代謝組學在乳酸菌發(fā)酵食品和功能食品中的應(yīng)用

王越男,孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

代謝組學在乳酸菌發(fā)酵食品和功能食品中的應(yīng)用

王越男,孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

對乳酸菌代謝組學研究中樣品的制備、分析鑒定和數(shù)據(jù)分析等主要方法進行概述,并介紹了乳酸菌代謝組學在發(fā)酵食品中和益生菌食品對腸道的影響的應(yīng)用。

代謝組學；乳酸菌；發(fā)酵食品；益生菌；功能食品

0 引言

乳酸菌是一類革蘭氏染色呈陽性的桿菌或球菌、不形成芽孢、不運動、過氧化氫酶試驗呈陰性、對葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸，而且在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧性細菌的總稱[1]。乳酸菌在自然界分布廣泛，可棲居于人和各種動物的消化道及其它器官內(nèi)。在土壤、植物根際和許多人類食品、動物的飼料，還有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些臨床樣品中都發(fā)現(xiàn)有乳酸菌的存在[2]。它們在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值[3]。幾千年以前，人類就開始利用乳酸菌自然發(fā)酵來保藏食品，長期以來，乳酸菌廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜及肉制品的發(fā)酵與防腐中。而且，乳酸菌是篩選益生菌菌種的主要來源之一。

20世紀90年代初以來,隨著基因組學(genomics)、轉(zhuǎn)錄組學(transcriptomics)和蛋白質(zhì)組學(proteomics)的發(fā)展，代謝組學(metabonomics)作為一種檢測生物體整體水平代謝特征的組學技術(shù)應(yīng)用而生[4-5]。與轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學是在基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)翻譯與修飾水平上研究基因功能相比，代謝組學是通過考察生物體系受刺激其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)[6-7]。因此，代謝組學是在整體水平上反應(yīng)生物體基因與環(huán)境因素互作的結(jié)果，是功能基因組學的重要發(fā)展，以及系統(tǒng)生物學的重要組成部分[8-9]。

代謝組學能夠高通量的鑒定和定量在代謝過程中的代謝物的變化[10]。代謝組學已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于藥物科學[11]、食品科學和營養(yǎng)科學[12]。目前最常用的代謝組學分析技術(shù)為高分辨率質(zhì)子核磁共振（NMR），液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用聯(lián)用（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[13]。本文介紹了乳酸菌代謝組學的研究方法及代謝組學在發(fā)酵食品中和益生菌食品對腸道的影響的應(yīng)用。

1 乳酸菌代謝組學的研究方法

代謝組學力求分析生物體系中的所有代謝產(chǎn)物,因此整個過程中盡可能的保留和反映總的代謝產(chǎn)物的信息。乳酸菌代謝組學的研究主要包括實驗設(shè)計、樣品處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)分析、生物學解釋和結(jié)論等。

1.1 樣品制備

乳酸菌代謝物的樣品的制備主要包括乳酸菌的培養(yǎng)、樣品的淬滅和代謝物的提取。樣品的預(yù)處理方法與研究對象、分析目和采用的分析技術(shù)有關(guān)。

