洛伐他汀對(duì)抗人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞β-淀粉樣蛋白的非膽固醇依賴性保護(hù)作用*

趙 亮， 官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科, 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

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洛伐他汀對(duì)抗人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞β-淀粉樣蛋白的非膽固醇依賴性保護(hù)作用*

趙 亮1,2， 官志忠2,3,4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科, 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 觀察洛伐他汀對(duì)過(guò)表達(dá)APP670/671的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞活性及β-淀粉樣蛋白(Aβ)二聚體合成的影響。方法： 轉(zhuǎn)染并鑒定過(guò)表達(dá)APP670/671的SH-SY5Y細(xì)胞，篩選無(wú)細(xì)胞毒性、不影響細(xì)胞膽固醇水平濃度的洛伐他汀處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率，蛋白印跡法檢測(cè)Aβ二聚體的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果： 過(guò)表達(dá)APP670/671的SH-SY5Y細(xì)胞中APP的蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯高于野生型細(xì)胞；用 0.1 μmol/L的洛伐他汀處理SH-SY5Y細(xì)胞，未見明顯細(xì)胞毒性作用，膽固醇水平亦未見明顯改變；0.1 μmol/L洛伐他汀預(yù)處理 SH-SY5Y細(xì)胞24 h，能提高細(xì)胞存活率，減少Aβ二聚體的分泌。結(jié)論： 洛伐他汀具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能與減少毒性Aβ的合成有關(guān)。

洛伐他?。?β-淀粉樣蛋白； 淀粉樣前體蛋白； 阿爾茲海默病

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，是老年人最常見的癡呆病因[1-2]。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)單體以及構(gòu)成老年斑的Aβ纖絲體都不是造成神經(jīng)毒性的主要Aβ形式，而可溶性寡聚Aβ是產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要Aβ形式。有研究證實(shí)人和轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦組織中至少可以產(chǎn)生4種可以改變神經(jīng)元和認(rèn)知功能的可溶性Aβ寡聚體分子：二聚體、三聚體、Aβ*56和環(huán)狀原纖維，對(duì)神經(jīng)元突觸產(chǎn)生不同的毒性作用[3]。目前，對(duì)于AD的預(yù)防和治療仍缺乏有效的措施。他汀類藥物能通過(guò)抑制β-羥-β-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)的活性并減少內(nèi)源性膽固醇的合成，常用于治療伴有膽固醇增高的心血管疾病[4]。越來(lái)越多的研究顯示，他汀類還具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)多種神經(jīng)退行性疾病，例如AD、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥、腦缺血等，具有潛在的治療作用[5]。他汀類藥物在神經(jīng)退行性疾病中的作用，是直接與其降膽固醇效應(yīng)相關(guān)、還是有賴于非降膽固醇依賴性的其他多重效應(yīng)，目前尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)將洛伐他汀(Lovastatin)作用于過(guò)表達(dá)Swedish 670/671變異APP基因的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞)，了解洛伐他汀非膽固醇依賴性抗毒性Aβ的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞獲贈(zèng)于瑞典卡洛琳斯卡大學(xué)。主要試劑：洛伐他汀、膽固醇定量試劑盒、Aβ1-42(美國(guó)Sigma公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本Dojindo公司)； SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；BCA蛋白定量試劑盒，cDNA合成試劑盒，TRIzol試劑(美國(guó)Thermo公司)；NuPAGE Novex 4%～12% Bis-Tris預(yù)制膠、MES SDS電泳液(美國(guó)Life Technologies公司)；SYBR green master和X-treme GENE 9 DNA轉(zhuǎn)染試劑(瑞典Roche公司)，PVDF膜、ECL試劑盒(德國(guó)Merck Millipore公司)。小鼠抗Aβ多克隆抗體6E10(美國(guó)Covance公司)，兔抗β-actin抗體(Abmart公司)，抗兔IgG(美國(guó)Cell Signaling公司)，抗小鼠IgG(美國(guó)Santa Cruze公司)。pcDNA 3.0質(zhì)粒及攜帶Swedish 670/671變異APP基因的pcDNA 3.0質(zhì)粒獲贈(zèng)于瑞典卡洛琳斯卡大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及APP(Swedish 670/671)基因轉(zhuǎn)染 參考文獻(xiàn)[6]中的方法，將SH-SY5Y細(xì)胞接種于DMEM高糖型培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 000 U/L和鏈霉素100 000 U/L)，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%，按照X-tremeGENE 9 DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，將空載pcDNA 3.0質(zhì)粒或攜帶Swedish 670/671變異位點(diǎn)APP基因的pcDNA 3.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，培養(yǎng)72 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以上轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備每次3份，重復(fù)3次。

