黃腐酸作為飼料添加劑對泥鰍腸道免疫能力的影響研究

李志偉，邵士良，李戌鋒，黃嘉勝，趙 波，牟 毅，儲張杰，高 陽

（浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022）

黃腐酸作為飼料添加劑對泥鰍腸道免疫能力的影響研究

李志偉，邵士良，李戌鋒，黃嘉勝，趙 波，牟 毅，儲張杰，高 陽

（浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022）

在基礎飼料中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%濃度梯度的礦源黃腐酸添加劑，0%作為對照組，研究黃腐酸添加劑對臺灣泥鰍腸道免疫功能的影響。實驗選擇健康的體重（6.2±0.2）g的臺灣泥鰍為試驗對象，進行為期60 d的飼養(yǎng)實驗，實驗結束時對泥鰍腸道的免疫酶活性進行分析。結果顯示實驗組泥鰍腸道與對照組相比，溶菌酶、補體3、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、免疫球蛋白M活性明顯得到提高，尤其是當添加水平達到1%時，表明飼料中添加黃腐酸能夠提高泥鰍腸道免疫功能。

黃腐酸；泥鰍；腸道免疫

抗生素的使用，在一定程度上減輕了疾病的危害，但藥物殘留問題制約了它的使用。健康管理與生物安全已成為目前水產養(yǎng)殖的主要關注事項。各種非抗生素飼料添加劑如益生菌、低聚糖、植物提取物或免疫增強劑等已被廣泛用于改善養(yǎng)殖生物的的自身免疫功能，從而提高他們對病原的抵抗力。

腐殖質是一類復雜的天然大分子芳香族聚合物，其化學組成極其復雜，主要組成元素有C、H、O、N、P，是動植物殘體在微生物作用以及一系列復雜的化學作用下生成的，在土壤、腐泥、泥炭、褐煤、風化煤、動植物殘體、江河湖海中均含有其組成成分[1-2]。腐殖質類物質包含四個級分：黃腐酸、棕腐酸、黑腐酸和腐黑物。黃腐酸，是腐植酸四個級分中最活躍的一個級分。黃腐酸組成中包含許多活性功能基團，包括羧基、羥基、羰基、酚基、醌類和半醌類化合物等等[3]。這些基團使黃腐酸具有許多對動物機體有益的作用，如絡合重金屬[4]，提高抗氧化能力、抗應激能力和免疫力[5]，以及提高抗炎癥和抗病毒[6]等性能。

作為腐植酸類物質中的一員，黃腐酸在農業(yè)、畜牧業(yè)以及醫(yī)藥等方面，具有十分廣泛的應用。農業(yè)方面，具有提高農作物抗逆性和增產的功能[7]，在畜牧業(yè)方面，腐植酸類物質能夠提高養(yǎng)殖動物的生長率，飼料效率和免疫力，減少疾病發(fā)生的風險，提高生產效益[8-11]，在醫(yī)藥方面，具有殺菌消炎及鎮(zhèn)痛作用[12]，將黃腐酸添加到養(yǎng)殖水體中具有凈化水質的功效[13-14]，在羅非魚及鯽魚養(yǎng)殖過程中添加黃腐酸可以提高兩種魚類的生長及非特異性免疫力[15-16]。然而目前尚沒有黃腐酸作為飼料添加劑在泥鰍養(yǎng)殖中的應用研究。因此本文通過在泥鰍基礎飼料中添加適量黃腐酸，研究其對泥鰍免疫功能的影響，進而對黃腐酸的添加使用效果進行深入綜合的評價。

1 材料與方法

實驗所用黃腐酸為褐煤黃腐酸，來源于中國科學院化學研究所（純度為99.3%，分子量1127，碳含量56.2%）。實驗分對照組和實驗組，對照組泥鰍飼料為人工配制的基礎飼料，實驗組飼料是在基礎飼料配方中添加0%、0.5%、1.0%、1.5%和2%的黃腐酸，兩組飼料均為顆粒飼料?；A飼料營養(yǎng)水平為魚粉21%、豆粕36%、小麥麩皮7%、菜籽餅4%、花生油2%、玉米17%、磷酸二氫鈣1.8%、維生素預混料0.12%、微量元素預混合飼料0.08%、羧甲基纖維素鈉1%、麥飯10%。過飽食量喂食1 h后，將剩余的飼料取出烘干，稱量，計算飼料的轉化率。

