基于PCR技術(shù)的羊肉成分溯源鑒定檢測方法研究

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及生活水平的提高，人們對食品安全的關(guān)注度日益提高，肉類食品摻假問題越來越受到重視。目前，對肉類食品摻假的鑒定方法多樣，主要包括形態(tài)分析、代謝產(chǎn)物分析、蛋白質(zhì)分析、核酸分析等。其中，以DNA檢驗技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR檢測是一種較為全面的檢測方式，也是目前最具權(quán)威性的一種檢驗方法，在羊肉成分溯源鑒定中被廣泛使用。本文重點闡述了以DNA檢驗為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)在羊肉成分溯源鑒定中的應(yīng)用。

一、羊肉質(zhì)量現(xiàn)狀

當(dāng)下，羊肉摻假現(xiàn)象屢禁不止，市場上有很多以鴨肉、豬肉等肉類為原料制作的羊肉卷，這種肉類的原料來源不明或已變質(zhì)，很可能會對消費者造成傷害；還有些偽劣羊肉中過量添加色素、香精及其他違禁物質(zhì)，長時間食用會增加人體肝臟的負(fù)荷，對人體健康造成威脅。

羊肉造假摻假現(xiàn)象之所以屢禁不止，根源就在于高利潤。首先，羊的生長時間較長，且生育率較低，生產(chǎn)成本較高，因此與豬肉、雞肉、鴨肉等相比，羊肉的市場價就更高。其次，羊肉具有較高的營養(yǎng)價值，比豬肉的肉質(zhì)要細(xì)嫩，比豬肉、牛肉的脂肪、膽固醇含量都要少，容易被人體消化吸收，能提高身體免疫力?；谏鲜鰞纱笤?，羊肉的價格一直居高不下，這就導(dǎo)致一些不法分子和不法商家會摻入劣質(zhì)肉來獲取高額利潤。

二、基于PCR技術(shù)的羊肉成分檢測方法研究

1.常規(guī)PCR。常規(guī)PCR技術(shù)最早應(yīng)用于食品中的微生物分析領(lǐng)域。譚慧敏團(tuán)隊利用此法測定了5種不同種類共計56個肉類原料，摻假發(fā)生率為75%。張誼團(tuán)隊主要以線粒體cytB為目標(biāo)，對其進(jìn)行了引物的設(shè)計，利用多種PCR的檢測方式識別了牛肉中存在的其他肉類（牛肉、水牛肉）成分；項愛麗團(tuán)隊以線粒體16 SrRNA為基礎(chǔ)，構(gòu)建一對普通的引物，利用雙重 PCR的方式識別出在混合肉中存在的多種類肉成分；李志敏團(tuán)隊瞄準(zhǔn)了羊的線粒體D環(huán)一個特殊的目標(biāo)區(qū)域，對其設(shè)計引物，并使用高種屬PCR的方式識別摻假羊肉，這種方式的靈敏度為0.1%，羊肉DNA的檢測限可以達(dá)到1pg。

總之，常規(guī)PCR具有很高的靈敏度和特異性，但由于不是在封閉管道中進(jìn)行，因此樣品有被污染的可能。

2.實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR技術(shù)實質(zhì)上就是對DNA進(jìn)行定量分析，有兩種方法，一種是Taq法，另一種是SYBR Green法。

吳海晶等采用探針Taq法檢測鴨源摻假，在鴨肉和羊肉混合料中檢測到1%的鴨源成分，檢出限達(dá)到10fg。對比Taq法，SYBR Green法通過將熒光基團(tuán)添加到反應(yīng)系統(tǒng)中，在PCR指數(shù)放大過程中對熒光信號進(jìn)行連續(xù)監(jiān)控，對特異性產(chǎn)物的數(shù)量進(jìn)行實時監(jiān)控，對目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。史瑩瑩等采用MY作為通用引物，采用SYBR熒光定量PCR技術(shù)，對市場上常見肉類（豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、鴨肉、雞肉）進(jìn)行了DNA提取和檢測，成功檢測到了各種肉品的DNA，對于含有1%豬肉的模擬肉品，其檢測限為0.1ng，對于含有0.1%羊肉的模擬肉品，也能檢測到羊肉成分，其檢測限為0.01ng。陳傳君團(tuán)隊利用RT-PCR技術(shù)，以線粒體蛋白B作為目標(biāo)基因，對豬肉、牛肉、羊肉中的摻假物進(jìn)行了快速、準(zhǔn)確的分析，并在火腿腸中檢出了豬肉、牛肉、羊肉。

綜上所述，熒光定量PCR技術(shù)自動化程度高、特異性強、靈敏度高，還可以實現(xiàn)實時性及高定性、定量判斷。但是，這種方法的使用條件非?？量蹋页杀疽脖瘸Ｒ?guī)PCR要高得多。

3.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型的基于LAMP技術(shù)的DNA等溫擴增技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性、快速簡單等優(yōu)勢，無需復(fù)雜、昂貴的熱循環(huán)儀器和后放大步驟，最低靈敏度達(dá)到4個拷貝/反應(yīng)。但該技術(shù)也有缺點，在檢驗過程中要設(shè)計的引物比較多，操作過程也比較繁瑣，沉淀的可視化難度較高，特別是在目標(biāo)DNA的含量較少以及存在較高的相互影響情況下，會影響到檢驗結(jié)果。

