不同餌料對褶皺臂尾輪蟲氨基酸脂肪酸組成的影響

傅榮兵，章 霞，徐志進，邱豪軍，蔣霞敏

（1.寧波大學，浙江寧波 315211；2.浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000）

不同餌料對褶皺臂尾輪蟲氨基酸脂肪酸組成的影響

傅榮兵1,2，章 霞2，徐志進2，邱豪軍2，蔣霞敏1

（1.寧波大學，浙江寧波 315211；2.浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000）

為探究海洋紅酵母和濃縮小球藻作為輪蟲培育餌料的可行性，采用3種不同餌料（小球藻、濃縮小球藻、海洋紅酵母）單獨或混合對輪蟲進行投喂，并測定這3種餌料以及不同試驗組輪蟲的氨基酸、脂肪酸兩項指標來比較評價不同餌料對褶皺臂尾輪蟲的營養(yǎng)價值。結(jié)果表明：3種餌料的小球藻非必需氨基酸總量顯著高于其他兩種餌料（P<0.05），濃縮小球藻的必需氨基酸含量最高；3種餌料中小球藻的飽和脂肪酸含量顯著高于其他兩種生物餌料（P<0.05），不飽和脂肪酸含量總量以海洋紅酵母為最高，海洋紅酵母的順式油酸含量是小球藻和濃縮小球藻的14.1倍，順式亞油酸是小球藻和濃縮小球藻的7.11和6.96倍。不同餌料投喂輪蟲的氨基酸、脂肪酸比較結(jié)果表明，紅酵母搭配2種藻類投喂輪蟲相比單一餌料投喂輪蟲的必需氨基酸含量有明顯提高，但對提高輪蟲脂肪酸含量效果欠佳?？梢姾Ｑ蠹t酵母和濃縮小球藻可以作為優(yōu)良的輪蟲培育餌料，這也將為輪蟲的營養(yǎng)優(yōu)化和大規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展提供參考。

褶皺臂尾輪蟲；海洋紅酵母；氨基酸；脂肪酸

1960年，褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis因其繁殖快、抗逆性強、營養(yǎng)價值高等特性被確認為海水育苗及甲殼類幼體必要的餌料生物，迄今為止，無可替代，由此也成為了海水育苗成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。眾所周知，輪蟲易于養(yǎng)殖，食性廣泛，細菌、單胞藻、豆?jié){、酵母，發(fā)酵生物等有機碎屑，均可用于輪蟲培育。但由于有機碎屑易于敗壞水質(zhì)導致培育生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定，當前在實際生產(chǎn)中輪蟲的大規(guī)模培養(yǎng)主要采用的是單細胞藻類作為餌料進行培養(yǎng)[2]。然而大量單細胞藻類的培養(yǎng)耗資巨費，因而眾多專家學者開展了酵母、單胞藻類單獨或者共同培育輪蟲技術(shù)的研究。

廖永巖等[3]以面包酵母為餌料開展了人工海水培養(yǎng)褶皺臂尾輪蟲的研究。王金秋等[4-6]研究了面包酵母和啤酒酵母2種酵母單獨投喂萼花臂尾輪蟲Brachionus calyciflorus在最適密度、餌料效果及與藻類搭配的投喂效果等方面的研究，并對比分析了面包酵母和啤酒酵母對萼花臂尾輪蟲的營養(yǎng)價值，此外還研究了兩種酵母和兩種藻類對于褶皺臂尾輪蟲的最適投喂密度。張雅芝等[1]利用正交設(shè)計方法，研究了不同水溫條件下，不同餌料和接種密度對褶皺臂尾輪蟲種群增長的影響，其中酵母餌料選擇的是干面包酵母。夏連軍等[7]利用干酵母作為褶皺臂尾輪蟲的餌料進行了工廠化培養(yǎng)試驗的研究等?？v觀現(xiàn)有報道，目前多數(shù)學者主要研究面包酵母、啤酒酵母作為餌料對于輪蟲進行培養(yǎng)，而關(guān)于以海洋紅酵母、小球藻濃縮液為餌料對于輪蟲進行培養(yǎng)的研究未見報道。

