: the ratio of material to liquid 1∶30 (g/mL), the microwave power 450 W, ethanol concentration 80%, extraction time 10 min.The extraction rate of FA rate was 0.556 mg/g. FA had inhibitory effect on all tested strains. This study can provide experimental reference for further development and utilization of ferulic acid.

Ultrasonic; Microwave; Ferulic acid; Antibacterial effect; Orthgonal experiment

TQ 041

A

1671-0460（2017）12-2454-06

國家自然科學(xué)基金，項(xiàng)目號：21165018。

2017-11-17

阿來·海拉希（1991-），女，新疆省額敏縣人，在讀研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的分離分析。E-mail：1369506078@qq.com。

迪麗努爾·馬力克（1964-），女，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的分離分析。E-mail：pkudilnur@sina.com。