赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比較研究

陳景明，黃曉冬，蔡建秀，方小玲，陳 玲

（1.泉州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000）

赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比較研究

陳景明1，黃曉冬2*，蔡建秀2，方小玲2，陳 玲2

（1.泉州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000）

通過測(cè)定1，1-二苯基-2-苦基肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、還原力、金屬離子對(duì)其抗氧化活性的影響及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)等比較赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的抗氧化活性。結(jié)果表明：赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位清除DPPH的EC50為0．63、0．10 mg/mL；還原力的EC50分別為0．87、0．09 mg/mL。除Al3+、Fe3+外，K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金屬離子對(duì)赤楠葉乙酸乙酯部位的DPPH清除作用為抑制作用；除Cu2+、Ca2+外，K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等金屬離子對(duì)赤楠葉二氯甲烷部位的DPPH清除能力有促進(jìn)作用。赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9．23%與59．17%。可見，赤楠葉乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的抗氧化活性與總酚含量，但其抗氧化活性較易受金屬離子的拮抗作用。

赤楠葉；二氯甲烷部位；乙酸乙酯部位；抗氧化活性；總酚

赤楠（Syzygium buxifolium Hook.et.Arn）系桃金娘科蒲桃屬灌木或小喬木植物，廣泛分布于在我國(guó)長(zhǎng)江中下游以南省份，資源較為豐富，福建各地極常見[1]。藥用記載赤楠根、莖、葉具有健脾、平喘、利濕等功效，根還可治燙火傷，葉可治手指瘡[2]，臨床報(bào)道赤楠對(duì)消除肝病蜘蛛痣也有一定療效[3]，是一種待開發(fā)的藥源植物。周法興等[4]從其根莖中分離鑒定出木栓酮、β-谷甾醇、烏蘇酸、19-羥基烏蘇酸、齊墩果酸及胡蘿卜甙等6種化學(xué)成分。黃曉冬等[5-9]的研究發(fā)現(xiàn)赤楠葉提取物具有較強(qiáng)的抗菌活性，并富含總黃酮。目前尚未見赤楠葉提取物抗氧化性能的研究報(bào)道。本文以福建省惠安產(chǎn)赤楠葉為原料，對(duì)其醇提取物的二氯甲烷萃取部位與乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行體外抗氧化活性與總酚含量的比較，為赤楠葉提取物作為天然抗氧化劑的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 赤楠葉提取物的制備

赤楠葉采自福建省惠安筆架山，去雜洗凈后自然陰干，粉碎成粉末，過孔徑178 um（80目）篩，按料液比1∶10（g/L）加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡7 d/次，浸泡3次。抽濾并匯集浸提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空旋轉(zhuǎn)濃縮至無醇味，再以石油醚充分萃取去除葉綠素、脂類、蠟質(zhì)等非極性成分，再以二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，獲得相應(yīng)的二氯甲烷部位（DCMF）與乙酸乙酯部位(EAF)。

1.2 赤楠葉提取物抗氧化活性的體外檢測(cè)

1.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照陸占國(guó)等[10]的方法略加修改。在試管中分別加入樣液(以DMSO配制)0.2 mL、4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6×10-5mol/L的DPPH甲醇液，混勻，15 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度A1；以等體積的DMSO代替樣液，測(cè)得吸光度A0；以等體積的甲醇代替DPPH甲醇液測(cè)得本底值A(chǔ)2。按下式計(jì)算樣液對(duì)DPPH自由基的清除率C%＝[A0-(A1-A2)]/A0×100%，以2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）、維生素C為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。

1.2.2 還原力測(cè)定

采用蔡建秀等[11]的測(cè)定方法。樣液(以DMSO配制)1.0 mL與2.5 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）混合，加入1.0%鐵氰化鉀2.5 mL，50℃恒溫水浴20 min，冰浴冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心10 min。離心后取上層清液2.5 mL，加入2.5 mL H2O和2.5 mL 0.1%FeCl3混合均勻，隨即700 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)樣液濃度作圖，擬合方程并求出吸光度為0.500時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，作為EC50。以維生素C為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。

