響應面法優(yōu)化金葉銀杏落葉總黃酮提取工藝

李雨蔚，王曉玲

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

響應面法優(yōu)化金葉銀杏落葉總黃酮提取工藝

李雨蔚，王曉玲

(西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所，四川 成都 610041)

優(yōu)化金葉銀杏落葉中總黃酮的提取工藝.分別研究單因素液固比、丙酮水比、提取溫度、提取時間對總黃酮含量的影響，然后在單因素實驗基礎之上利用響應面法確定優(yōu)化金葉銀杏落葉中總黃酮的最佳條件.結(jié)果顯示最優(yōu)提取工藝為:液固比13.52mL·g－1、丙酮-水比71:29、提取溫度54.82℃、提取時間2.97 h.

響應面法;銀杏;黃酮;工藝優(yōu)化

金葉銀杏為銀杏的變種，銀杏(Ginkgo biloba)又名白果，屬裸子植物.銀杏中主要的有效活性成分為內(nèi)酯類、黃酮類，還有酚類、有機酸類、原花青素等.銀杏在臨床應用以及保健類食品開發(fā)等方面有廣闊的開發(fā)前景.銀杏葉具有潤肺、止痛、平喘等功效，常用于咳嗽、肺虛、心絞痛、冠心病、抗衰老、腦缺血等［1-5］.對銀杏葉中總黃酮提取工藝的研究多采用的是以乙醇－水為提取溶劑進行。本課題組采用酮類提?。彼恋矸▽鹑~銀杏落葉中總黃酮成分的提取率進行了系統(tǒng)的研究，并應用響應面分析法對其總黃酮的提取條件進行了優(yōu)化.目前我國對于以丙酮－水為提取溶劑的研究報道很少，希望此工藝能為銀杏葉的深入研究提供更多的理論依據(jù)［6］.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉:2014年12月采自西南民族大學校園，經(jīng)西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所王曉玲教授鑒定為金葉銀杏落葉.所用試劑均為國產(chǎn)的分析純.BS－3000A電子天平(上海友聲衡器有限公司);AL104精密電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);SHB－III循環(huán)水式多用真空泵(北京科偉永興儀器有限公司);RE－2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量測定

亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法

1.2.2 標準曲線的繪制

精密量取 0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 對照品溶液分別于25 mL容量瓶中，然后向各容量瓶中分別加入1 mL5%的NaNO2，均勻混合后放置5 min，分別加入1 mL10%Al(NO3)3，均勻混合后放置5 min，再分別加入10 mL5%NaOH，最后用70%體積分數(shù)的乙醇稀釋定容到刻度線，混合均勻后靜置15 min。將70%的乙醇溶液作為參比液，以2005年版藥典中一部附錄VA下所描述的紫外－可見分光光度法為準，在波長510 nm處測其吸光度，橫坐標為蘆丁濃度(g·L－1)，縱坐標為吸光度 A 并繪制標準曲線［7－10］.結(jié)果在濃度0.012～0.060 g·L－1內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關系，并得回歸方程y=11.862x+0.0068，R2=0.9993.

1.2.3 金葉銀杏落葉總黃酮含量測定及計算方法

準確稱取銀杏葉粗粉約10 g，用一定體積、一定比例的丙酮－水溶液，在一定溫度下加熱回流提取一定時間，過濾、堿化濾液后再過濾沉淀，濾液加硫酸調(diào)pH，用一定量的丁酮/丙酮混合液萃取，加入硫酸銨，過濾后將濾液濃縮［11］，用體積分數(shù)70%的乙醇定容到50 mL容量瓶，再用移液管從中取出0.5 mL溶液加到25 mL容量瓶中，按標準曲線測繪的方法顯色，定容，根據(jù)所作標準曲線測定總黃酮含量.