在樣品淬滅和代謝物的提取過程中，許多研究者采用液氮冷凍或高氯酸滅活技術(shù)，但這種技術(shù)是植物和動物代謝組學研究中主要使用的滅活方法，并不適用于微生物的研究。而冷甲醇和液氮是微生物代謝組學研究中最常用的淬滅方法，目前這種方法在L. lactis和E.coli等中均有應(yīng)用[14]。Magda Faijes[15]等研究了L.plantarum在代謝過程中樣品的淬滅和提取。研究發(fā)現(xiàn)含有0.85%碳酸銨的60%冷甲醇(pH=5.5)的淬滅效果顯著，而對于冷甲醇、沸騰的乙醇和高氯酸提取L.plantarum胞內(nèi)代謝物效果較好。Mingming Chen[16]等人分別應(yīng)用-40°C的60%甲醇/水、80%甲醇/水和80%甲醇/甘油三種方式淬滅保加利亞乳桿菌，并結(jié)合光密度(OD)回收率實驗、流式細胞術(shù)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析菌體細胞完整性和細胞內(nèi)外代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用80%冷甲醇/水更適用于淬滅保加利亞乳桿菌,能有效減少代謝物泄露程度和增加胞內(nèi)代謝物水平。冷甲醇的淬滅方法并不適用所有的乳酸菌，它也可能會引起其他乳酸菌胞內(nèi)代謝物的泄露，K B J?pelt[17]等人應(yīng)用冷甲醇緩沖液和冷甘油鹽兩種方式淬滅Lactobacillus paracasei subsp.Paracasei，發(fā)現(xiàn)冷甲醇緩沖液和碘化丙啶相結(jié)合的方法導致Lactobacillus paraca?sei subsp.Paracasei的細胞膜大約100%被破壞，大量的代謝物泄露，而在冷甘油鹽溶液中，細胞膜的完整性良好，代謝物的泄露程度有效的減少。因此，利用代謝組學分析細胞內(nèi)的代謝物，淬滅方法的選擇是后續(xù)分析的關(guān)鍵。

1.2 代謝產(chǎn)物的測定

代謝產(chǎn)物的測定是代謝組學分析的核心，常用的代謝組學的三種分析方法是NMR、LC-MS和GC-MS，這些分析方法都可以鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)和測定分子濃度[18-19]。

核磁共振光譜(NMR)技術(shù)樣品預(yù)處理方法簡單，能夠快速準確的對樣品進行高通量分析。在乳酸菌代謝組學測定分析中應(yīng)用較為廣泛還有氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS),這兩種技術(shù)可以檢測包括糖、糖醇、有機酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次級代謝物在內(nèi)的數(shù)百種化合物[20]。

1.3 數(shù)據(jù)的分析

數(shù)據(jù)采集后針對來自不同分析平臺的原始譜圖進行去噪、校正保留時間、峰提取等預(yù)處理,并結(jié)合多元統(tǒng)計學和生物信息學的方法將數(shù)據(jù)進行分析，找出生物標志物[21]。代謝組學數(shù)據(jù)分析采用MSFACTs[22]和XCMS[23]等分析軟件結(jié)合常見的微生物代謝數(shù)據(jù)庫BioCy、MctaCyc、EMP等[24]，找出差異的生物標志物。

2 乳酸菌代謝組學的應(yīng)用研究

代謝組學已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于藥物毒性和機理研究、微生物和植物研究、疾病診斷和動物模型、食品及營養(yǎng)學及基因功能的闡明等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用[25-26]。近年來,代謝組學又在乳酸菌代謝途徑研究及代謝工程、發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化以及乳酸菌和疾病的關(guān)系等研究方面取得了新的突破和進展。

2.1 代謝組學在乳酸菌發(fā)酵食品中的應(yīng)用

代謝組學是研究在特定的條件下所有的代謝物，代謝產(chǎn)物能夠反映細胞的基因和環(huán)境的相互作用，代謝組學對特定環(huán)境中的細胞狀態(tài)給出了公證的評價[27-28]。

乳酸菌在不同的環(huán)境下會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，主要是碳水化合物、揮發(fā)性的醇、酮、氨基酸、短鏈有機酸、長鏈脂肪酸和一些復(fù)雜的成分（抑菌物質(zhì)、肽類等），所以監(jiān)測乳酸菌代謝過程中產(chǎn)物的變化變得尤為重要[29-31]。L.acidophilus NCFM是一株具有益生特性的菌株，從1972年開始就已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)酵食品中。Karolina Sulek[32]等人利用代謝組學技術(shù)研究了L.aci?dophilus NCFM在不同pH值下的代謝圖譜，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中L.acidophilus NCFM能夠提高乳酸、琥珀酸、腺嘌呤和精氨酸的濃度，在pH值為5和7的條件下代謝物沒有明顯的變化，這就意味著其他因素也許比pH值這個因素更大影響其在腸道的定植。Kamalrul Azlan[33]等研究了在不同培養(yǎng)溫度（30℃和37℃）下L.lactis的代謝圖譜，研究發(fā)現(xiàn)，在30℃和37℃（不攪拌的情況下），主要的代謝產(chǎn)物是伯醇、醛、酮和有機酸。在30℃攪拌的培養(yǎng)條件下，代謝產(chǎn)物最為豐富的是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。Margreet I.Pastink等人利用代謝組學的方法研究了S.thermophilus和兩株其它的乳酸菌（L.lactis和L.plantarum），S.thermophilus在生長過程中需要兩種氨基酸（半胱氨酸和組氨酸），而L.lactis和L.plantarum在其生長過程中分別需要6種和11種氨基酸[34]。

