HPLC 同步檢測肥豬散中兒茶素、間苯三酚、二苯乙烯苷三種活性成分的研究

姚 丹 ， 胡昭偉 ， 王宏軍 ， 單文琪 ， 王 培

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.錦州市北山農(nóng)墾有限責(zé)任公司，遼寧錦州121000）

肥豬散源自《中國獸藥典》（2020 版），由黃豆與麥芽、制何首烏、綿馬貫眾三味中草藥組成，具有消食開胃、促長催肥、導(dǎo)滯驅(qū)蟲的作用。 閆立志（2018）用HPLC 檢測分析了肥豬散醇提物中的間苯三酚、二苯乙烯苷的含量，且證明該提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性；單乃榮等（2017）建立了肥豬散中制何首烏的薄層色譜（TLC）定性鑒別法；郭芳茹等（2015）研究表明，肥豬散發(fā)酵制劑能夠增加消化不良家兔模型的體重和進(jìn)食量，調(diào)整胃酸量和胃蛋白酶的活性；郭芳茹等（2016）采用固態(tài)發(fā)酵法優(yōu)化肥豬散發(fā)酵制劑最佳發(fā)酵工藝， 獲得最適宜的發(fā)酵菌株為納豆芽孢桿菌，且游離大豆異黃酮含量高。目前鮮見對該組方中其他成分的HPLC 檢測。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以50%乙醇為提取溶劑， 建立了HPLC 同步測定肥豬散中 2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、（+）-兒茶素、間苯三酚的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀：L-7420（日本日立公司），配四聯(lián)泵、脫氣泵、紫外檢測器和柱溫箱；色譜柱：島津 InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（天津市尚亞科技發(fā)展有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-5203 型（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波清洗器：KQ-300B（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要試劑 乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；磷酸（分析純，天津南開大學(xué)精細(xì)化工股份有限公司）。麥芽、制何首烏、綿馬貫眾，購自遼西國藥店；黃豆購自市場；2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、（+）-兒茶素、 間苯三酚對照品，購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 色譜條件 流動相：甲醇- 0.1%磷酸水梯度洗脫，有機(jī)相洗脫梯度為：0 ～ 10 min，10% ～ 30%甲醇；10 ～ 40 min，30% ～ 60%甲醇；40 ～ 50 min，60%甲醇；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

1.4 樣品處理 將制何首烏、綿馬貫眾、麥芽、黃豆分別粉碎，按照《中國獸藥典》收載處方配比即制何首烏：綿馬貫眾：麥芽：黃豆=3:3:50:50，準(zhǔn)確稱量5 g，加入80 倍的 50%乙醇，回流提取4 h，提取3 次，合并提取液，減壓濃縮，干燥即得肥豬散提取物；準(zhǔn)確稱取提取物0.1027 g，加8 mL 甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm 針頭濾器過濾，即為待測樣品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性考察 將 2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷對照品用甲醇稀釋成0.5 ~ 2.5 mg/L 的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液，將（+）-兒茶素、間苯三酚對照品用甲醇稀釋成0.25 ～2.0 mg/L 的系列工作標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行液相色譜分析。 每個濃度重復(fù)測定3 次，取平均值繪制色譜峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 加樣回收率 精密稱取肥豬散提取物粉末6 份，每份2.5 mg，置于 5mL 容量瓶中，分別加入一定體積的2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、（+）-兒茶素、間苯三酚對照品溶液，按1.4 中制得待測樣品溶液，按1.3 中的色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄各組分峰面積，分別計算各組分RSD 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 由圖1 可知， 在優(yōu)化的色譜分離條件下，間苯三酚、（+）-兒茶素、2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷獲得了良好的分離，且3 種化合物的保留時間分別為 6.398、14.398、26.065 min。

圖1 樣品和對照品HPLC 色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將對照品系列濃度分別進(jìn)樣檢測，以色譜峰面積（S）和對照品濃度（C，mg/L）作線性回歸。 在 0.5 ～ 2.5 mg/L，2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為S = 4×106C – 62986，R2=0.9968；在 0.25 ～ 2.0 mg/L，（+）-兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 S=2×106C-6375.7，R2=0.9957， 間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為 S=1×106C-4350.3，R2=0.9937。

2.3 加樣回收率 由表 1 可知，2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷平均回收率為（98.84±1.92）%，RSD 值為 1.94%；(+)-兒茶素平均回收率為（99.60±1.13）%，RSD 值為 1.13%； 間苯三酚平均回收率為（97.40±1.59）%，RSD 值為 1.63%。

表1 加樣回收率

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用上述建立的方法測定了在12 h 內(nèi)不同時間段樣品中二苯乙烯苷、 兒茶素、間苯三酚的含量，每個時間段重復(fù)進(jìn)樣5 次，6個時間段中 2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄苷、（+）-兒茶素、 間苯三酚含量的 RSD 值分別為1.17%、3.31%和2.30%，符合《中國獸藥典》附錄“獸用中草藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的規(guī)定，表明高效液相色譜儀精密度較好。

3 討論

HPLC 檢測分析中草藥活性成分是目前最常用且最為方便的檢測方法之一。 馮彥欽等（2015）分別采用UV 法和HPLC 法檢測何首烏中二苯乙烯苷的含量，含量相差<1.4%。 本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也采用UV 法和HPLC 法檢測提取物中的有效成分含量，結(jié)果分別為6.89%和5.95%，含量相差0.94%，表明兩種方法用于肥豬散有效成分含量檢測的結(jié)果均準(zhǔn)確可靠，HPLC 法檢測含量分辨率和重復(fù)性高；而UV 法簡便、快速，適合樣品的快速分析。 劉燕和晁若冰（2009）用 HPLC 檢測出何首烏中具有兩種不同的蒽醌類活性成分；劉釗等（2011）同樣用HPLC 檢測出綿馬貫眾中具有抗病毒作用的間苯三酚活性成分；但以上實(shí)驗(yàn)都是檢測單味藥中的活性成分，而本實(shí)驗(yàn)是以含有制何首烏、綿馬貫眾的肥豬散提取物作為檢測對象，在優(yōu)選的液相條件下，能夠同步鑒定分析二苯乙烯苷、 間苯三酚及兒茶素三種成分，通過對線性、重復(fù)性、加樣回收率的測定顯示該方法基線穩(wěn)定，重復(fù)性、線性關(guān)系良好，三種組分分離理想，回收率高，滿足檢測需求，表明建立的檢測條件適用于肥豬散提取物相關(guān)活性成分的檢測分析。 對于圖譜中未標(biāo)明的成分，可以用相同的提取條件對單味藥進(jìn)行提取，在同等色譜條件下對其進(jìn)行成分檢測，可以確定未標(biāo)明成分的歸屬，有助于鑒定其化學(xué)成分，也可以通過HPLCMS 聯(lián)用設(shè)備鑒定分離效果好的其他化合物。

4 結(jié)論

在檢測波長為254 nm 條件下，以甲醇-0.1%磷酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫， 可以同步檢測到肥豬散提取物中間苯三酚、（+）-兒茶素、2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷三種成分，該方法可以作為肥豬散上述主要活性成分含量檢測的一種理想手段。