總黃酮含量(%)=(提取所得總黃酮的質(zhì)量÷銀杏葉粗粉的質(zhì)量)×100

1.2.4 單因素試驗

提取工藝流程(酮類提取-氨水沉淀法):金葉銀杏落葉→烘箱烘干→粉碎→丙酮水溶液回流提取→抽濾→濾液→濃縮濾液→堿化濾液→抽濾→濾液→酸化濾液→硫酸銨，丁酮/丙酮混合液萃取濾液→加入硫酸銨→酮相→減壓濃縮→70%乙醇洗滌浸膏→定容到50 mL容量瓶中→測定總黃酮含量

1.2.5 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取液-固比(A)、丙酮-水比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)作為自變量，每個因素設定三個水平并以金葉銀杏落葉中總黃酮含量為響應值，利用Design-Expert 8.06軟件，通過Box-Behnken設計對上述因素進行優(yōu)化處理，建立回歸模型，從而得到最佳的提取工藝條件.設計因素水平編碼如表1 所示［12］.

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 L9(34)orthogonal test factors

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果［13］

2.1.1 不同液固比對金葉銀杏落葉中總黃酮含量的影響

準確稱取銀杏葉粗粉10 g，將其與不同體積(50，100，150，200，250 mL)丙酮-水(70:30)混合，55 ℃下回流3 h，提取2次，合并濾液.減壓濃縮濾液至25 mL，分離出沉淀物.濾液用氨水調(diào)節(jié)pH到9左右，過濾沉淀，向濾液中加入硫酸，調(diào)節(jié)pH到2左右，在有8 g硫酸銨存在的濾液中用約15 mL的丁酮-丙酮(70:30)混合液萃取，液-液萃取分離出有機相(上層)，繼續(xù)加入約2.5 g的硫酸銨，過濾，濃縮濾液成浸膏，用適量的70%乙醇洗滌浸膏并定容到50 mL容量瓶，從中量取0.5 mL加至25 mL容量瓶中，按照

1.2.2中顯色方法顯色，用70%乙醇定容，測定、計算總黃酮含量.不同液固比對金葉銀杏落葉總黃酮含量的影響如圖1所示.在液固比在5～25范圍內(nèi)總黃酮含量先增后減，在14左右總黃酮含量幾乎最高，故確定比較適宜的液固比是14:1(mL/g).

圖1 不同液-固比對總黃酮含量的影響Fig.1 Influence of different liquid-solid ratioson the yield of total flavonoids

2.1.2 不同丙酮-水比對金葉銀杏落葉中總黃酮含量的影響

準確稱取銀杏葉粗粉約10 g，用150 mL丙酮-水不同比例(50:50、60:40、70:30、80:20、90:10)混合，在55℃下回流3 h，提取2次，合并濾液.減壓濃縮濾液至約25 mL，分離出沉淀物.濾液用氨水調(diào)節(jié)pH到9左右，過濾沉淀，向濾液中加入硫酸，調(diào)節(jié)pH到2左右，在有8 g硫酸銨存在的濾液中用約15 mL的丁酮-丙酮(70:30)混合液萃取，液-液萃取分離出有機相，繼續(xù)加入約2.5 g的硫酸銨，過濾，濃縮濾液成浸膏，用適量的70%乙醇洗滌浸膏并定容到50 mL容量瓶，從中量取0.5 mL加至25 mL容量瓶中，按照1.2.2中顯色方法顯色，用70%乙醇定容，測定、計算總黃酮含量.不同丙酮水比對金葉銀杏落葉總黃酮含量的影響如圖所示.如圖2所示總黃酮含量在丙酮/(丙酮+水)0.5～0.7范圍內(nèi)呈上升趨勢，在0.7后左右呈下降趨勢，可能是因為丙酮的比例增大后銀杏落葉中其他溶于丙酮的部分也被提取出來導致總黃酮含量減小.因而確定0.7即丙酮與水的比例為70:30為此條件下的最佳值.