1.2.2 轉(zhuǎn)染APP(Swedish 670/671)基因的細(xì)胞鑒定 (1)APP mRNA表達(dá)水平檢測(cè)，根據(jù)APP670/671基因設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物，上游序列為AAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATC，下游序列為TGGATTTTCGTAGCCGTTCTG，產(chǎn)物大小為235 bp；β-actin引物購(gòu)自ABI公司，序列號(hào)為4352935E，收集SH-SY5Y WT細(xì)胞(僅含pcDNA3.0質(zhì)粒)和SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞(含攜帶human APP670/671 pcDNA3.0質(zhì)粒)，用TRIzol法提取細(xì)胞mRNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用ABI PRISM 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，檢測(cè)APP670/671基因的mRNA表達(dá)。(2)APP蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，收集SH-SY5Y WT細(xì)胞和SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑苯甲基硫酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，DC蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。選取4%～12%的Bis-Tris預(yù)制梯度膠，將等量蛋白與含還原劑的上樣緩沖劑混合后，70 ℃加熱10 min，加入預(yù)制膠的孔中電泳，120 V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封閉2 h，小鼠抗Aβ 6E10抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗孵育1 h，用ECL發(fā)光試劑觀察表達(dá)情況。

1.2.3 洛伐他汀處理細(xì)胞及指標(biāo)檢測(cè) 取鑒定后的SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%時(shí)，去血清培養(yǎng)12 h，加入洛伐他汀(0.01、0.1及1 μmol/L)分別處理24 h，檢測(cè)細(xì)胞毒性及膽固醇水平。為檢測(cè)洛伐他汀抗A(的神經(jīng)保護(hù)作用，將SH-SY5Y WT細(xì)胞和SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞分別以相同的濃度(1×109個(gè)/L)接種培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%，加入洛伐他汀培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測(cè)如下檢測(cè)。(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性。取SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)/孔濃度接種于96孔板中，每個(gè)濃度藥物處理的細(xì)胞設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至計(jì)劃時(shí)間后，將每孔的原始培養(yǎng)基取出并加入不含血清及藥物的純培養(yǎng)基100 μL，空白對(duì)照組加入100 μL無(wú)細(xì)胞純培養(yǎng)基，然后每孔中加入CCK-8試劑10 μL ，37 ℃孵育2 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度[7]。(2)膽固醇水平檢測(cè)，膽固醇濃度測(cè)定按照膽固醇定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。去除培養(yǎng)基，PBS洗3次后，每孔加入氯仿∶異丙醇∶IGEPAL CA-630(7∶11∶0.1)溶液200 μL，裂解細(xì)胞后14 000 g離心10 min，取上層有機(jī)相于新管中，50 ℃溫箱中空氣干燥，真空抽吸30 min，干燥脂質(zhì)用Cholesterol Assay Buffer進(jìn)行溶解，震蕩混勻，按試劑盒說(shuō)明加入試劑和樣品，同時(shí)應(yīng)用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按50 μL/孔將反應(yīng)混合物加入96孔板，混勻后37 ℃避光孵育1 h，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。計(jì)算膽固醇濃度(C)：C=Sa/Sv，[Sa為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品膽固醇含量(μg)，Sv為每孔加樣體積(μL)]。(3)蛋白印跡法檢測(cè)Aβ水平，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，15 000 g冷凍離心15 min，用western blotting方法(見1.2.2)檢測(cè)培養(yǎng)基中Aβ蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞鑒定