因而本文將對于利用海洋紅酵母、小球藻、小球藻濃縮液作為培育餌料投喂輪蟲，并采用氨基酸、脂肪酸兩項指標來評價不同餌料對褶皺臂尾輪蟲的營養(yǎng)價值。探究海洋紅酵母以及小球藻濃縮液在輪蟲培育餌料上的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

餌料組成，X組：小球藻；N組：濃縮小球藻；H組：海洋紅酵母；X+H組：小球藻+海洋紅酵母；N+H組：濃縮小球藻+海洋紅酵母，每組3桶。

褶皺臂尾輪蟲種由舟山市水產(chǎn)研究所提供，輪蟲生存狀態(tài)良好。

1.2 試驗方法

采用YPD培養(yǎng)基裝液量為80 mL/500 mL的三角錐形瓶培養(yǎng)海洋紅酵母，30℃，160 r/min，48 h后計數(shù)，約為2.25×109個/mL，離心，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

小球藻在室內(nèi)藻類室牛奶桶中曝氣培養(yǎng)5 d后，計數(shù)約為4×106個/mL，待用。

濃縮藻購置于東營大振生物工程有限公司，計數(shù)為8×109個/mL。

取18個120 L的白色PE桶（51×46×80），放入100 L水，接種提前空白暫養(yǎng)2 d的空白組，使各桶輪蟲密度維持在30個/mL左右。每天早（08:00）、中（16:00）、晚（24:00）對用投喂餌料，X組：小球藻密度維持在4×105個/mL；N組：濃縮藻密度維持在4×105個/mL；H組：海洋紅酵母密度維持在（10～15）×105個/mL；X+H組：小球藻密度維持在2×105個/mL，海洋紅酵母維持在（5～7.5）×105個/mL；N+H組：濃縮藻密度維持在2×105個/mL，海洋紅酵母在（5～7.5）×105個/mL。每24 h取樣，觀察成活率，顯微照像，96 h用300目篩絹網(wǎng)收集每桶的輪蟲，用潔凈海水沖洗3～4遍，裝于50 mL離心管，用滅菌1.5%生理鹽水4 000 r/min離心3 min，反復(fù)3遍，舍棄上清液，-20℃，冷凍待測。

氨基酸測定：用5%的磺基水楊酸提取100 mg的樣品，每次用2 mL提取，超聲10 min。提取2次，2次的提取液合并后離心，采用agilent 1260測定。

脂肪酸組成的測定：

（1）提?。簩悠贩湃?0 mL離心管，用玻璃棒將菌絲絞碎，加入5 mL超純水攪拌溶解，再加入40 mL混合溶劑（乙醇：乙醚：石油醚=2:1:1），用力搖5 min，在3 500 r/min離心5 min，吸取上層清夜到燒杯；第二次加入10 mL混合溶劑（石油醚：乙醚=1:1），在3 500 r/min離心5 min，吸取到燒杯；在45℃的水浴鍋吹氮氣，直至吹干。

（2）甲酯化：加2 mL正己烷到燒杯中，將油脂溶解，倒入5 mL帶蓋玻璃管，加入0.5 mL KOH—甲醇溶液（4 mol），振蕩1 min，靜置直至上層清液清澈，吸取上層清液，上機。

（3）色譜條件：安捷倫氣相色譜儀7820；色譜柱：DB-23（30 m×0.25 m×0.25 μm）；檢測器：FID；進樣口溫度：300℃，檢測器溫度：250℃，進樣量為1 μL。初始溫度為50℃，以10.0℃/min升溫至180℃，保持5 min再以5.0℃/min升溫至230℃，保持2 min，分流比20:1。脂肪酸的定量分析采用面積歸一法計算而得。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件EXCEL2007和SPSS17.0進行單方面方差分析（One-way ANOVA）檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3種餌料的氨基酸組成比較

