兩步法制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的工藝參數(shù)研究

李亞云，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

兩步法制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的工藝參數(shù)研究

李亞云，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了制備高活性ACE抑制肽，研究?jī)刹椒ǜ呋钚岳业鞍譇CE抑制肽的制備工藝條件參數(shù)。利用枯草桿菌堿性蛋白酶55℃水解酪蛋白6h制備酪蛋白ACE抑制肽，IC50為38.6μg/mL；采用相同的酶進(jìn)行Plastein反應(yīng)來(lái)修飾酪蛋白ACE抑制肽，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化修飾反應(yīng)條件。固定酪蛋白ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，以ACE抑制肽的游離氨基減少量為指標(biāo)，優(yōu)化的修飾反應(yīng)條件為酶添加量7.7kU/g蛋白質(zhì)、溫度42.7℃、反應(yīng)時(shí)間6h，在此條件下，酪蛋白ACE抑制肽的游離氨基減少量達(dá)到179.72μmol/g蛋白質(zhì)。ACE抑制活性分析結(jié)果表明，修飾后ACE抑制肽的抑制活性顯著提高且與修飾反應(yīng)程度相關(guān)，IC50可降至0.5μg/mL。

酪蛋白；ACE抑制肽；制備工藝；Plastein反應(yīng)

Abstract：The ACE inhibitory peptides derived from casein hydrolyzed with alkaline protease from Bacillus subtilis at 55 ℃for 6 h exhibited an IC50of 38.6μg/mL. To enhance their activity, they were modified via the plastein reaction catalyzed by the enzyme. Moreover, response surface methodology was employed to investigate the optimal values of plastein reaction parameters including enzyme dosage and reaction temperature and time. Results showed that after the optimal reaction for 6 h at 42.7 ℃and an enzyme dosage of 7.7 kU/g protein, the content of free amino groups in the peptides were decreased by up to 179.72 μmol/g protein. The optimized plastein reaction resulted in an obvious enhancement of casein-derived ACE inhibitory peptides, which was related to the reaction degree and the IC50of the modified ACE inhibitory peptides was reduced to 0.5μg/mL.

Key words：casein；ACE inhibitory peptides；preparation method；plastein reaction

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后，產(chǎn)生分子質(zhì)量不等的肽類，這些肽類的功能性質(zhì)尤其是生物活性可能發(fā)生顯著變化[1-2]。酪蛋白作為主要的食品蛋白質(zhì)來(lái)源之一，是制備生物活性肽的重要原料[3-4]，可以制備ACE抑制肽、抗氧化肽等。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽以其安全性等優(yōu)點(diǎn)具有研究和實(shí)用價(jià)值[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)ACE抑制肽的制備研究，主要集中在蛋白酶和蛋白質(zhì)的選擇[6-7]、酶解條件和相關(guān)制備參數(shù)的優(yōu)化[8-9]等方面。這些研究的特征是，在從蛋白質(zhì)底物制備ACE抑制肽時(shí)無(wú)論是利用單一蛋白酶或復(fù)合蛋白酶的催化作用，均為一步法酶水解或者是連續(xù)酶水解的過(guò)程。因此，此類方式的制備技術(shù)必然導(dǎo)致ACE抑制肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)受限制于原料蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即ACE抑制肽的活性高低受限制于蛋白質(zhì)底物。故此，采用修飾技術(shù)手段來(lái)提高蛋白質(zhì)水解物的ACE抑制活性，制備高活性的ACE抑制肽，是一個(gè)令人十分感興趣的技術(shù)問(wèn)題，甚至可能涉及新的理論問(wèn)題。