泥鰍初始體重（6.2±0.1）g，選體質健壯、規(guī)格相近的泥鰍450尾，隨機分配于15個20 L水箱中，用4個12 W 4孔充氧機24 h連續(xù)充氣，每組設3個重復，每個水族箱放泥鰍30尾。正式試驗周期為60 d，每天定時投餌（08：00、18：00），投喂量為目視飽食。整個實驗過程中水溫保持在24±1℃，溶氧5.0～6.0 mg/L，pH 7.1±0.2，氨氮濃度低于0.06 mg/L，亞硝酸鹽濃度低于0.02mg/L，每天換水1/3。

實驗結束后，停食24 h，從每個重復組隨機取10尾泥鰍，用MS-222（Sigma-Aldrich）麻醉。魚的表面用70%乙醇消毒，用手術刀切除幽門盲囊與肛門前大約1 cm之間的小腸，并用無菌鉗剝離粘液和糞便，用液氮冷凍后放置在-80℃超低溫冰箱中保存。分析時，取出樣品化凍，以10倍的冰凍去離子水低溫條件下（℃）制成勻漿后,以3000 r/min離心10 min，取上清液進行溶菌酶，補體3，免疫球蛋白M，堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的測定。酶活性的測定采用上海常斤生物科技有限公司的酶聯免疫試劑盒測定。

數據分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，對數據進行方差分析，Tukey’s檢驗用于各組間的比較，實驗數據以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果分析

腸道溶菌酶活性隨著黃腐酸濃度增加而增加（圖1）。當黃腐酸濃度高于1.0%時，溶菌酶含量顯著提高相對于對照組和0.5%添加組（P＜0.05），而對照組和0.5%添加組之間沒有差異（P＞0.05）。酸性磷酸酶活性變化趨勢與溶菌酶一致（圖2），免疫球蛋白M含量隨黃腐酸濃度增加而增加，實驗組與對照組間差異顯著（P＜0.05），在1.5%添加水平時達到最高，而在2.0%時又有所降低（圖3）。當黃腐酸含量達到1.0%以上時，補體3含量顯著高于對照組和0.5%添加組（P＜0.05），在2.0%添加水平達到最高（圖4）。堿性磷酸酶活性隨黃腐酸添加量增加而增加，實驗組活性顯著高于對照組（P＜0.05），并在2.0%添加水平達到最高（圖5）。

圖1 不同黃腐酸添加水平對泥鰍腸道溶菌酶活性的影響Fig.1 Effects of fulvic acid on intestinal lysozyme activities of loach

圖2 不同黃腐酸添加水平對泥鰍腸道酸性磷酸酶活性的影響Fig.2 Effects of fulvic acid on intestinal acid phosphatase activities of loach

圖3 不同黃腐酸添加水平對泥鰍腸道免疫球蛋白M含量的影響Fig.3 Effects of fulvic acid on intestinal IgM content of loach

圖4 不同黃腐酸添加水平對泥鰍腸道補體3含量的影響Fig.4 Effects of fulvic acid on intestinal complement 3 of loach

圖5 不同黃腐酸添加水平對泥鰍腸道堿性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effects of fulvic acid on intestinal alkaline phosphatase activities of loach

3 討論

腐植酸類物質具有特殊的結構性能和生物活性,在植物生長中起到了奇特的作用。我國在20世紀70年代曾掀起腐植酸類物質的研究和應用熱潮,主要是解決當時農業(yè)生產肥料的短缺。黃腐酸結構中具有的醌基，羥基、羧基、酚羥基等多種活性基團，在動植物機體的新陳代謝及氧化還原過程起到了很重要的作用，決定了腐植酸特殊的生物活性和較高的吸附能力、緩沖、催化能力[17]。腐植酸等物質對消炎、抗病毒、調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗?jié)冇忻黠@的作用[18]。