由表1可見3種餌料的游離氨基酸含量各有不同，其中小球藻的非必需氨基酸總量顯著高于濃縮小球藻和海洋紅酵母（P<0.05），特別是谷氨酸含量分別是濃縮小球藻的6.01倍，海洋紅酵母的11.6倍，絲氨酸含量也顯著高于其他兩種生物餌料（P<0.05），分別是濃縮小球藻的8.52倍，海洋紅酵母的4.59倍，而濃縮藻、海洋紅酵母的組氨酸顯著高于濃縮小球藻（P<0.05）。3種餌料中的必需氨基酸含量以濃縮小球藻最高，各自的優(yōu)勢氨基酸也有所不同。小球藻、濃縮小球藻的必需氨基酸以纈氨酸含量最高，是海洋紅酵母的18倍和12.42倍，而海洋紅酵母以精氨酸含量最高，是小球藻3.41倍，濃縮小球藻的79.86倍。可見，優(yōu)化3種微生物餌料的配比可能提高輪蟲的營養(yǎng)價值。

表1 3種餌料的氨基酸組成（單位：mg/g）Tab.1 Amino acid composition of three kinds of bait(unit:mg/g)

2.2 3種微生物餌料的脂肪酸組成比較

3種餌料的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量不盡相同（表2）。其中小球藻的飽和脂肪酸含量顯著高于其他餌料（P<0.05），是濃縮小球藻1.88倍，海洋紅酵母1.6倍。其中棕櫚酸是3種餌料的優(yōu)勢飽和脂肪酸，海洋紅酵母的山酸含量是小球藻的4.54倍。3種餌料的不飽和脂肪酸含量總量以海洋紅酵母為最高，其中小球藻和濃縮小球藻的棕櫚油酸含量是海洋紅酵母21.9～24.8倍，海洋紅酵母的順式油酸含量是小球藻和濃縮小球藻的14.1倍，順式亞油酸是小球藻和濃縮小球藻的7.11和6.96倍。濃縮小球藻的α—亞油酸（C18：3n3）顯著低于海洋紅酵母和小球藻（P<0.05）。濃縮小球藻的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量都顯著低于另外兩種餌料（P<0.05）。其中濃縮小球藻的飽和脂肪酸含量是小球藻的53.25%，海洋紅酵母的85.20%，濃縮小球藻的不飽和脂肪酸含量是小球藻的67.31%，海洋紅酵母的58.10%。

表2 3種餌料的脂肪酸組成（%）Tab.2 Fatty acids composition of three kinds of bait(%)

2.3 不同餌料投喂對輪蟲的氨基酸組成的影響

由表3可知，不同餌料培養(yǎng)的輪蟲的氨基酸含量以小球藻+海洋紅酵母為最高，最低為濃縮小球藻。5個試驗組的非必需氨基酸含量以小球藻+海洋紅酵母組最高，顯著高于相應(yīng)的相應(yīng)的單一餌料組（P< 0.05），為小球藻組的4.31倍，是海洋紅酵母組的6.67倍?；旌辖M濃縮小球藻+海洋紅酵母的氨基酸含量低于相應(yīng)的單一餌料培養(yǎng)組。5個試驗組中的小球藻+海洋紅酵母組的必需氨基酸含量是相應(yīng)的單一餌料組小球藻組的4.48倍，海洋紅酵母組的6.60倍，濃縮小球藻+海洋紅酵母組的必需氨基酸含量是相應(yīng)的單一餌料組的濃縮小球藻組的3.51，海洋紅酵母組的1.07倍?？梢姾Ｑ蠹t酵母和小球藻、濃縮藻的混合投喂能明顯提高單一餌料投喂輪蟲的必需氨基酸含量，但是濃縮小球藻+海洋紅酵母組對提高相應(yīng)單一餌料培養(yǎng)的輪蟲的非必需氨基酸含量效果不佳。單一餌料、混合餌料培養(yǎng)的輪蟲的氨基酸差異較大。