轉(zhuǎn)染APP(Swedish 670/671)基因的SH-SY5Y細(xì)胞，APP蛋白表達(dá)量較對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載pcDNA3質(zhì)粒的細(xì)胞明顯增高(P<0.01)，見圖1A。SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞APP mRNA表達(dá)量較對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載pcDNA3質(zhì)粒的細(xì)胞明顯增高(P<0.01)，見圖1B。

注：A為APP mRNA表達(dá)；B為APP蛋白表達(dá)；(1)與Con組比較，P<0.01圖1 SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞APP mRNA 及蛋白表達(dá)水平Fig.1 The mRNA and protein levels of APP in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.2 洛伐他汀細(xì)胞毒性試驗(yàn)

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，1 μmol/L洛伐他汀作用24 h，可見SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞存活率分別下降50%，與未加藥組(Con)相比，具有顯著差異(P<0.01)，所以在后面的研究中，選擇0.01和0.1 μmol/L濃度的洛伐他汀。

注：(1)與Con組比較， P<0.01圖2 洛伐他汀細(xì)胞毒性試驗(yàn)Fig.2 Cytotoxicity of lovastatin in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.3 洛伐他汀對(duì)膽固醇水平的影響

0.01、0.1、1 μmol/L洛伐他汀處理神經(jīng)細(xì)胞24 h，可見1 μmol/L洛伐他汀使神經(jīng)細(xì)胞膽固醇水平明顯下降(圖3)，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：(1)與Con組比較， P<0.05圖3 洛伐他汀對(duì)SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞膽固醇水平的影響Fig.3 Effect of lovastatin on cell cholesterol level in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.4 洛伐他汀對(duì)SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞活性的影響

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示， SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞去血清培養(yǎng)48 h，細(xì)胞存活率較SH-SY5Y/WT細(xì)胞顯著降低(43%)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在培養(yǎng)基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀可提高SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞的存活率，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：WT為SH-SY5Y/WT細(xì)胞，APPSWE為SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞，Lov為洛伐他??；(1)與[WT]組比較，P<0.05;(2)與[APPSWE]組比較，P<0.05圖4 SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞洛伐他汀抗 Aβ細(xì)胞活性試驗(yàn)Fig.4 Experiment of anti-Aβ by lovastatin in SH-SY5Y/APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

2.5 洛伐他汀對(duì)Aβ二聚體蛋白水平的影響

去血清培養(yǎng)細(xì)胞48 h，可見SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞與SH-SY5Y/WT細(xì)胞比較，Aβ二聚體蛋白水平明顯升高(P<0.05)；而在培養(yǎng)基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀共同培養(yǎng)，可降低SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞產(chǎn)生的Aβ二聚體蛋白水平(圖5)，與未用洛伐他汀處理的SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：WT為SH-SY5Y/WT細(xì)胞，APPSWE為SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞，Lov為洛伐他汀；(1)與[WT]組比較，P<0.05;(2)與[APPSWE]組比較，P<0.05圖5 SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞Aβ二聚體蛋白水平Fig.5 The protein level of Aβ dimer in SH-SY5Y/ APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

3 討論

隨著AD發(fā)病率的不斷增高，給病人、家庭乃至整個(gè)社會(huì)帶來(lái)了越來(lái)越沉重的負(fù)擔(dān)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球AD患者共有3 600萬(wàn)，預(yù)計(jì)至2030年，該數(shù)值將翻倍，至2050年，AD患者將達(dá)到1億[8]。為了應(yīng)對(duì)這種日漸嚴(yán)峻的狀況，急需尋找有效的干擾措施來(lái)阻止或推遲AD的發(fā)病、延緩AD病程、改善AD癥狀，然而自2004年來(lái)，并沒(méi)有新的抗AD藥物得到上市的批準(zhǔn)[9]?！袄纤幮掠谩钡姆椒ㄒ呀?jīng)成為眾多抗AD藥物開發(fā)的首選[10]。