Plastein反應(yīng)是濃縮的蛋白水解物在合適條件下經(jīng)蛋白酶作用形成凝膠狀物質(zhì)的反應(yīng)，它通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)[10]。Plastein反應(yīng)過(guò)去常被用于改善蛋白質(zhì)氨基酸組成[11]，提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)[12]等方面。Plastein反應(yīng)所涉及的機(jī)理復(fù)雜，至少存在3種不同理論[13-15]；縮合作用、轉(zhuǎn)肽作用、物理聚集。Plastein 反應(yīng)中的轉(zhuǎn)肽作用和縮合作用涉及在肽分子之間有新肽鍵的生成，而縮合作用還涉及到反應(yīng)底物中游離氨基的減少。所以，蛋白質(zhì)水解物在進(jìn)行Plastein反應(yīng)時(shí)，底物游離氨基減少量可以反映Plastein反應(yīng)的程度。由于Plastein 反應(yīng)中的轉(zhuǎn)肽作用和縮合作用涉及新肽鍵的生成，這就意味著蛋白質(zhì)水解物通過(guò)Plastein反應(yīng)修飾后，有可能生成在原料蛋白質(zhì)中不存在的某些新肽段，從而影響到最終產(chǎn)物的ACE抑制活性。目前尚未發(fā)現(xiàn)有其他的研究者利用Plastein反應(yīng)來(lái)制備ACE抑制肽的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究嘗試兩步法制備酪蛋白ACE抑制肽。首先，利用堿性蛋白酶水解酪蛋白獲得一定活性大小ACE抑制肽，然后應(yīng)用堿性蛋白酶催化的Plastein反應(yīng)對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行第二步修飾；以反應(yīng)底物(ACE抑制肽)游離氨基減少量為指標(biāo)，重點(diǎn)地應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)修飾反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型；最后對(duì)一些修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)、比較。研究結(jié)果可以確定Plastein反應(yīng)修飾制備高活性ACE抑制肽的可行性，以及兩步法的技術(shù)路線參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(蛋白質(zhì)含量95.7%) 上海山浦化工有限公司；堿性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；FAPGG(FA-Phe-Gly-Gly)；兔肺丙酮粉 Sigma公司；卡托普利(Captopril) Fluca公司；其他所用試劑均為分析純?cè)噭盟疄槿ルx子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；DELTA 320精密pH計(jì) 梅特勒-托利多中國(guó)有限公司；KjeltecTM2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；G1-21M冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；LGJ-1真空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公；H-1微型漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

圖1 高活性酪蛋白ACE抑制肽的制備工藝流程Fig.1 Production flow chart of casein-derived ACE inhibitory peptides with high activity

1.3.2 ACE抑制肽的制備

將酪蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%溶液并用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.5，加入堿性蛋白酶(10kU/g蛋白質(zhì))，55℃下水浴中水解6h；95℃條件下滅酶處理15min，冷卻至室溫后5000r/min離心20min以除去不溶性沉淀。測(cè)定上清液(酪蛋白水解物)的蛋白質(zhì)含量和游離氨基含量，計(jì)算水解度。取1mL上清液，一定倍數(shù)稀釋后測(cè)定其ACE抑制活性。上清液冷凍干燥后得到酪蛋白ACE抑制肽，并保存于－20℃待后續(xù)研究。

1.3.3 ACE抑制肽的Plastein修飾反應(yīng)優(yōu)化

用堿性蛋白酶催化Plastein反應(yīng)，固定底物(酪蛋白ACE抑制肽)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，研究3個(gè)因素(堿性蛋白酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間)對(duì)修飾反應(yīng)的影響行為，以反應(yīng)底物的游離氨基減少量為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素五水平響應(yīng)面分析方法，其因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素水平編碼表Table 1 Variable and levels in central composite design

1.4 相關(guān)分析

1.4.1 蛋白質(zhì)含量、水解度以及酶活力的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量：按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[16]測(cè)定。

游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度(DH)測(cè)定：采用鄰苯二甲醛(OPA)法[17-18]。

OPA試劑的配制：準(zhǔn)確稱取2.00g 十二烷基磺酸鈉(SDS)，加入30mL pH9.5的硼酸緩沖液，水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1mL 80mg/mL的OPA乙醇溶液和200μL β-巰基乙醇，最后用硼酸緩沖液定容至100mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品溶液稀釋1000倍后，取3mL樣品稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)溶液與同體積的OPA試劑混合并開(kāi)始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5min，立即在分光光度計(jì)上測(cè)定，波長(zhǎng)為340nm。以亮氨酸溶液(12～36μg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中游離氨基的濃度(μmol/mL)。水解度計(jì)算公式[19]如下：

酶活力測(cè)定：采用SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[20]測(cè)定。

1.4.2 ACE抑制活性測(cè)定[21]

ACE酶液：50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預(yù)冷至4℃的硼酸緩沖液(pH8.3，100mmol/L)中，4℃保持12h后于20000r/min冷凍離心40min，收集上清液并4℃保存。