2.4 不同餌料投喂對輪蟲的脂肪酸組成的影響

5個試驗組中，以小球藻組輪蟲的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量最高，海洋紅酵母組輪蟲的多不飽和脂肪酸含量最高，見表4?；旌橡D料組小球藻+海洋紅酵母組輪蟲的飽和脂肪酸高于單一餌料組海洋紅酵母組的輪蟲含量，是其1.01倍，略低于小球藻組的輪蟲含量，兩個混合餌料組小球藻+海洋紅酵母組、濃縮小球藻+海洋紅酵母組的輪蟲的單不飽和脂肪酸含量均低于相應(yīng)的單一的餌料投喂組?；旌橡D料組小球藻+海洋紅酵母組輪蟲的多不飽和脂肪酸含量低于相應(yīng)的單一餌料培養(yǎng)組，是小球藻含量的94.9%，顯著低于海洋紅酵母組，是海洋紅酵母的76.78%（P<0.05），混合餌料組濃縮小球藻+海洋紅酵母組輪蟲的多不飽和脂肪酸含量低于單一餌料組海洋紅酵母組，含量為海洋紅酵母組的87.67%，高于單一餌料組濃縮小球藻組，是濃縮小球藻組的1.03倍。而影響海洋養(yǎng)殖生物生長發(fā)育高度不飽和脂肪酸EPA含量依次是N>N+H>X>X+H>H，DHA含量依次為X>X+H>H>N+H>N，可見混合組對改善輪蟲單種餌料培養(yǎng)的脂肪酸含量效果不佳。

表3 5組輪蟲的氨基酸組成（單位：mg/g）Tab.3 Amino acid composition of five group of rotifers(unit:mg/g)

3 討論

3.1 濃縮小球藻在輪蟲培育上的應(yīng)用價值

輪蟲的大規(guī)模培養(yǎng)的限制因素很多，例如餌料、密度、溶解氧、pH、鹽度、溫度等，其中餌料是重要的限制因素，當前小球藻是經(jīng)研究證明適宜大規(guī)模培育輪蟲的優(yōu)質(zhì)餌料[8-9]，但也存在供應(yīng)不及、易老化、營養(yǎng)單一、耗時耗力的問題[10]，為減少小球藻供應(yīng)壓力，當前發(fā)展用濃縮小球藻替代的新方法[11-13]。濃縮小球藻具有生物量大、運輸方便、易于保存等優(yōu)點，現(xiàn)在在生產(chǎn)育苗餌料提供的環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重大的作用。由研究結(jié)果顯示3種的游離氨基酸含量各有不同，其中小球藻的非必需氨基酸總量顯著高于濃縮小球藻和海洋紅酵母（P<0.05），小球藻的非必需氨基酸含量是濃縮小球藻的1.20倍，是海洋紅酵母的2.36倍，但濃縮小球藻的必需氨基酸含量顯著高于其他兩種餌料（P<0.05），濃縮小球藻的必需氨基酸含量是小球藻的2.03倍，是海洋紅酵母的2.43倍，其中小球藻、濃縮小球藻的必需氨基酸以纈氨酸含量最高，是海洋紅酵母的18倍和12.42倍，3種餌料的優(yōu)勢氨基酸各有不同。濃縮小球藻的脂肪酸含量顯著低于小球藻，濃縮小球藻的飽和脂肪酸含量是小球藻的53.25%，不飽和脂肪酸含量是小球藻的67.31%，由此推測小球藻、濃縮小球藻的應(yīng)用可以根據(jù)其實際生產(chǎn)應(yīng)用進行適當?shù)奶娲?，但大量使用濃縮小球藻存在水質(zhì)敗壞、輪蟲養(yǎng)殖密度低、活力差等生產(chǎn)實況，因此探尋濃縮小球藻在輪蟲培養(yǎng)中使用的適宜用量，輪蟲接種密度，水質(zhì)調(diào)節(jié)，以及強化營養(yǎng)等問題都仍需不斷的開展。

表4 5種輪蟲的脂肪酸組成（%）Tab.4 Fatty acid composition of five group of rotifers(%)