圖2 不同丙酮/(丙酮+水)對總黃酮含量的影響Fig.2 Influence of different acetone-water ratioson the yield of total flavonoids

2.1.3 不同提取時間對金葉銀杏落葉中總黃酮含量的影響

準確稱取銀杏葉粗粉10 g，用150 mL丙酮-水(70:30)混合，在 55 ℃下回流不同時間(2，2.5，3，3.5，4 h)，提取2次，合并濾液.減壓濃縮濾液至約25 mL，分離出沉淀物.濾液用氨水調(diào)節(jié)pH到9左右，過濾沉淀，向濾液中加入硫酸，調(diào)節(jié)pH到2左右，在有8 g硫酸銨存在的濾液中用約15 mL的丁酮-丙酮(70:30)混合液萃取，液-液萃取分離出有機相，繼續(xù)加入約2.5 g的硫酸銨，過濾，濃縮濾液成浸膏，用適量的70%乙醇洗滌浸膏并定容到50 mL容量瓶，從中量取0.5 mL加至25 mL容量瓶中，按照1.2.2中顯色方法顯色，用70%乙醇定容，測定、計算總黃酮含量.在2～4 h之間總黃酮含量先增后減，在3 h左右達到最高值，可能是時間過長而導致黃酮的降解致使總黃酮含量減小.因而確定最佳提取時間為3 h.

圖3 不同提取時間對總黃酮含量的影響Fig.3 Influence of different extraction timeon the yield of total flavonoids

2.1.4 不同提取溫度對金葉銀杏落葉中總黃酮含量的影響

準確稱取銀杏葉粗粉10 g，用150 mL丙酮-水(70:30)混合，在不同提取溫度(45，50，55，60，65 ℃)下回流3 h，提取2次，合并濾液.減壓濃縮濾液至約25 mL，分離出沉淀物.濾液用氨水調(diào)節(jié)pH到9左右，過濾沉淀，向濾液中加入硫酸，調(diào)節(jié)pH到2左右，在有8 g硫酸銨存在的濾液中用約15 mL的丁酮-丙酮(70:30)混合液萃取，液-液萃取分離出有機相，繼續(xù)加入約2.5 g的硫酸銨，過濾，濃縮濾液成浸膏，用適量的70%乙醇洗滌浸膏并定容到50 mL容量瓶，從中量取0.5 mL加至25 mL容量瓶中，按照1.2.2中顯色方法顯色，用70%乙醇定容，測定、計算總黃酮含量.如圖4所示，在45～65℃范圍內(nèi)，總黃酮含量先隨溫度升高而增大，當超過55℃后，總黃酮含量隨溫度的升高而下降，這可能是由于剛開始溫度較低沒有達到丙酮的沸點，故沒有回流產(chǎn)生，當溫度超過55℃后由于溫度過高而導致黃酮部分分解，因此確定55℃為適宜提取溫度.

圖4 不同提取溫度對總黃酮含量的影響Fig.4 Influence of different extraction temperatureson the yield of total flavonoids

2.2 響應面試驗結(jié)果及分析

響應面試驗結(jié)果及分析見表2，響應面試驗的回歸系數(shù)方差分析見表3.

表2 響應面試驗結(jié)果及分析Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 回歸方程各項方差分析Table 3 Analysis of variance of each term of the constructed regression equation

通過使用Design Expert8.0.6軟件對表3結(jié)果進行回歸擬合，得到總黃酮含量對液固比、丙酮水比、提取溫度、提取時間的回歸方程為:y=0.89-0.046A+0.037B +0.014C-0.037D-0.0120AB +0.022AC-0.012AD-0.16BC +0.018BD +0.080CD-0.24A2-0.21B2-0.13C2-0.27D2(y為總黃酮含量，A、B、C、D分別為上述4個自變量的編碼值).

由方差分析結(jié)果可得，模型 F=40.38，P＜0.0001，說明本實驗采用的模型很顯著.其中 PBC、PA2、PB2、PC2、PD2均小于0.0001達到高度顯著水平，PA、PB、PD、PCD均小于 0.05 達到顯著水平.在四個影響因素中液固比(A)對總黃酮含量影響最大，其次是丙酮水比(B)與不同提取時間(D)，提取溫度(C)影響最小.四個因素對總黃酮含量的影響不是簡單的線性關系，二次項同樣有很大的影響，而且丙酮水比與不同提取溫度，不同提取溫度與不同提取時間有極明顯的交叉作用.相關系數(shù)R2=0.9517，此值表明二次回歸方程可以很好地反應總黃酮含量的變化，實際實驗對模型擬合較好.同時失擬項不顯著也進一步證明回歸方程的可行性［14］.