FAPGG底物溶液：將FAPGG溶于pH8.3 100mmol/L的硼酸緩沖液(含300mmol/L NaCl)，配制成1.6mmol/L的溶液。

500μL FAPGG底物溶液與100μL超純水或抑制劑(ACE抑制肽或卡托普利)混勻，37℃預(yù)熱2min，加入300μL ACE酶液開(kāi)始反應(yīng)，在37℃反應(yīng)30min后，立即加入100μL EDTA(100mmol/L)終止反應(yīng)，加入4mL超純水稀釋，平行3次。0min樣品的測(cè)定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。340nm處分別測(cè)體系在0min和30min時(shí)的吸光度，計(jì)算差值ΔA(ΔA=A0min－A30min)。以單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化表示ACE酶活力，抑制劑對(duì)ACE的抑制程度應(yīng)用下式計(jì)算[6]：

式中ΔAc為加入超純水時(shí)吸光度在30min內(nèi)的變化；ΔAi為加入抑制劑時(shí)吸光度在30min內(nèi)的變化。

IC50定義為抑制50% ACE酶活力時(shí)所需抑制劑的濃度，通過(guò)下式將ACE抑制活性轉(zhuǎn)換成IC50[6]：

式中：IC為測(cè)定過(guò)程中抑制劑濃度/(mg/mL或nmol/L)；v為加入抑制劑后測(cè)得的相應(yīng)酶活力/%(v=100－ACE抑制活性)。本研究中卡托普利的IC50測(cè)定值為5.2nmol/L。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Design Expert 7.0軟件中Response Surface程序進(jìn)行分析，用Model Graphs程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白ACE抑制肽的制備

大多數(shù)ACE抑制肽是由2～12個(gè)氨基酸殘基組成的小肽[2]，這需要酪蛋白的深度水解才能達(dá)到。利用前期研究所選定的水解條件，堿性蛋白酶水解酪蛋白6h，獲得ACE抑制活性較強(qiáng)的酪蛋白水解物。測(cè)定結(jié)果顯示，其IC50為38.6μg/mL(表4)。通過(guò)測(cè)定、計(jì)算，酪蛋白水解物的DH為11.2%。以后就以此水解物(酪蛋白ACE抑制肽)作為底物，研究第二步Plastein修飾反應(yīng)的適宜條件參數(shù)，以及修飾反應(yīng)對(duì)它的ACE抑制活性的影響作用。

2.2 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 回歸方程的建立與分析

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and experimental results of decrease of free amino groups in casein-derived ACE inhibitory peptides before and after modification

前期研究發(fā)現(xiàn)，Plastein反應(yīng)修飾時(shí)，底物濃度過(guò)大則體系的黏度太大而不利于反應(yīng)；底物濃度過(guò)低則導(dǎo)致發(fā)生水解反應(yīng)；適宜的底物濃度為35%(m/m)[22]。為了確定其他的適宜條件參數(shù)，按照中心組合設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，進(jìn)行20組試驗(yàn)，以Plastein反應(yīng)過(guò)程中底物游離氨基減少量(底物反應(yīng)前的游離氨基含量減去反應(yīng)后產(chǎn)物的游離氨基含量)為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，剔除不顯著的因子，獲得底物游離氨基減少量(Y)與酶添加量(X1)、反應(yīng)溫度(X2)和反應(yīng)時(shí)間(X3)關(guān)系的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3分析結(jié)果看出，所得模型顯著(P＜0.0001)，失擬檢驗(yàn)不顯著(P=0.2353)，模型與實(shí)際情況擬合較好(R2Adj= 0.9803)，可以很好地反映反應(yīng)過(guò)程中底物游離氨基減少量的變化，用于實(shí)際反應(yīng)情況預(yù)測(cè)。分析還表明，各因素對(duì)底物游離氨基減少量的影響順序?yàn)榉磻?yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞酶添加量。通過(guò)回歸方程所作的響應(yīng)面曲面圖及其等高線圖，如圖2～4所示。

酶添加量和反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物的游離氨基減少量交互作用的響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖2。二者之間的交互作用較小，當(dāng)酶添加量一定時(shí)，所選反應(yīng)溫度范圍內(nèi)產(chǎn)物的游離氨基減少量隨反應(yīng)溫度的升高而增加，這一現(xiàn)象與反應(yīng)溫度升高能提高反應(yīng)速率以及堿性蛋白酶的最適催化溫度有關(guān)。另外，當(dāng)反應(yīng)溫度一定時(shí)，產(chǎn)物的游離氨基減少量先逐漸增加后逐漸降低。從等高線圖中可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5h時(shí)(0水平)，酶添加量為6.8～8.5kU/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)溫度為28～42℃時(shí)，產(chǎn)物的游離氨基減少量較大。