作為一種飼料添加劑，黃腐酸已廣泛應用于畜牧業(yè)生產中，用于增強動物免疫力，減少疾病發(fā)生的風險[8]。而黃腐酸在水產動物免疫方面的研究較少，在本實驗中我們觀察到黃腐酸添加組的泥鰍腸道溶菌酶活性和酸性磷酸酶得到顯著提高，尤其是當黃腐酸添加量達到1%以上時。實驗證明高濃度的腐植酸添加量，可以提高血清溶菌酶水平[19-21]，與我們所觀察到的結果一致。ABDELWAHAB等[22]也證實飼料中添加腐植酸可以提高鯉魚的生長與溶菌酶活性，最優(yōu)添加量是0.8%。這與我們實驗中的添加水平有一定差別，一方面可能是由于我們添加了黃腐酸，另一方面是由于魚種的差別。溶菌酶是存在于魚類的血清、黏液及吞噬細胞中的一種水解酶，對各種病原微生物具有重要的防御作用[23]。黃腐酸同時也顯著增加了泥鰍腸道堿性磷酸酶的活性，堿性磷酸酶是動物代謝過程中重要的調控酶，作為一種非特異性磷酸水解酶，它能催化磷酸單酯的水解和磷酸基團的轉移反應，對動物的生存具有重要的意義[24]。烏蘭等[14]在鯽魚飼料中添加0.3%水平黃腐酸，發(fā)現鯽魚的堿性磷酸酶活性，溶菌酶活性都得到顯著提高，酸性磷酸酶活性也略有提高但效果不明顯，這與我們實驗中觀測到的結果基本一致。趙杰等[25]認為在中國對蝦飼料中添加0.10%～0.20%生化黃腐酸，可提高對蝦溶菌酶活性，增強了對蝦免疫力，提高了對蝦成活率。說明黃腐酸可以一定程度上提高水產動物的非特異性免疫相關酶活性。

腐植酸對動物有免疫增強作用,在免疫過程中抗原物質攝取、細胞免疫和體液免疫各階段均有促進作用[18]。黃腐酸在腐植酸物質中生物活性最高，毒性小，研究證明黃腐酸在體液水平和細胞水平均有一定的雙向免疫調節(jié)作用。常啟發(fā)等[5]試驗報道稱，日糧中添加黃腐酸可顯著提高生長豬血液中淋巴細胞數量和血清中免疫球蛋白M的含量。高金崗等[26]試驗證明，黃腐酸可提高小鼠的體液免疫功能，使抗體形成增加，對細胞免疫無顯著影響。薄芯等[27]指出，黃腐酸可以提高動物機體的特異性和非特異性免疫力，抵抗外來病菌的侵入，降低機體發(fā)生病變的可能性。黃腐酸可以改善動物腸道免疫功能而增強對病原菌的抵抗力如大腸桿菌[28]。NAKAGWA等[29]發(fā)現用腐植質提取物喂養(yǎng)香魚可以有效的預防黃桿病毒感染。

同時，黃腐酸通過改善動物的免疫功能和代謝能力而促進各種動物的生長發(fā)育及降低應激反應。用添加黃腐酸的飼料喂養(yǎng)劍尾魚，可以降低劍尾魚的應激反應[30]。投喂腐植酸可以減輕鯉魚因密度脅迫引起的綜合癥。腐植酸類物質還可以通過轉錄控制生物轉化，抗氧化以及抗應激反應，同時修飾相關的酶活性[31-32]。

在本實驗中，泥鰍腸道免疫酶活性得到明顯改善，但其具體的作用機制還不清楚。我們推測黃腐酸可能誘導機體產生干擾素，增強非特異性免疫力，對病原微生物產生抗性；同時黃腐酸具有很強的吸附性和絡合性，可有效吸附飼料中及消化道代謝過程所產生的各種有毒有害物質，并在腸道黏膜形成保護層而增強動物的免疫系統(tǒng)功能，從而減少動物腸道炎癥的發(fā)生和消化疾病。鑒于黃腐酸的免疫增強作用，及其無毒害、無殘留的特性，可在一定范圍內代替抗生素,用作防病藥劑，具有廣闊的市場前景。

[1]KONONOVA M M.Soil Organic Matter.Its Nature,Its Role in Soil Formation and in Soil Fertility[M].2nd Eng Ed.Pergamon Press.1966:544.