1.2.3 金屬離子對(duì)樣品DPPH自由基清除能力影響的測(cè)定

參照黃曉冬等[12]的方法。選取樣品對(duì)DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣液濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在總體積為5.0 mL的DPPH自由基清除反應(yīng)體系（0.2 mL樣液+4.0 mL DPPH甲醇液+0.8 mL H2O）中加入MnCl2、CuCl2、MgCl2、AlCl3、ZnCl2、KCl、NaCl、CaCl2、FeCl3等金屬鹽，使體系中金屬離子的質(zhì)量體積濃度為1.0 mg/mL。搖勻混合15 min后，于517 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，同時(shí)以甲醇代替DPPH甲醇液測(cè)定體系本底值，以不加金屬離子為空白對(duì)照，求出DPPH自由基清除率并按下式計(jì)算影響率/%=(加金屬離子后的DPPH自由基清除率－空白對(duì)照DPPH清自由基除率）/空白對(duì)照DPPH自由基清除率×100%，并以此評(píng)價(jià)金屬離子對(duì)樣品自由基清除活性的影響。

1.3 總酚含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定采用福林酚法，含量以等量沒食子酸（GAE）表示[13]。在1.0 mL樣液中加入1.5 mL ddH2O，10倍稀釋的福林酚試劑0.5 mL，震蕩，待反應(yīng)物充分混勻1 min后，加入1.0 mL20%碳酸鈉溶液，置37℃暗處，使樣品充分反應(yīng)30 min。然后在波長(zhǎng)為750 nm處測(cè)其吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比較

2.1.1 DPPH自由基清除率的比較

DPPH自由基是一種人工合成的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的自由基，由于DPPH自由基清除法反應(yīng)穩(wěn)定、現(xiàn)象明顯、條件容易控制，因此已廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)的抗氧化活性評(píng)價(jià)和篩選。赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖1所示。由圖1可知，赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位對(duì)DPPH自由基的清除率均隨樣液濃度增加而增大，具有明顯的量效關(guān)系。經(jīng)回歸方程分析，計(jì)算出赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位與BHT對(duì)DPPH自由基清除的半效應(yīng)濃度EC50分別為0.63，0.10與0.30 mg/mL。可見，赤楠葉乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除明顯強(qiáng)于二氯甲烷部位與BHT，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 DPPH清除能力比較

2.1.2 總還原力的比較

從氧化還原反應(yīng)過程看，易被氧化的物質(zhì)須加入一些比它更易被氧化的化合物作為抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用，還原能力越強(qiáng)的物質(zhì)更易被氧化，因而其抗氧化活性也越強(qiáng)。赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的總還原力如圖2所示。若以吸光度為0.500時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為EC50，測(cè)得赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位與Vit C總還原力的EC50分別為0.87，0.09，0.91 mg/mL。赤楠葉乙酸乙酯部位的總還原力顯著強(qiáng)于二氯甲烷部位與Vit C（P＜0.05）。

圖2 二氯甲烷提取物與乙酸乙酯提取物總還原能力比較

2.1.3 金屬離子對(duì)樣品DPPH清除率影響的比較

分別考察不同金屬離子對(duì)赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位DPPH清除率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 金屬離子對(duì)赤楠葉DPPH自由基清除的影響

由圖3可知，9種金屬離子對(duì)赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位DPPH清除率的影響差異較大，Al3+、Fe3+等金屬離子對(duì)赤楠葉乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除的影響率分別為55.96%與72.77%，表現(xiàn)為增效作用，但K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金屬離子對(duì)赤楠葉乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除的影響率分別為-1.80%、13.31%、-1.00%、-1.70%、-10.51%、-80.98%、-2.80%，均表現(xiàn)為抑制作用，其中以Zn2+的抑制作用最強(qiáng)。對(duì)赤楠葉二氯甲烷部位DPPH自由基清除率的影響表現(xiàn)為加入Cu2+、Ca2+等金屬離子后，DPPH自由基清除率分別由59.52%降為23.03%與55.57%，影響率分別為-61.31%與-6.63%，呈現(xiàn)抑制作用，但K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等金屬離子對(duì)二氯甲烷部位DPPH自由基清除率的影響表現(xiàn)為增效作用，以Fe3+的增效作用最強(qiáng)，影響率為30.02%。

