人乳脂中甘油三酯分析方法及組成的研究進(jìn)展

韋 偉，張星河，金青哲，王興國(guó)(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

母乳是一種天然的功能性食品，母乳的營(yíng)養(yǎng)十分豐富，為新生兒提供生命中前幾個(gè)月所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且根據(jù)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育不斷地調(diào)整。母乳的組成復(fù)雜，目前研究者們發(fā)現(xiàn)母乳含有2 000多種物質(zhì)，其中300多種是嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的成分。母乳中的脂肪，也稱為人乳脂(HMF)，占母乳總量的3%～5%，是母乳中一種重要的組成成分。人乳脂是母乳中主要的能量來源，為嬰兒提供了約一半的能量，同時(shí)富含具有特殊生理功能的脂肪酸和復(fù)雜脂類，也是脂溶性維生素的載體。

甘油三酯(TAG)是人乳脂中含量最多的一類脂質(zhì)，約占98%。由于甘油三酯含有較多的同分異構(gòu)體，各種同分異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)相近，對(duì)其定性、定量分析都有一定的難度。人乳脂中脂肪酸組成非常復(fù)雜，因此甘油三酯同分異構(gòu)體更多，而且大多數(shù)組成含量不到1%，分離分析的難度高。以往的乳脂肪甘油三酯的分析方法多是通過總脂肪酸組成和sn-2位脂肪酸組成計(jì)算得到。近年來，基于新型的分離技術(shù)如超臨界流體色譜、檢測(cè)技術(shù)如多維質(zhì)譜技術(shù)等的迅速應(yīng)用，加速了人們對(duì)甘油三酯立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。

研究人乳脂甘油三酯組成的目的在于了解其生理功能和應(yīng)用于人乳替代脂的開發(fā)。人乳脂中甘油三酯組成的分析為適合于我國(guó)嬰幼兒的配方奶粉用油的研究奠定了基礎(chǔ)。甘油三酯的分析還可用于建立基于甘油三酯的油脂識(shí)別模型。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室近期的研究工作和國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 人乳脂中甘油三酯的分析方法

1.1 人乳脂中甘油三酯的提取

人乳脂含有98%～99%的甘油三酯，0.26%～0.80%的磷脂，0.25%～0.34%的固醇(主要是膽固醇)，微量的甘油一酯、甘油二酯、游離脂肪酸和其他脂類成分。人乳脂中的甘油三酯的分析需要首先提取甘油三酯。目前最高效簡(jiǎn)便的方法是薄層色譜法(TLC)。通過TLC技術(shù)，采用硅膠G作為吸附劑，正己烷、乙醚和乙酸(或者甲酸)作為流動(dòng)相可以實(shí)現(xiàn)甘油三酯的提取。

1.2 人乳脂中甘油三酯的分離

非水反相高效液相色譜(RP-HPLC)是測(cè)定人乳脂中甘油三酯最常用的液相方法。甘油三酯是弱極性化合物，難溶于水，有機(jī)溶劑可增加甘油三酯的溶解性，廣泛使用的有機(jī)溶劑的組合是丙酮和乙腈[1]。固定相最常用的是十八烷基鍵合的硅膠柱(C18或ODS)。RP-HPLC分析甘油三酯的出峰按照碳原子當(dāng)量數(shù)的大小依次洗脫。

銀離子高效液相色譜是分離人乳脂中甘油三酯同分異構(gòu)體的最有效的色譜方法[2]。甘油三酯根據(jù)其組成脂肪酸的不飽和程度不同而得到分離，甘油三酯分子中雙鍵數(shù)量越多，保留時(shí)間越長(zhǎng)。甘油三酯分離先后順序是：SSS、SSM、SMM、SSD、MMM、SMD、MMD、SDD、SST、MDD、SMT、MMT、DDD、SDT、MDT、DDT、STT、MTT、DTT、TTT，其中S、M、D、T分別為飽和、單不飽和、含有兩個(gè)及三個(gè)雙鍵的脂肪酸。分離甘油三酯同分異構(gòu)體的出峰先后順序?yàn)閇1]：SMS、SSM、SMM、MSM、SDS、SSD、DSD、DDS、DMD、DDM。