酶添加量和反應(yīng)時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖3。二者之間的交互作用較大，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)、酶添加量的增加，產(chǎn)物的游離氨基減少量先逐漸增加，然后逐漸減少。從等高線圖中可見(jiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí)(0水平)，酶添加量為6.7～8.5kU/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間為4.7～7.7h時(shí)，產(chǎn)物的游離氨基減少量較大。

反應(yīng)溫度和時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖4。從等高線圖中可見(jiàn)，當(dāng)酶添加量為7.5kU/g蛋白質(zhì)時(shí)(0水平)，反應(yīng)溫度為30～42℃、反應(yīng)時(shí)間為3.7～7.7h時(shí)產(chǎn)物的游離氨基減少量較大。在所選的反應(yīng)溫度和時(shí)間范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的游離氨基減少量的單獨(dú)作用都非常顯著，但是它們的交互作用不顯著，這可能是由于在所選的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，升高溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響最大。

對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，計(jì)算得到極大響應(yīng)值和對(duì)應(yīng)的因素條件為：酶添加量(X1)為7.7kU/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)溫度(X2)42.7℃、反應(yīng)時(shí)間(X3)為6h，產(chǎn)物的游離氨基減少量(Y)為185.66μmol/g蛋白質(zhì)。

2.2.2 Plastein反應(yīng)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用上述優(yōu)化得到的Plastein反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)際反應(yīng)，測(cè)得產(chǎn)物的游離氨基減少量為179.72μmol/g蛋白質(zhì)(3次結(jié)果的平均值)，與理論值(185.66μmol/g蛋白質(zhì))相比無(wú)顯著差別，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反應(yīng)修飾與抑制活性變化

對(duì)先前制備出的酪蛋白ACE抑制肽進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾，通過(guò)改變反應(yīng)時(shí)間，制備出修飾反應(yīng)程度不同(游離氨基減少量不同)的3個(gè)產(chǎn)物，它們的ACE抑制活性(3次平均值)和IC50值列于表4。在相同的最終濃度下(0.01mg/mL)，修飾反應(yīng)前的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性為20.59%，相應(yīng)的IC50為38.6μg/mL；經(jīng)過(guò)Plastein反應(yīng)修飾后，產(chǎn)物的ACE抑制活性發(fā)生顯著變化。當(dāng)產(chǎn)物的游離氨基減少量為83.59μmol/g蛋白質(zhì)，其ACE抑制活性為22.06%，相應(yīng)的IC50降低至35.3μg/mL，相比底物差異不大；當(dāng)產(chǎn)物的游離氨基減少量為129.57 μmol/g蛋白質(zhì)(即進(jìn)一步減少了約46μmol/g蛋白質(zhì))，其ACE抑制活性為42.65%，相應(yīng)的IC50降低至13.4μg/mL，與底物相比差異很大；當(dāng)產(chǎn)物的游離氨基減少量為179.72μmol/g蛋白質(zhì)(即再一次減少了約50μmol/g蛋白質(zhì))，其ACE抑制活性達(dá)到95.59%，相應(yīng)的IC50降低至0.5μg/mL，與底物相比差異極大。表4中的分析數(shù)據(jù)表明，Plastein反應(yīng)修飾處理確實(shí)提高了酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性，并且Plastein修飾反應(yīng)程度越大，酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性越高，顯示出與修飾反應(yīng)程度(產(chǎn)物的游離氨基減少量)之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但是相關(guān)的分子機(jī)制有待于今后的研究來(lái)揭示。無(wú)論如何，研究結(jié)果亦表明利用兩步法、采用Plastein反應(yīng)修飾制備高活性酪蛋白ACE抑制肽的可行性。

表4 Plastein反應(yīng)修飾對(duì)酪蛋白ACE抑制肽活性的影響Table 4 Influences of plastein modification on ACE inhibitory activity of casein hydrolysates

3 結(jié) 論

采用兩步法可以從酪蛋白制備出高活性的酪蛋白ACE抑制肽。首先用堿性蛋白酶在55℃條件下酶解10%(m/m)酪蛋白溶液6h，分離后制備出水解度為11.2%、抑制活性為20.59%、IC50為38.6μg/mL的酪蛋白ACE抑制肽；然后，利用Plastein反應(yīng)對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行修飾，最終得到的ACE抑制肽的ACE抑制活性顯著提高，活性達(dá)到95.59%，IC50值降低至0.5μg/mL。