2.2 赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

經(jīng)福林酚法測(cè)定，赤楠葉二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（9.23±0.33）%，（59.17±1.02）%。顯然，赤楠葉的酚類物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯部位，這或許是乙酸乙酯部位抗氧化活性能力較高的原因。

3 結(jié)語

機(jī)體中保持一定量的自由基有利于細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)、解毒等，但是當(dāng)自由基量積累過多時(shí)又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡，誘發(fā)惡性腫瘤等。正常機(jī)體內(nèi)會(huì)通過產(chǎn)生抗氧化物酶來清除與修復(fù)過量的自由基，使自由基代謝處于一種動(dòng)態(tài)的平衡[14]，從外界攝入一定量的抗氧化劑也能起到對(duì)體內(nèi)自由基的清除作用。這使得從植物中篩選出安全性、高效性的抗氧化劑或自由基清除劑應(yīng)用于食品保鮮保存、藥品、化妝品等成為研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，赤楠葉乙酸乙酯部位對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除作用以及總還原力均明顯強(qiáng)于二氯甲烷部位；K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金屬離子對(duì)乙酸乙酯部位的DPPH清除作用均表現(xiàn)為抑制作用，K+、Mg2+、Na+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等對(duì)二氯甲烷部位的DPPH清除能力有促進(jìn)作用。這可能與赤楠葉乙酸乙酯部位總酚物質(zhì)含量較高有關(guān)。酚類物質(zhì)由于具有酚羥基表現(xiàn)出較高的還原力與自由基清除能力，但一些酚類物質(zhì)也易與金屬離子螯合沉淀而可能影響其生物活性。可見，在開發(fā)赤楠葉乙酸乙酯部位作為抗氧化劑時(shí)應(yīng)注意金屬離子的不良影響，并注重對(duì)其酚類物質(zhì)的純化、分離與活性追蹤。

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Comparative Study onAntioxidantActive of Dichloromethane Fraction and Ethyl Acetate Fraction from Syzygium Buxifolium Leave

CHEN Jing-ming1，HUANG Xiao-dong2，CAI Jian-xiu2，F(xiàn)ANG Xiao-ling2，CHEN Ling2
(1.Quanzhou Preschool Education College；2.FujianAdvanced Education Key Laboratory of Inshore Resources Biotechnology,Quanzhou Normal University,Quanzhou,Fujian 362000,China)

The antioxidant activity of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction of Syzygium buxifolium leaf was compared by measuring of DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical scavenging capacity,reducing power,effects of metal ions on antioxidant activity and total phenolic content.The results showed that the EC50 value of DPPH radical scavenging capacity by dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction from Syzygium buxifolium leaf was 0.63 mg/mL and 0.10 mg/mL,respectively.The reducing power EC50 value of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction was 0.87mg/mL and 0.09 mg/mL,respectively.In addition to Al3+and Fe3+,metal ions including K+,Na+,Mn2+,Mg2+,Cu2+,Zn2+,Ca2+had inhibitory effect to DPPH radical scavenging by ethyl acetate fraction,while metal ions including K+,Na+,Mn2+,Mg2+,Al3+,Zn2+,Fe3+had enhancement effect to DPPH radical scavenging by dichloromethane fraction except Cu2+,Ca2+.Total phenolic content of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction was 9.23%and 59.17%,respectively.These results indicate that ethyl acetate fraction of Syzygium buxifolium leaf has stronger antioxidant activity and higher total phenolic content,but its antioxidant activity may be prone to antagonism of metal ions.

Syzygium buxifolium leaf；dichloromethane fraction；ethyl acetate fraction；antioxidant activity；total phenols

R285.5

A

1673-1891（2016）04-0011-03

10.16104/j.issn.1673-1891.2016.04.004

2016-06-24

泉州市第二批科技項(xiàng)目(2013Z126)。

陳景明（1966—），男，福建泉州人，副教授，研究方向：資源動(dòng)植物學(xué)。*為通信作者。