[2]STEVENSON F J.Humus Chemistry,Genesis,Composition,Reaction[M].2nd edn.New York:John Wiley Sons,1994:642.

[3]AIKEN G R,MCKNIGHT D M,WERSHAW R L,et al.Humic substances in soil,sediment and water:Geochemistry,isolation and characterization[M].1st ed.New York:Wiley,1985.

[4]PLAZA C,GARCíA-GIL J C,POLO A,et al.Proton binding by humic and fulvic acids from pig slurry and amended soils[J]. Journal of Environmental Quality,2005,34:1 131-1 137.

[5]常啟發(fā),白會新,石寶明,等.黃腐酸對生長豬生長性能、血清生化指標、血常規(guī)參數和免疫功能的影響[J].動物營養(yǎng)學報, 2013,25(8):1 836-1 842.

[6]YANG H L,CHIU H C,LU F.Effects of humic acid on the viability and coagulant properties of human umbilical vein endothelial cells[J].American Journal of Hematology,1996,51(3):200-206.

[7]李 捷,楊小鵬,馮建軍.不同條件下黃腐酸對春小麥生長和水分利用的影響[J].干旱地區(qū)農業(yè)研究,2002,20(2):52-55.

[8]ISLAM K M S,SCHUMACHER A,GROOP J M.Humic acid substances in animal agriculture[J].Pakistan Journal of Nutrition, 2005,4:126-134.

[9]VUCSKITS A V,HULLáR I,BERSéNYI A,et al.Effect of fulvic and humic acids on performance,immune response and thyroid function in rats[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2010,94:721-728.

[10]白會新,王靚靚.黃腐酸類飼料添加劑在豬生產中的應用[J].飼料工業(yè),2015,36(2):1-4.

[11]王海榮,金 海,薛樹媛,等.含黃腐酸復合添加劑對肉羊生產性能的影響[J].飼料工業(yè),2012,33(3):42-44.

[12]高金崗,石習霞,周連寧.口服生化黃腐酸抗炎鎮(zhèn)痛作用初步研究[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(11):62-65.

[13]薛德林,胡江春,王國安,等.海洋紅酵母、光合細菌、生化黃腐酸在海參育苗和養(yǎng)成中的應用效果[J].腐植酸,2009(4): 19-24.

[14]張翠榮,賈振宇.腐植酸在水產養(yǎng)殖中應用[J].廣州化工,2004,32(1):14-16.

[15]張志功,徐學軍,劉 權.生化黃腐酸添加劑飼喂羅非魚的效果[J].內陸水產,1999(3):13.

[16]烏 蘭,王 俊,張倩茹.黃腐酸對鯽魚非特異性免疫相關酶的影響[J].飼料研究,2015(11):45-47.

[17]鄭 平.煤炭腐植酸的生產和應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,1991:122.

[18]SCHEPETKIN I,KHLEBNIKOV A,KWON B S.Medical drugs from humus matter:focus on mumie[J].Drug Develop Research,2002,57:140-159.

[19]EL-ASHRAM A M M,EL-BOSHY M E.Assessment of dietary bovine Lactoferrin in enhancement of immune function and disease resistance in Nile Tilapia(Oreochromis niloticus)[C]//8th International Symposium on Tilapia in Aquaculture,Cairo,E-gypt,2008,Part II:1 097-1 108.

[20]EL-BOSHY M E,EL-ASHRAM A M M,ABDEL-GHANY N A.Effect of dietary Beta-1,3 Glucan on immunomodulatory diseased Oreochromis niloticus experimentally toxicated with Aflatoxin B 1[C]//8th International Symposium on Tilapia in Aquaculture,Cairo,Egypt,2008:1 109-1 128.