研究人員應(yīng)用代謝組學的方法研究乳酸菌發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物的變化能夠預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)品的感官和營養(yǎng)性質(zhì)，Seung-ok Yang等人利用NMR分析技術(shù)研究乳酸菌發(fā)酵豆乳的代謝圖譜，研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵期間碳水化合物的數(shù)量顯著減少，同時乳酸和琥珀酸的濃度增加，而蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸、棉籽糖、水蘇糖、蔗糖、苯丙氨酸在發(fā)酵期間逐漸減少，這是因為嗜熱鏈球菌將延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸，將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸[35]。大醬調(diào)料是韓國傳統(tǒng)的烹飪調(diào)料和制作傳統(tǒng)的韓國大醬和大醬膏的主要原料，主要利用自然界中的霉菌和乳桿菌。Hee Joo Kang[36]等人利用UPLC-QTOF-MS分析了在發(fā)酵期間代謝物的變化，共鑒定氨基酸、小肽、核酸、尿素循環(huán)的中間產(chǎn)物和有機酸等22種代謝物，這些代謝物都和它的感官性質(zhì)有著密切的關(guān)系，可以作為它的生物標記物。

代謝組學技術(shù)在干酪的感官模型的建立中應(yīng)用也非常廣泛。Ochi[37]等人采GC-TOF–MS技術(shù)分析了來自不同國家、不同種類的干酪（Cheddar、Gouda和Parmigiano Reggiano）的主要成分。Parmigiano Reg?giano的色譜圖明顯和Cheddar、Gouda不同，盡管Cheddar和Gouda制作方法和成熟過程不同，但對代謝圖譜沒有顯著的影響，并顯示相似的峰。結(jié)果表明大量小分子的親水性物質(zhì)和精氨酸、亮氨酸、焦谷氨酸、甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸等氨基酸賦予干酪特有的風味。而干酪酸味的主要成分是4-氨基丁酸、乳酸和鳥氨酸。Mazzei[38]等利用HRMAS-NMR代謝組學技術(shù)探討了Mozzarella di Bufala Campana(MBC)的性質(zhì)，和其他樣品相比，主要是半乳糖、乳糖、乙酸和甘油有明顯的區(qū)別。C.Le Boucher[39]等人利用LC-MS和GC-MS技術(shù)研究了干酪的微生物代謝圖譜。45個差異代謝物質(zhì)被鑒定，包括12種氨基酸、25種風味物質(zhì)、4種維生素、還有尿酸、肌酸、L-肉毒堿等。Fio?re Sardo(FS)是一種以羊奶為原料制作的意大利的傳統(tǒng)干酪，Cristina Piras[40]等人利用NMR技術(shù)研究了傳統(tǒng)的FS在成熟階段的代謝圖譜，四種FS采用傳統(tǒng)工藝制作，在制作過程中添加了不同的乳酸菌（Lactococ?cus、Enterococcus、Lactobacillus.Lactococci和lactobacilli）和市售發(fā)酵劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)工藝制作添加了從干酪中分離的乳酸菌的干酪和市售發(fā)酵劑所制作的干酪的代謝圖譜顯著不同，通過有機酸、碳水化合物、氨基酸等代謝產(chǎn)物的變化表明在傳統(tǒng)的FS干酪的制作過程中，應(yīng)使用本土的乳酸菌發(fā)酵劑才能保持FS干酪的特有的風味。