3.2 海洋紅酵母在輪蟲培育上的應(yīng)用前景

海洋紅酵母是目前水產(chǎn)應(yīng)用極具潛力的餌料蛋白原和微生物制劑[14-15]，富含氨基酸、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素以及促進各種海洋生物生長的多肽、肝糖、生長因子等[16-18]，這也與本研究的結(jié)果一致，海洋紅酵母以精氨酸含量最高，是小球藻3.41倍，濃縮小球藻的79.86倍。3種餌料的不飽和脂肪酸含量以海洋紅酵母為最高，海洋紅酵母的順式油酸含量是小球藻和濃縮小球藻的14.1倍，順式亞油酸是小球藻和濃縮小球藻的7.11和6.96倍?，F(xiàn)有研究表明海洋紅酵母輪蟲營養(yǎng)價值優(yōu)于面包酵母輪蟲[19-23]，且海洋紅酵母的生長環(huán)境是海水，抗逆性較強，耐鹽性好，不存在海水中易分解的現(xiàn)象，由此能緩解水質(zhì)敗壞，輪蟲死亡的問題。本研究結(jié)果表明不同餌料培養(yǎng)的輪蟲的氨基酸含量以小球藻+海洋紅酵母為最高，最低為濃縮小球藻。其中小球藻+海洋紅酵母組的必需氨基酸含量是海洋紅酵母組的6.60倍，小球藻4.48倍，濃縮小球藻+海洋紅酵母組的必需氨基酸含量是海洋紅酵母組的1.07倍，濃縮小球藻3.51倍?？梢姾Ｑ蠹t酵母搭配小球藻或濃縮小球藻能顯著提升輪蟲的營養(yǎng)價值。5個試驗組中，輪蟲的EPA含量依次是N>N+H>X> X+H>H，DHA含量依次為X>X+H>H>N+H>N，可見混合組對輪蟲的高度不飽和脂肪酸的提高作用欠佳。這可能與試驗設(shè)計中各種餌料的品種、搭配、餌料配比以及輪蟲密度等有關(guān)系。

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The Effect of Amino Acids,Fatty Acid Composition of Different Bait on Brachionus plicatilis

FU Rong-bin1,2,ZHANG Xia2,XU Zhi-jin2,et al
(1.Ningbo University,Ningbo 315211;2.Zhoushan Fisheried Research Institute of Zhejiang Provinnce,Zhoushan 316000,China)

To explore the feasibility of the Rhodotorula benthica and concentrated chlorella as cultivating bait of rotifers,using three different bait(chlorella,concentrated chlorella,R.benthica)alone or mixed to feeding of rotifers,and determination of two indicators-amino acids,fatty acids the three kinds of bait and different experimental rotifers,which is used to compare and evaluate nutritional value of different bait for Brachionus plicatilis.Results showed that non-essential amino acid of chlorella was more than the other two bait(P<0.05). Concentrated chlorella had the highest content of essential amino acids in the three kinds bait.The saturated fatty acid content of chlorella was significantly higher than the other two biological bait(P<0.05).Total unsaturated fatty acid content of R.benthica was the highest.Vaccwnate content of R.benthica was 14.1 times thatof chlorella and concentrated chlorella’s.Linoleate content was 7.11 times of chlorella and 6.96 times of concentrated chlorella.Comparison results of amino acids,fatty acids on different bait feeding rotifers showed that R.benthica matched two kinds of algae feeding the rotifers had obvious effect on improving essential aminoacid content of rotifers.However,it had less effect on improving fatty acid of rotifers.This research suggested that R.benthica and concentrated chlorella could serve as excellent rotifers which used to cultivate the bait.It could provide the reference for the nutrition of rotifers optimization and large-scale aquaculture technology development.

Brachionus plicatilis;Rhodotorula benthica;amino acid;fatty acid

S963.2

A

1008－830X(2016)05－0372－07

2016-06-30

海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（浙海漁計〔2015〕29號）；舟山市公益類科技項目（2013C31047）；舟山市公益類科技項目（2015C31009）；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2015C32111）

傅榮兵（1971-），男，浙江舟山人，高級工程師，研究方向：水生動物增養(yǎng)殖.E-mail:853966748@qq.com

蔣霞敏，教授，博士生導師，研究方向：藻類克隆與餌料生物培養(yǎng).E-mail:jiangxiamin@nbu.edu.cn