2.3 響應面圖分析

根據(jù)回歸方程結(jié)果分析做出所擬合的響應曲面圖，表示液固比(A)、丙酮水比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)對總黃酮含量的影響.如圖5所示，圖中等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反.綜合比較6組圖可知:液固比對總黃酮含量的影響最為顯著，表現(xiàn)為響應曲線較陡;而丙酮水比和提取時間次之，尤其是提取溫度對總黃酮含量的影響，表現(xiàn)為響應曲線較為平滑，隨其數(shù)值的增加，響應值變化較?。?5］.

圖5 兩者的交互作用對總黃酮含量的等高線圖和響應面圖Fig.5 response surface and contour plots showing the effects of pair wise interactions of three factors on extraction rate

2.4 確定最佳工藝條件及驗證性試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件程序?qū)に嚄l件進行優(yōu)化，模型預測最佳方案為:液固比13.52 mL·g-1，丙酮水比 71:29，提取溫度54.82℃，提取時間2.97 h，在此條件下總黃酮含量可達0.893%.為了檢驗此法的可行性，采用上述最優(yōu)提取工藝條件進行平行試驗，同時考慮到方便實際操作等情況，修正最佳工藝條件為:液固比13.5 mL·g-1、丙酮水比70:30、提取溫度55℃、提取時間3 h，在該條件下進行三次平行試驗并取其均值為0.88%，低于預測值0.893%，誤差1.49%，這表明模型在預測各因素和提取率關系上有較高準確度，具一定的實用價值.

3 結(jié)論

采用酮類提取-氨水沉淀法對銀杏落葉中總黃酮進行提取，此方法國內(nèi)報道較少，所得提取率較高，與傳統(tǒng)乙醇-水法相比，提取工藝流程獨特，具有一定的創(chuàng)新性和實用性.通過單因素和響應面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝條件，最佳方案為:液固比13.52 mL·g-1，丙酮水比 71:29，提取溫度54.82℃，提取時間2.97 h，在此條件下總黃酮含量可達0.893%，得到了金葉銀杏落葉中總黃酮含量與各影響因素的模型，四個影響因素中液-固比對總黃酮含量影響最大，其次是丙酮-水比與不同提取時間，提取溫度影響最小.此模型回歸顯著，對試驗有較好的擬合.因此，采用響應面法優(yōu)化金葉銀杏落葉總黃酮提取工藝參數(shù)可靠，具有較好的實用價值.

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Optimization ofextraction process of flavonoids from Ginkgo biloba leaves by response surface methodology

LI Yu-wei，WANG Xiao-ling
(Ethnic Pharmaceutical Institute，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C)

This paperinvestigated optimization of extraction process of flavonoids fromGinkgo bolibaleaves and studiedthe effect of the single-factor liquid-solid ratio，acetone-water ratio，extraction temperature，and processing time on the content of flavonoids to optimize the extraction condition of flavonoids inGinkgo bolibaleaves combined with response surface methodology.The results indicated that the content of flavonoids reached 0.893%under the conditions of liquid-solid ratio13.52mL·g-1，acetonewater ratio 71:29，extraction temperature 54.82℃，and processing time 2.97 h.

response surface methodology(RSM);Ginkgo biloba;flavonoids;process optimization

R284

A

2095-4271(2015)06-0701-07

10.11920/xnmdzk.2015.06.008

2015-08-26

王曉玲(1969－)，女，漢族，四川資陽人，教授，博士，研究方向為天然藥物化學。E－mail:wxl3232@sina.com

四川省科技支撐計劃項目(編號:2015SZ0040)

(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏;英文編輯:周序林，鄭玉才)