工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵制品通常采用多菌株進行混合發(fā)酵，利用之間的相互作用保障產(chǎn)品的基本特性?；旌习l(fā)酵的代謝物直接和發(fā)酵制品在發(fā)酵期間和發(fā)酵后的感官等性質(zhì)有著密切的聯(lián)系，也和所涉及的菌株的群體動力學有關(guān)，因此微生物的組成和群體動力學微小的變化對產(chǎn)品的基本性質(zhì)影響很大[41-42]。Frank A.M.de Bok[43]等人采用GC-MS分析了不同的混合發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶樣品芳香物質(zhì)的圖譜，研究發(fā)現(xiàn)很多來源于關(guān)鍵風味的質(zhì)量峰在單個菌株或其制品中沒有，而在混合菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中濃度較高?？梢宰C明這種方法可以用來根據(jù)不同的風味物質(zhì)來源于不同的菌株或混合菌株，可以把這些物質(zhì)作為其特有菌株的生物標記物。

2.2 代謝組學在功能食品中的應(yīng)用

功能性食品中所包含的一些特有成分能夠減輕一些疾病的危害，提高人體健康。近幾年來，在國內(nèi)外市場上益生菌、益生元和合生元的功能性食品引起了廣泛的關(guān)注，在下面的綜述中，主要討論利用代謝組學技術(shù)研究益生菌對人體腸道的影響。

人的腸道是一個復(fù)雜、活躍、同時維持著相對平衡的系統(tǒng)。其中定植著數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物群落，因此，被人們稱為“超級生物體”。這個生態(tài)系統(tǒng)擁有大約1014個細胞，大約500～1000種細菌，包含100多萬個基因，數(shù)目是人類基因組的100倍。其中的30～40種優(yōu)勢細菌構(gòu)成了人體腸道細菌總量的99%[44]。利用基因組學、蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學研究益生菌對腸道的影響研究較多，近年來，通過代謝組學研究益生菌對腸道的影響的研究也逐漸增加。

通過GC-MS分析技術(shù)，De Preter[45]等人通過體外的糞便模型，研究了富含低聚果糖菊粉的益生元的糖化發(fā)酵對腸道的影響。共鑒定了107種揮發(fā)性有機化合物，酸、酯和某些醛的濃度隨著菊粉的添加量的增加而增加，而有一些有毒蛋白發(fā)酵產(chǎn)生的含硫化合物和酚類化合物的濃度降低。最近幾年，以無菌動物模型研究益生菌或病原微生物對宿主的影響的方法也逐漸發(fā)展起來。Martin[46]等人通過NMR技術(shù)分析了無菌小鼠的腸道的不同部分，證實了一些益生菌對宿主的影響。研究者發(fā)現(xiàn)飼喂一定劑量的L.paracasei NCC2461能夠提高空腸中乳酸的含量，在空腸和回腸中膽堿、磷脂酰膽堿、醋酸的含量降低，而這些成分是脂肪代謝的重要的中間產(chǎn)物，說明乳酸菌能夠調(diào)整腸道的脂代謝。Martin[47]等人還模擬嬰兒腸道內(nèi)的微生物種群，在無菌小鼠的腸道內(nèi)定植益生菌L.paraca?sei NCC2461和L.rhamnosus NCC4007，并采用HRMAS-NMR技術(shù)分析腸道、血液、尿液和糞便的提取物，發(fā)現(xiàn)這些益生菌能夠改變肝脂肪代謝，減少血液中脂蛋白的水平和促進糖酵解。Martin[48]等人研究了共生系統(tǒng)對無菌小鼠的影響，利用益生菌和益生元來模擬嬰兒腸道的微生物。這些菌的變化直接關(guān)系到一些脂肪酸的濃度，高濃度的低聚糖能夠提高乙酸的濃度。谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸和纈氨酸的濃度降低，5-氨基戊酸的濃度提高。Wikoff等人采用LC-MS代謝組學技術(shù)分析了無菌小鼠和常規(guī)小鼠的血液中代謝物，證實益生菌能夠影響腸道微生物的氨基酸代謝和抗氧化物質(zhì)吲哚-3-丙酸的合成[49]。