高溫氣相色譜法分析甘油三酯穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性好,但只適用于脂肪酸飽和度較高的樣品[3]，不飽和度較高的甘油三酯可能會(huì)在高溫下氧化裂解[4]。甘油三酯的出峰順序按照其碳總數(shù)(CN)從小到大出峰[1]。目前主要采用非極性和中等極性兩種填料，前者能得到不同CN的甘油三酯，而后者可以具體到單個(gè)甘油三酯的種類。一種常用的WCOT柱(材料為熔融石英，具有甲基苯基硅氧烷聚合物的涂層，25 m×0.25 mm)分離甘油三酯的出峰先后順序?yàn)椋篠SS、SSM、SSD、MMM、SDM、MMD、SDD、MDD、DDD、DDT。

超臨界流體色譜(SFC)是氣相色譜和高效液相色譜的重要補(bǔ)充技術(shù)，流動(dòng)相是液化氣體(通常是CO2)[5]。SFC使用與GC類似的色譜柱，如果添加改性劑可以實(shí)現(xiàn)更好的分辨率，將甘油三酯同分異構(gòu)體進(jìn)行分離和鑒定。甘油三酯的出峰先后順序?yàn)椋篠MD、MMM、SDD、MMD、MMT、MDD、DDD、MDT、MTT、DDT、DTT[6]。

1.3 人乳脂中甘油三酯的測(cè)定

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種通用型的質(zhì)量檢測(cè)器。ELSD可以用有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑蒸發(fā)，所以對(duì)于非水相、揮發(fā)性高的有機(jī)溶劑測(cè)定結(jié)果沒有基線漂移帶來的誤差。ELSD對(duì)于甘油三酯的靈敏度顯著高于紫外檢測(cè)器和折光檢測(cè)器，是目前測(cè)定人乳脂中甘油三酯最常用的檢測(cè)器。

質(zhì)譜(MS)不僅具有常見檢測(cè)器的檢測(cè)功能，還同時(shí)具備化學(xué)結(jié)構(gòu)解析功能，可以在無標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，利用特征碎片離子即可進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)分析。MS與其他色譜技術(shù)的聯(lián)用(如GC-MS，HPLC-MS)，大大提高了甘油三酯分析的靈敏度和準(zhǔn)確度，為甘油三酯的分析提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。目前，適用于甘油三酯分析的MS電離源主要有電噴霧源(ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、大氣壓光電離源(APPI)等。

ESI理論上并非最適用于甘油三酯分析,但由于甘油三酯的手性結(jié)構(gòu)，sn-2位的脂肪酸較sn-1,3 位更難斷裂，因此可用于確定甘油三酯的結(jié)構(gòu)[7-8]。APCI是分析甘油三酯的一種較為理想的技術(shù)手段[9]。APCI譜圖上，甘油三酯主要形成3種特征碎片離子：[M+H-RCOOH]+、[M+H-RCOO-R’CO]+和[RCO]+，可根據(jù)其[DAG]+碎片及豐度判斷TAG組成及脂肪酸的?；恢肹10]。APPI與APCI相似，適用于甘油三酯的分析。但APPI質(zhì)譜圖中甘油三酯共有4種特征離子，即：[M+H]+、[M]+、[RCO]+和[RCO-H2O]+。其中較為特別的是[RCO-H2O]+，該離子碎片不會(huì)出現(xiàn)在甘油三酯相應(yīng)的ESI質(zhì)譜圖中，但這個(gè)信息對(duì)于甘油三酯鑒定卻十分有用[11]。