4.數(shù)字PCR技術(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)（DPCR）是最近20年出現(xiàn)的第三代PCR技術(shù)，這是一種基于常規(guī)PCR原理與Poisson統(tǒng)計分布相結(jié)合的新型PCR技術(shù)。唐廷廷團(tuán)隊以羊和牛單拷貝的生長激素GH為特異的基因，設(shè)計了特異的引物和探針，利用液滴型DPCR技術(shù)對羊和牛單拷貝中的鴨源成分進(jìn)行了分析，并將牛單拷貝的數(shù)量與牛單拷貝的重量進(jìn)行了直線相關(guān)分析，從而完成了對牛單拷貝中的“鴨”來源成分的測定。胡悅團(tuán)隊利用羊肉和豬肉的單拷貝DNA序列設(shè)計了引物和探針，用來證實DNA的濃度和數(shù)量與肉類品質(zhì)有一定的相關(guān)性，從而確定肉品中的豬源和羊源物質(zhì)的數(shù)量，并確定肉類品質(zhì)。

總而言之，數(shù)字PCR技術(shù)具有較高的特異性、靈敏度，在較短的時間內(nèi)其檢出下限可達(dá)復(fù)制數(shù)量級。但是，這種方法比較繁瑣，所需的設(shè)備和探頭也比較昂貴。

5.限制性片段長度多態(tài)性方法。限制性片段長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）技術(shù)是通過對基因進(jìn)行酶切，將基因序列進(jìn)行剪切，得到相應(yīng)的基因序列。PCR-RFLP以其低成本、高靈敏度、高通量、適用面廣的優(yōu)勢已經(jīng)成為當(dāng)前最為高效的一種技術(shù)。Kumar等人借助PCR-RFLP技術(shù)，利用一對特異性的引物對5個常用的可食肉類進(jìn)行了分析，以 AluI、TaqI為靶標(biāo)，分別對不同條件下的水牛、羊肉、豬肉等樣品進(jìn)行了檢測。TaqI的特異性酶解反應(yīng)可獲得4個長度分別為43bp、131bp、163bp和272bp的序列，其特異性的酶解反應(yīng)可用于5種可食動物，但所需時間較多，需24h。Mahajan等人利用 MT 12S rRNA作為標(biāo)記，通過對水牛、綿羊等多種肉的分析表明，單靠Alu I的酶解作用難以將羊與羊區(qū)分，而聯(lián)合應(yīng)用兩種酶解作用后能將兩者分開。在羊的BspTI的酶解物中，發(fā)現(xiàn)了3233bp和133bp的兩個堿基段，而在羊肉的酶解物中沒有發(fā)現(xiàn)這種剪切體。

總之，PCR-RFLP技術(shù)在牛/水牛和綿羊/山羊等近緣種中，可實現(xiàn)高精度、高特異性和低成本的分子標(biāo)記。但是，這種方法比較耗時耗力，并不適用于肉類摻假的現(xiàn)場檢驗。

三、基于PCR技術(shù)的羊肉成分檢測方法對比

在測試期間，研究者們采用了不同的方法來檢測摻假羊肉，每個方法都有利弊。常規(guī)PCR法具有簡便、特異性好、檢出少量摻假的特點，但是其檢出數(shù)目無法準(zhǔn)確定位，并且有污染風(fēng)險。實時熒光定量PCR可以檢出摻雜的種類和含量，在封閉的試管內(nèi)進(jìn)行，還可以減少被污染的幾率，但是所需的設(shè)備很貴，而且對試驗的條件也很苛刻。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)不需要任何貴重的設(shè)備，只需要水浴，大約40min就可以進(jìn)行檢驗，所需的時間短，而且對試驗條件和設(shè)備沒有較為苛刻的條件，還可以在反應(yīng)的混合物中添加SYBR綠色染色劑來進(jìn)行LAMP的檢驗，但是過程中沉淀的可視化難度較高，所需要的引物的設(shè)計和選擇也會比較繁瑣?；谄淦焚|(zhì)與DNA復(fù)制數(shù)量的直線相關(guān)，數(shù)字PCR可以準(zhǔn)確地探測出肉中摻入雜質(zhì)的復(fù)制數(shù)量，具有很高的專一性、靈敏度和較少的時間，但是對試驗的操作有很高的要求，并且實驗過程非常繁瑣。限制性片段長度多態(tài)性法具有靈敏度高、特異性強、成本低廉等優(yōu)點，但存在耗時長等缺點。

綜上，鑒于現(xiàn)有的肉類摻假檢測技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點，未來隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，亟需建立快速、低成本、高靈敏度的檢測方法，進(jìn)而保障羊肉及其他肉類中肉源的質(zhì)量安全。

作者簡介：李艾澤（1990-），女，蒙古族，內(nèi)蒙古烏蘭浩特人，中級工程師，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。