另一個研究腸道微生物對宿主影響的模型就是腸應(yīng)激綜合癥模型，Hong[50]等人通過NMR技術(shù)分析了曾經(jīng)患有腸應(yīng)激綜合癥的患者服用2個月含有乳酸菌和雙歧桿菌的發(fā)酵乳的血清和糞便樣品。研究發(fā)現(xiàn)在食用發(fā)酵乳后，血液中葡萄糖、酪氨酸和乳酸的濃度發(fā)生了改變。Simon M.M.Pedersen[51]等人通過GC-MS分析患有腸應(yīng)激綜合癥的患者在食用了8周含有益生菌L.paracasei F19、L.acidophilus LA-5和Bifi?dobacterium lactis BB-12的酸奶，研究發(fā)現(xiàn)短期的酸奶的干預(yù)導致血清中乳酸、谷氨酸、脯氨酸、肌酸和天冬氨酸的濃度增加，而降低了患者血清中葡萄糖的濃度。Young-Shick Hong[52]等人通過NMR代謝組學的方法研究了益生菌對小鼠的大腸炎的影響。研究發(fā)現(xiàn)益生菌通過改變小鼠的腸道微生物對腸道起到保護作用，谷氨酸、脯氨酸、乙酸、丁酸和谷氨酰胺等代謝物濃度增加，而三甲胺的濃度降低。Ponnusamy[53]等人發(fā)現(xiàn)患有腸應(yīng)激綜合癥的患者和正常成年人的腸道的代謝物有明顯的不同，并發(fā)現(xiàn)了代謝物和腸道內(nèi)微生物的相關(guān)性。

代謝組學的方法是一種非常有效的研究益生菌對宿主健康的影響的分析工具。這個“組學”和宿主的蛋白質(zhì)組學和基因組學一起能夠提供新的生物學信息來解釋益生菌對消費者健康的影響。

3 結(jié)束語

代謝組學技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵的食品，如大豆發(fā)酵食品、干酪、酒等，在對功能性食品的研究中也取得了一定的進展，作為一個新興的領(lǐng)域，還有許多問題需要我們?nèi)ス餐鎸徒鉀Q：(1)淬滅導致的胞內(nèi)代謝物泄露，影響數(shù)據(jù)的準確性，研究者應(yīng)對每一種微生物的淬滅的方法進行優(yōu)化，建立完整可行的淬滅方法；(2)缺少標準化、全面的代謝組學數(shù)據(jù)庫。大腸桿菌、酵母菌已經(jīng)建立了相應(yīng)的代謝組學數(shù)據(jù)庫，帶關(guān)于乳酸菌的標準代謝數(shù)據(jù)庫目前還沒有完善，為了系統(tǒng)的研究生物科學，應(yīng)建立系統(tǒng)完整的標準化數(shù)據(jù)庫，從而能全面的和其他組學相聯(lián)系，更好的詮釋生物體的生物信息。在今后的研究中，將代謝組學技術(shù)進一步應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵食品的質(zhì)量和安全性等評估，并結(jié)合基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學更好的詮釋益生菌對人類疾病的有益的影響。

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Application of metabolomics in fermented and functional food with Lactic acid bacteria

WANG Yuenan,SUN Tiansong
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018,China)

The sample preparation,analysis and identification of metabolites and data analysis involved in the research of metabolomics of Lac?tic acid bacteria are summarized in the review.The achievements of fermented foods by Lactic acid bacteria and the beneficial effects of probiotic food in gut are discussed.

metabolomics;Lactic acid bacteria;fermented food;probiotics;functional food

Q935

B

1001-2230（2017）05-0027-05

2016-10-09

王越男（1978-），女，講師，博士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

孫天松