[21]EL-BOSHY M E,EL-ASHRAM A M M,ABDEL-HAMID F M,et al.Immunomodulatory effect of dietary Saccharomyces cerevisiae,β-glucan and laminaran in mercuric chloride treated Nile tilapia(Oreochromis niloticus)and experimentally infect-ed with Aeromonas hydrophila[J].Fish and Shellfish Immunology,2010,28:802-808.

[22]ABDEL-WAHAB A M,EL-REFAEE A M E,AMMAR A A.Effects of Humic Acid as Feed Additive in Improvement of Nonspecific Immune Response and Disease Resistance in Common Carp(Cyprinus carpio)[J].Ammar Egyptian Journal for Aquaculture,2012,2(1):83-91.

[23]宋文華,于 翔,富麗靜,等.黃芪多糖和香菇多糖對草魚非特異性免疫功能的影響[J].安徽農業(yè)科學,2011,39(24):14 893-14 895.

[24]張 輝,張海蓮.堿性磷酸酶在水產動物中的作用[J].河北漁業(yè),2003(5):12-13.

[25]趙 杰,李 雯.生化黃腐酸對中國對蝦生長發(fā)育及部分免疫機能的影響[J].飼料研究,2001(12):23-24.

[26]高金崗,周連寧,張英才,等.生化黃腐酸對小鼠非特異性免疫功能的影響[J].腐植酸,2010(2):11-15.

[27]薄 芯,李京霞,趙文睿.BFA對小鼠脾臟T淋巴細胞增殖活性影響的初步研究[J].北京聯合大學學報,2002,16(4):69-71.

[28]HUMINFEED-TIERFUTTERZUS?TZE H T,MEDIZIN V,PRODUKTE H B.Humintech Humintech GmbH,Heerdter Landstr.189/D,D-40549 Düsseldorf,Germany in the Global Environment and Implication for Human Health[Z].Elsevier Science B.V.,Amsterdam,2004:1368.

[29]NAKAGWA J,IWASAKI T,KODAMA H.Protection against Flavobacterium psychrophilum infection(cold water disease)in Ayu fish(Plecoglossus altivelis)by oral administration of humic acid[J].Journal of Veterinary Medical Science,2009,71(11): 1 487-1 491.

[30]MEINELT T,SCHRECKENBACH K,KNOPF K,et al.Humic substances affect physiological condition and sex ratio of swordtail(Xiphophorus helleri Heckel)[J].Aquatic Sciences,2004,66:239-245.

[31]HONDA Y,HONDA S.The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans[J].The FASEB Journal,1999,13:1 385-1 393.

[32]MINOIS N.Longevity and aging:Beneficial effects of exposure to mild stress[J].Biogerontology,2000,1(1):15-29.

Effects of Fulvic Acid on Intestinal Immunity of Juvenile Loach Paramisgurnus dabryanus(Sauvage)

LI Zhi-wei,SHAO Shi-liang,LI Xu-feng,et al
(Fishery School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

A 60-day feeding trial was conducted to determine the effect of dietary fulvic acid supplements on intestinal immune enzyme activity of juvenile loach(initial weight of 6.2±0.2 g)reared in experimental aquaria.Five test diets containing 0%,0.5%,1.0%,1.5%and 2%fulvic acid were randomly assigned to three aquaria,respectively.At the end of the experiment,lysozyme,addiment C3,immunoglobulin M,acid phosphatase activity and alkaline phosphatase activity were significantly elevated with concomitant increasing levels of dietary fulvic acid(P<0.05),especially when the additive level was above 1.0%.These results indicate that fulvic acid could improve intestinal immunity of juvenile loach.

fulvic acid;Paramisgurnus dabryanus;intestinal immunity

S963.5

A

1008－830X(2016)05－0379－05

2016-06-20

浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2015R411010）；國家級大學生創(chuàng)新訓練項目（201510340010）；浙江海洋大學水產省一流學科開放課題（20160010）

李志偉（1994-），男，山東煙臺人，研究方向：水產養(yǎng)殖.

高陽，研究方向：水產養(yǎng)殖工藝與技術.E-mail:gaoyang-82@163.com