常用的其他質(zhì)譜儀還有四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF/MS),可在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨、得到物質(zhì)準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量、能夠獲得真實(shí)的同位素峰形成分布，同時(shí)具有高靈敏度的串聯(lián)質(zhì)譜功能[12]。該技術(shù)得到未知物的分子式，既可用于甘油三酯的定性與定量，也可用于脂質(zhì)組學(xué)的研究。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可以有效地解決軟離子化技術(shù)(如ESI、MALDI等)造成的碎片離子信息不夠的問題，解決問題的方法是在這些軟離子碎片的基礎(chǔ)上串聯(lián)另外一個(gè)質(zhì)譜[13]。串聯(lián)質(zhì)譜能實(shí)現(xiàn)母離子和子離子的精確質(zhì)量測(cè)定，是目前鑒定甘油三酯及同分異構(gòu)體最有效的方法之一。

2 人乳脂中的甘油三酯組成

2.1 不同國(guó)家及地區(qū)人乳脂中甘油三酯的組成

Breckenridge等[14]采用GC配備氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)測(cè)定人乳脂中甘油三酯組成。結(jié)果顯示，加拿大人乳脂中主要的甘油三酯類型為C52(39.0%)、C50(17.6%)、C54(16.4%)、C48(9.0%)和C46(5.5%)，甘油三酯?；荚訑?shù)最高為C60，最小為C38。采用GC測(cè)定的人乳脂中甘油三酯主要為C52(約占40%)，但是其中具體的結(jié)構(gòu)和含量不得而知。通常結(jié)合脂肪酸和甘油三酯碳骨架sn-2位脂肪酸含量，大致猜測(cè)甘油三酯的結(jié)構(gòu)[15-16]。目前兩者結(jié)合的方法在結(jié)構(gòu)甘油三酯(1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯等)合成上經(jīng)常被使用[17]，主要是由于設(shè)備要求低，方法簡(jiǎn)便，但是不能測(cè)定甘油三酯的具體結(jié)構(gòu)和含量。

Morera等[18]利用HPLC-ELSD分析了西班牙47個(gè)不同哺乳時(shí)期的母乳中甘油三酯組成，共分離出30種甘油三酯[19]。結(jié)果顯示有些甘油三酯的含量范圍比較廣(OPO含量17.56%～42.44%，OPL含量9.24%～38.15%)，另外有一些甘油三酯(LaMO、CaPO、LaCaO、LaPCa、LaOL等)的含量受到不同因素的影響較小，可以考慮作為人乳脂的指紋識(shí)別。隨后又利用HPLC-ELSD測(cè)定了西班牙40個(gè)母乳成熟乳中的甘油三酯，并分析其組成與不同因素間的聯(lián)系。Zou等[20]在45個(gè)丹麥母乳中分離并鑒定22種甘油三酯，其中含量較高的甘油三酯是OPO(21.52%)、OPL(16.93%)、OPLa+MMO(10.39%)、PPL(7.15%)和MLaO+POCa(6.65%)。夏袁[21]測(cè)定了我國(guó)無錫309個(gè)母親在不同哺乳時(shí)期(每個(gè)時(shí)期103個(gè)樣品)的人乳脂甘油三酯組成，分離并鑒定出25種甘油三酯。結(jié)果表明，含量最高的甘油三酯為OPL(23.24%～28.34%)，其次是OPO(13.87%～19.47%)，除此之外，含量相對(duì)較高、平均含量大于5%的甘油三酯為OLL、PLL、MOL、POLa、PPO。

Haddad等[22]采用RP-HPLC配備二極管陣列檢測(cè)器和GC測(cè)定了8名意大利志愿者母親的成熟乳的甘油三酯，并用RP-HPLC串聯(lián)ESI-MS3對(duì)甘油三酯進(jìn)行了鑒定。共鑒定出98種甘油三酯分子，其中含量較高的是OPO(13.587%)、PPO/MSO(9.790%)、LaPO/MMO/MPPo(8.078%)、MOO/PPL/MSL/PpoO(7.449%)、PLL/PoOL/POLn(7.067%)。Kim等[23]測(cè)定了美國(guó)母乳中甘油三酯的組成，利用高離析液相色譜法對(duì)甘油三酯進(jìn)行分離，利用ESI-MS 對(duì)甘油三酯進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，含量最高的甘油三酯是PPO(11.00 mg/L)、OPL(10.14 mg/L)、OPO(9.87 mg/L)、SPL(9.87 mg/L)和SPO(6.66 mg/L)，共測(cè)定出21種甘油三酯。Ten-Doménech等[24]利用RP-HPLC 配備UV和ELSD兩種檢測(cè)器測(cè)定15個(gè)來自西班牙的不同哺乳時(shí)期的人乳脂甘油三酯，共鑒定出42種甘油三酯，兩種方法測(cè)定出的高含量的甘油三酯分別是OPO(20.3%、20.21%)、OPL(9.88%、10.1%)、LaPO/MMO(7.39%、7.30%)。

Tu等[25]采用SFC串聯(lián)Q-TOF-MS測(cè)定了我國(guó)54個(gè)不同區(qū)域(北京、湖北和四川)、不同泌乳時(shí)期的人乳脂中甘油三酯的組成，共分離鑒定64種甘油三酯。結(jié)果顯示，不同地區(qū)和泌乳時(shí)期的人乳脂中含量最高的甘油三酯都是OPL(10.09%～5.84%)，其次分別是OPP、OLO、SOL、OLL、SPO、OMM、OLL和OPLa。

Kallio等[26]采用UPLC-MS和UPLC-MS/MS測(cè)定了芬蘭和我國(guó)人乳脂中甘油三酯的組成，共鑒定300多種甘油三酯同分異構(gòu)體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在芬蘭人乳脂中含量較高的甘油三酯分別是OPO(9.4%)、OPL(5.4%)、OPLa(3.5%)、OPS(3.2%)、OMO(3.2%)、OPP(3.0%)、OLaO(2.5%)和OOO(2.5%)。而我國(guó)人乳脂中含量較高的甘油三酯分別是OPL(10.3%)、OPO(7.1%)、LPL(4.5%)、LLO(3.3%)、OPS(2.4%)、LOO(2.4%)、OPP(2.4%)、LlaO(2.2%)和OPLa(2.1%)。同分異構(gòu)體差異超過2%的甘油三酯在芬蘭人乳和我國(guó)人乳中分別占32.7%和36.7%。

2.2 不同泌乳時(shí)期母親的人乳脂中甘油三酯組成

研究表明人乳在分泌過程中會(huì)隨著嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育的需要而發(fā)生改變，通常將嬰兒出生后1～5 d(或7 d)的母乳稱為初乳，出生后6～15 d的母乳稱為過渡乳，出生16 d及之后的母乳稱為成熟乳。

夏袁[21]發(fā)現(xiàn)我國(guó)無錫地區(qū)309個(gè)人乳脂樣品中，3個(gè)哺乳時(shí)期的人乳脂中甘油三酯組成有一定的區(qū)別，含量最高的甘油三酯為OPL，3個(gè)哺乳時(shí)期分別是28.34%、23.24%、24.92%，僅次于OPL的是OPO，含量分別是19.47%、14.05%、13.87%。Morera等[19]測(cè)定了不同哺乳時(shí)期的人乳脂中甘油三酯，發(fā)現(xiàn)每個(gè)哺乳時(shí)期人乳脂中甘油三酯呈現(xiàn)特定的組成，幾種甘油三酯在不同泌乳時(shí)期的人乳脂中顯著不同，含量最高的甘油三酯是OPO和OPL，在初乳、過渡乳和成熟乳中分別占到29.07%、20.11%，19.23%、14.97%和23.73%、18.8%。Tu等[25]發(fā)現(xiàn)，不同泌乳時(shí)期的人乳脂中甘油三酯組成有一定的區(qū)別，并且都與嬰兒配方奶粉中的甘油三酯組成有顯著的區(qū)別。

上述研究表明，3個(gè)哺乳時(shí)期的人乳脂不僅營(yíng)養(yǎng)成分含量區(qū)別較大，構(gòu)成也顯著不同，但是目前觀察到的變化沒有統(tǒng)一的規(guī)律。未來應(yīng)該對(duì)不同哺乳期人乳脂中甘油三酯的變化規(guī)律及機(jī)制進(jìn)行研究，用以指導(dǎo)不同階段嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)。

2.3 母親飲食對(duì)人乳脂中甘油三酯組成的影響

近年來研究表明，人乳脂中甘油三酯組成的差異主要受母親飲食的影響。Linderborg等[27]用兩種方法(陰離子APCI-MS/MS和陽(yáng)離子UPLC/ESI-MS/MS)分析了芬蘭西南部的不同飲食和體質(zhì)指數(shù)母親的人乳脂中甘油三酯組成。結(jié)果顯示，母親的體重和飲食會(huì)影響甘油三酯的分布，但對(duì)甘油三酯的位置特異性的影響是相同的。食用推薦飲食的正常體重母親的人乳脂中含有更高含量的亞麻酸(Ln)和較少含量的硬脂酸(S)。無論是哪種人乳脂，其中含量最高的甘油三酯是OPO(約14.6%)。

夏袁[21]也發(fā)現(xiàn)我國(guó)無錫地區(qū)的志愿者母親的人乳脂中甘油三酯含量最高的是OPL，通過膳食調(diào)查與人乳脂組成比較發(fā)現(xiàn)飲食對(duì)于人乳中甘油三酯的組成有影響，不同于普遍報(bào)道中含量最高的OPO，無錫地區(qū)的母親可能因?yàn)槭秤幂^多的海產(chǎn)品(富含亞油酸)而在人乳中有較高的OPL。

3 結(jié)束語(yǔ)

甘油三酯是人乳脂中含量最高的脂質(zhì)。通過對(duì)人乳脂中甘油三酯組成的總結(jié)，可以得到以下結(jié)論：①不考慮光學(xué)異構(gòu)體，人乳脂中含有至少三四百種甘油三酯；②不同地區(qū)的人乳脂中甘油三酯有一定的差異，普遍報(bào)道中含量最高的甘油三酯是OPO，我國(guó)母親的人乳脂中含量較高的是OPL；③人乳脂中甘油三酯組成受到母親飲食的影響，不同哺乳時(shí)期的人乳脂中甘油三酯組成不同。

未來的研究方向包括如下幾個(gè)方面：①多維色譜技術(shù)和多維質(zhì)譜技術(shù)。多維色譜可以對(duì)同分異構(gòu)體達(dá)到很好的分離，但是受到流動(dòng)相的影響，目前多維色譜應(yīng)用在甘油三酯的研究多為離線二維色譜，開發(fā)新型的儀器設(shè)備或者色譜柱填充材料是研究方向之一?；谫|(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法，尤其是多維質(zhì)譜技術(shù)可以有效地鑒定更多甘油三酯的結(jié)構(gòu)。②人乳脂中甘油三酯組成的大數(shù)據(jù)分析。搜集不同國(guó)家、地區(qū)、民族、飲食等的母親的母乳，分析其中甘油三酯的組成，研究不同國(guó)家、地區(qū)、民族等因素與人乳脂中甘油三酯的聯(lián)系，考察飲食、哺乳時(shí)期、身體狀況等因素對(duì)人乳脂中甘油三酯的影響，建立基于甘油三酯的指紋信息識(shí)別圖譜。③開發(fā)適合于我國(guó)寶寶的嬰幼兒配方奶粉用油。根據(jù)我國(guó)人乳脂的數(shù)據(jù)，開發(fā)適合我國(guó)寶寶“個(gè)性化”的營(yíng)養(yǎng)需求的嬰幼兒配方奶粉用油也是未來的研究重點(diǎn)。

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