應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立了Plastein修飾反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，得到的優(yōu)化反應(yīng)條件為：酪蛋白ACE抑制肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定在35%時(shí)，酶添加量7.7kU/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)溫度42.7℃、反應(yīng)時(shí)間6h，此條件下酪蛋白ACE抑制肽的游離氨基減少量約為179.72μmol/g蛋白質(zhì)。

修飾后的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性與Plastein反應(yīng)程度存在一定的關(guān)聯(lián)性，此問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

[1] 陳潔, 劉國(guó)琴, 裘愛(ài)泳, 等. 葵花濃縮蛋白的酶法改性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2008, 39(5): 86-90.

[2] PIHLANTO A, AKKANEN S, KORHONEN H J. ACE-inhibitory and antioxidant properties of potato (Solanum tuberosum)[J]. Food Chemistry,2008, 109(1): 104-112.

[3] KUBA M, TANA C, TAWATA S, et al. Production of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from soybean protein with Monascus purpureus acid proteinase[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(6): 2191-2196.

[4] LPEZ-FANDIO R, OTTE J, van CAMP J. Physiological, chemical and technological aspects of milk-protein-derived peptides with antihypertensive and ACE-inhibitory activity[J]. International Dairy Journal, 2006,16(11): 1277-1293.

[5] LI Guanhong, LE Guowei, SHI Yonghui, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J]. Nutrition Research, 2004, 24(7):469-486.

[6] OTTEA J, SHALABYA S M, ZAKORAA M, et al. Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates: Effect of substrate, enzyme and time of hydrolysis[J]. International Dairy Journal,2007, 17(5): 488-503.

[7] MAO Xueying, NI Jinren, SUN Weiling, et al. Value-added utilization of yak milk casein for the production of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides[J]. Food Chemistry, 2007, 103(4): 1282-1287.

[8] 姚成虎, 王志耕, 梅林, 等. 胃蛋白酶水解珠蛋白獲得ACE抑制肽的工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(5): 284-288.

[9] 陳季旺, 劉英, 夏文水, 等. 大米降壓肽酶法制備工藝及其性質(zhì)研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2007, 23(5): 210-213.

[10] HUDSON B J F. Biochemistry of food Proteins [M]. New York: Elsevier Applied Science, 1992: 271-300

[11] ARAI S, YAMASHITA M, FUJIMAKI M. A novel one-step process for enzymatic incorporation of amino acids into proteins: papain catalyzed polymerization of L-methionine ethyl ester and its regulation by adding a protein substrate[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1979, 43(5): 1069-1074.

[12] SHIMADA A, YAMAMOTO I, SASE H. Surface properties of enzymatically modified proteins in aqueous systems[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1984, 48(11): 2681-2688.

[13] YAMASHITA M, ARAI S, FUJIMAKI M. Plastein reaction for food protein improvement[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1976, 24(6): 132-134.

[14] GOEPFERT A, LORENZEN P C, SCHLIMME E. Peptide synthesis during in vitro proteolysis-transpeptidation or condensation[J]. Nahrung,1999, 43(3): 211-212.

[15] ANDREWS A T, ALICHANIDIS E. The plastein reaction revisited:evidence for a purely aggregation reaction mechanism[J]. Food Chemistry,1990, 35(4): 243-261.

[16] GB/T 5009.5—2003食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[17] CHURCH F C, SWAISGOOD H E, PORTER D H, et al.Spectrophtotometric assay usingο-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and milk proteins[J]. Journal of Dairy Science,1983, 66(6): 1219-1277.

[18] SPELLMAN D, McEVOY E, O’CUINN G, et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2003, 13(6): 447-453.

[19] 趙新淮, 馮志彪. 蛋白質(zhì)水解物水解度的測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 1994,15(11): 65-67.

[20] SB/T 10317—1999蛋白酶活力測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1999.

[21] MURRAY B A, WALSH D J, FitzGERALD R J. Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanylglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2004, 59(2): 127-137.

[22] 李亞云, 趙新淮. 酪蛋白水解物的酶法修飾與ACE抑制活性變化[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(5): 35-39.

Two-step Alkalinase Hydrolysis for Production of Casein-derived ACE Inhibitory Peptides with High Activity

LI Ya-yun，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)10-0006-06

2009-08-20

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z324)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972132)

李亞云(1982—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：cloud125531@yahoo.com.cn

*通信作者：趙新淮(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn