紅色毛癬菌基因分型技術(shù)研究進(jìn)展

程本霖 朱敏

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

·綜述·

紅色毛癬菌基因分型技術(shù)研究進(jìn)展

程本霖 朱敏

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

紅色毛癬菌是皮膚癬菌中最常見的致病菌，可引起皮膚淺部的各種癬病，也可引起皮膚的深部感染，甚至多器官的播散性感染。紅色毛癬菌形態(tài)多樣，且不穩(wěn)定，其所致疾病容易反復(fù)發(fā)作，臨床上治療往往非常棘手。對紅色毛癬菌進(jìn)行基因分型可以有助于解答復(fù)發(fā)和再感染的問題，也可從分子水平闡明疾病的流行傳播情況，對疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。本文試對紅色毛癬菌基因分型技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行概述。

紅色毛癬菌；基因型；分型技術(shù)

紅色毛癬菌是最常見的淺部致病真菌，可侵犯皮膚角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板，導(dǎo)致各種癬病，也可侵犯皮下組織引起Majocchi肉芽腫、蜂窩狀毛囊炎、足菌腫、膿腫、疣狀增生，甚至血源性播散等多種類型的深部感染[1-3]。紅色毛癬菌引起的感染易反復(fù)發(fā)作，對紅色毛癬菌進(jìn)行種內(nèi)分型研究可以幫助解答“再感染”或“復(fù)發(fā)”的問題；也可以了解基因型與菌落特征、藥物敏感性或毒力之間的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)其表型與基因型間的相互關(guān)系；還能有效地幫助評估菌株在種群中的消長，了解其流行病學(xué)特征，追蹤傳染源，防止爆發(fā)感染。目前，臨床上對于紅色毛癬菌的分型以形態(tài)學(xué)特征為主，極易造成主觀上的判斷錯誤，表型與臨床的相關(guān)性極不穩(wěn)定，分辨率有限。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因分型是近年來重點探索的紅色毛癬菌種內(nèi)分型方法，各種技術(shù)不斷出現(xiàn)。本文試對紅色毛癬菌基因分型技術(shù)作一綜述。

1 基于線粒體DNA (mtDNA)分析技術(shù)

線粒體DNA (mtDNA)在細(xì)胞核外，與細(xì)胞核DNA一樣具有特定的基因型。與基因組DNA相比，mtDNA分子相對要小，常常被用于皮膚癬菌系統(tǒng)發(fā)育及鑒別的研究。de Bièvre等[4]利用限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)分析，將純化得到的mtDNA進(jìn)行酶切，將紅色毛癬菌分為兩群 (Ⅰ和Ⅱ)，然而發(fā)現(xiàn)分型與菌落形態(tài)的差異或與菌株地理分布并無關(guān)聯(lián)性。Nishio等[5]將內(nèi)切酶增至5種 (HaeⅢ,MspⅠ,Hind Ⅲ,XbaⅠ及BglⅡ)，所得到的結(jié)果與前相同，可分為兩群。與其他菌種的mtDNA比較，紅色毛癬菌Ⅰ型的mtDNA酶切圖譜與Arthrodermabenhamiae遺傳關(guān)系相近，而Ⅱ型的mtDNA酶切圖譜與斷發(fā)毛癬菌及須癬毛癬菌goetzii變種基本一致，這說明傳統(tǒng)的紅色毛癬菌分類并不能反映在遺傳學(xué)上的真實地位。但必須注意的是，線粒體有自己獨立的基因組,與細(xì)胞核內(nèi)的DNA在分子量、堿基的比例及序列均不相同。因而mtDNA的分析尚不能全面體現(xiàn)總基因組的特征，而且mtDNA片段較小，其限制酶切位點也較少。因此，mtDNA-RFLP分析對某些種屬關(guān)系較為相近的皮膚癬菌要比種屬關(guān)系較遠(yuǎn)的分辨率低[6]。

2 隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)

隨機擴增多態(tài)性DNA (randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)利用合成隨機排列的寡核苷酸單鏈為引物，在寬松條件下，通過PCR反應(yīng)擴增基因組DNA，擴增后的DNA片段經(jīng)凝膠電泳后顯影，而顯示特異性條帶 (fingerprint)。Baeza等[7]使用隨機引物primer1 (5'-GGTGCGGGAA-3')和primer6 (5'-CCCGTCAGCA-3')對67株紅色毛癬菌模板DNA進(jìn)行擴增，電泳后分別顯示出12種及11種帶型。成曉茹等[8]利用自行設(shè)計的5對隨機引物，將46株源于三地不同表型的紅色毛癬菌分為5種亞型。然而，并未發(fā)現(xiàn)其基因型與表型的相關(guān)性。RAPD非常適合在缺少基因組相關(guān)信息時使用,此法敏感、快速，但受限于PCR條件，對引物、模板濃度、退火溫度、模板DNA品質(zhì)有較高的要求，且重復(fù)性較差。

3 限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)

RFLP除了用于上述的mtDNA外，更多用于基因組DNA。只要內(nèi)切酶合適，此法除了在種間水平進(jìn)行鑒定外，還可用于菌株種內(nèi)分型研究。Jackson[9]將紅色毛癬菌臨床分離株DNA利用內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行酶切后，再與紅色毛癬菌特異性探針用DNA印跡方法進(jìn)行雜交，將50株紅色毛癬菌臨床分離株分為14型 (A～N型)，其中A～D型占78%，未發(fā)現(xiàn)表型、致病部位、地區(qū)與基因型的關(guān)聯(lián)性。國內(nèi)李喬等[10]用上述方法，將49株臨床分離菌株分為20型 (A～T型)，A～C型占48.98%，推測A～C型可能致病性較強，但有待進(jìn)一步證實。

4 基于紅色毛癬菌核糖體rDNA非轉(zhuǎn)錄區(qū) (NTS)的基因分型

上述提及Jackson等[9]利用了內(nèi)切酶EcoR I酶切消化后，再用特異性探針進(jìn)行DNA印跡雜交 (Southern blotting)，發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌基因多態(tài)性存在于rDNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū) (NTS)中。測序后發(fā)現(xiàn)，NTS存在著兩個串聯(lián)重復(fù)序列TRS-1與TRS-2。故先利用NTS區(qū)的特異性引物 (25SCON2、NS1-R)擴增出NTS作為模版，再各自利用TRS-1及TRS-2區(qū)的特異性引物 (TrNTSF-2、TrNTSR-4和TrNTSF-2、TrNTSR-4)擴增出TRS-1及TRS-2。結(jié)果TRS-1的PCR指紋圖可分為3型，TRS-2可分為兩型。Baeza等[7]也得到同樣結(jié)果。之后Jackson[11]結(jié)合TRS-1及TRS-2指紋圖，將101株紅色毛癬菌分為23種基因型。國內(nèi)李民等[12]也利用上述方法，將20株紅色毛癬菌臨床分離株分為4種基因型。這是由于NTS區(qū)進(jìn)化速率最快，同一菌種內(nèi)不同株之間堿基序列可以見到差別。

5 微衛(wèi)星多態(tài)性分析

微衛(wèi)星多態(tài)性 (microsatellite polymorphism)分析又稱為簡單序列重復(fù) (simple sequence repeat，SSR)分析，是近十年來發(fā)展完善起來的一種新的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星由約1～6個bp為重復(fù)單位所組成的短的串聯(lián)重復(fù)序列。最常見的是雙核苷酸重復(fù)，也有少量是三或四核苷酸為重復(fù)單位，一般重復(fù)10～60次。這種多態(tài)性是由于核心重復(fù)單位不同以及重復(fù)次數(shù)不同而形成的長度多態(tài)性。在核心序列的兩端側(cè)翼是相對保守的序列，可利用這些保守序列設(shè)計引物并進(jìn)行PCR擴增分析。多位點微衛(wèi)星分析 (multilocus microsatellite typing,MLMT)可用來發(fā)現(xiàn)紅色毛癬菌菌株的變異，以更好地了解其發(fā)病機制、地域分布、流行病學(xué)特征等。Ohst等[13]利用微衛(wèi)星位點 (T1)成功地在130株紅色毛癬菌與紫色毛癬菌中找到4個等位基因，分析結(jié)果顯示紅色毛癬菌復(fù)合體起源于非洲，后來在亞洲出現(xiàn)一個新的基因型，并隨后流行于歐洲大陸及美國。之后Graser等[14]用了22個微衛(wèi)星位點，把233株紅色毛癬菌分為55種基因型，并顯示基因型與感染部位及地域起源有一定的相關(guān)性。目前MLMT技術(shù)多基于熒光毛細(xì)管電泳的PCR分型方法，該方法使用測序儀的熒光毛細(xì)管電泳代替?zhèn)鹘y(tǒng)的瓊脂糖電泳或聚丙烯酰氨凝膠電泳，分型更加客觀準(zhǔn)確。

6 PCR解鏈曲線圖形 (PCR-MP)

PCR解鏈曲線圖形 (PCR melting profile,PCR-MP)技術(shù)是建立在連接介導(dǎo)PCR (ligation-mediated PCR,LM-PCR)之上的，由鑒定細(xì)菌發(fā)展而來的方法[15]。PCR-MP其原理是在PCR過程中，在較低的變性溫度下，較不穩(wěn)定的DNA片段 (較低含量的G+C片段)變性，成為模板而被擴增的結(jié)果。如今，此技術(shù)已被成功地利用于皮膚癬菌及念珠菌的分型[16]。Leibner-Ciszak等[17]用兩種限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ及BamH Ⅰ分析，分別酶切消化了11株紅色毛癬菌，再利用PCR-MP方法得到了相兼容的DNA指紋。相比RAPD法，11株紅毛中獲得了5種基因型(A～E型)，而PCR-MP又從6株RAPD法判為A型的紅毛當(dāng)中分出了亞型A1型，其余的B～E型分別代表了某一分離株。由此可知，PCR-MP得到了比RAPD更高的分辨率。

7 全基因組重測序

近幾年來，快速發(fā)展起來的全基因組測序 (whole genome sequencing,WGS)技術(shù)是一個可以發(fā)現(xiàn)在同一種內(nèi)高度可變區(qū)域 (highly variable regions)的方法。2012年，紅色毛癬菌及其他4種皮膚癬菌基因組已被完成測序。分析顯示，紅色毛癬菌及其他皮膚癬菌富含LysM結(jié)構(gòu)域，此域與結(jié)合于細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)有關(guān)。此外，還含有大量二級代謝產(chǎn)物的酶類基因及編碼相關(guān)激酶的基因，但具體功能尚不清楚[18]。之后，另有10余株紅色毛癬菌也被進(jìn)行了全基因組測序，并且，所有數(shù)據(jù)均可在NCBI進(jìn)行共享。全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進(jìn)行基因組測序，并與參考基因組比對，對個體或群體進(jìn)行差異性分析，如單核苷酸多態(tài)性 (SNP)、插入缺失 (Insertion/Deletion，InDel)、結(jié)構(gòu)變異位點 (Structure Variation，SV)、重復(fù)序列等。第二代測序技術(shù) (Next-generation sequencing)為邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。相對于Sanger為代表的第一代DNA測序，其通量高、測序時間短，在物種的基因組深度測序上具有優(yōu)勢[19-20]。但其讀長短，仍然需要PCR擴增后再檢測。以單分子測序為特點的第三代DNA測序技術(shù)也已出現(xiàn)，測序過程無需進(jìn)行PCR擴增，其讀長更長、精度更高、結(jié)果更快。

8 小結(jié)與展望

復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，紅色毛癬菌的基因分型研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他多種常見真菌，這可能與紅色毛癬菌基因組高度保守、低度多樣性有關(guān)。目前，擴增NTS區(qū)內(nèi)的可變數(shù)重復(fù)區(qū)域或微衛(wèi)星位點之類的PCR引物方法已經(jīng)應(yīng)用于紅色毛癬菌基因分型中，但其結(jié)果不甚理想，分型技術(shù)仍然有很多上升空間。隨著DNA測序技術(shù)不斷地發(fā)展以及成本的降低，全基因組重測序?qū)⒂型麘?yīng)用于紅色毛癬菌的種內(nèi)分型及分子流行病學(xué)研究，并將有助于了解菌種的代謝物組、蛋白質(zhì)組、功能基因組等，從而更好地探索其流行特征、致病機制、抗菌藥物靶點等。

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[本文編輯] 王 飛

Research progress on genotyping technology forTrichophytonrubrum

CHENG Ben-lin,ZHU Min

(DepartmentofDermatology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040)

Trichophytonrubrumis the most common one in dermatophytes,not only causing superficial cutaneous tinea but also subcutaneous deeper infections,and even disseminated infections.The morphology ofT.rubrumis varied and unstable.The infection due toT.rubrumis prone to recurrence,a big problem in clinic.Genotyping ofT.rubrumcan help to solve the question of relapse and reinfection,and can also be used to clarify the prevalence of the disease from molecular level.It is of great significance for the prevention and treatment of the disease.This paper is an overview of the progress on the genotyping technology ofT.rubrum.

Trichophytonrubrum；genotype；genotyping technology

62-64]

程本霖，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:cblhsyy@126.com

朱敏,E-mail:zhumin3000@hotmail.com

R 379.2

A

1673-3827(2017)12-0062-03

2016-11-28