近期的研究報(bào)道顯示他汀類藥物的應(yīng)用能降低61%的AD死亡率[11]。除了降膽固醇作用以外，他汀類藥物還能產(chǎn)生多種膽固醇非依賴性作用，影響多個(gè)重要的生理過(guò)程，例如，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、影響細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)Aβ代謝、tau蛋白代謝等[12-15]，產(chǎn)生抗癡呆效應(yīng)。然而，也有研究得出不同的結(jié)論。多個(gè)臨床隨機(jī)試驗(yàn)顯示他汀類藥物對(duì)于AD的治療沒(méi)有效果[16]。有研究顯示statins類藥物治療(無(wú)論是親脂性還是低親脂性)并不能影響65歲以上老人AD及其他癡呆發(fā)生的危險(xiǎn)性，甚至還有可能加重AD的病情[17]。有人推測(cè)可能與膽固醇的合成減少有關(guān)，導(dǎo)致以上不同結(jié)果的相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞模型，研究洛伐他汀抗Aβ神經(jīng)毒性損害的非膽固醇依賴性神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示，洛伐他汀作用濃度低于1 μmol/L(0.01 μmol/L和0.1 μmol/L)，對(duì)SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞基本沒(méi)有毒性；同時(shí)，不會(huì)引起細(xì)胞膽固醇水平下降。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇了0.1 μmol/L的洛伐他汀建立非膽固醇依賴性神經(jīng)細(xì)胞模型。

大量研究表明，Aβ是AD的重要致病因子之一。其異常代謝是引起Aβ堆積，老年斑形成等毒性作用的主要原因[1]。研究顯示，Aβ不僅以單體和纖維狀聚合體形式存在，還可以二、三和四聚體等寡聚體形式存在[3]。最初認(rèn)為老年斑中僅僅是不可溶的纖維狀A(yù)β有神經(jīng)毒性作用，然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能異常、神經(jīng)元及突觸功能和結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在淀粉樣斑塊形成之前[18-19]。并且大量研究結(jié)果均提示，多種Aβ1-42寡聚體與非神經(jīng)元及神經(jīng)元細(xì)胞膜上的多種成分，包括脂類、離子通道、受體等相結(jié)合引起一系列復(fù)雜的突觸、神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能及結(jié)構(gòu)的異常，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶等行為異常[20-22]。有研究顯示來(lái)源于AD病人大腦的Aβ二聚體具有毒性作用，可以直接損傷突觸可塑性及記憶功能[23]。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)APP的SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞去血清培養(yǎng)48 h，與未過(guò)表達(dá)APP(Sweden 670/671)的SH-SY5Y/WT細(xì)胞比較，可觀察到細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，同時(shí)，SH-SY5Y/APPSWE細(xì)胞Aβ二聚體的蛋白表達(dá)水平明顯高于SH-SY5Y/WT細(xì)胞；有趣的是，預(yù)先用0.1 μmol/L洛伐他汀處理細(xì)胞，可觀察到由于APP過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的過(guò)多內(nèi)源性Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用被減弱，與Aβ毒性作用組比較，細(xì)胞存活率顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞Aβ二聚體表達(dá)水平的下降(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明洛伐他汀具有不依賴于降膽固醇作用的神經(jīng)保護(hù)作用，可能與減少毒性Aβ二聚體的產(chǎn)生有關(guān)。

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(2016-10-15收稿，2016-11-28修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Protective Effect of Lovastatin on SH-SY5Y Cells against β-amyloid Peptide in Non Cholesterol Dependence Way

ZHAO Liang1,2, GUAN Zhizhong2,3,4

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,GuizhouMedicalUniversity,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To observe the effect of lovastatin on APP670/671 gene over-expressed human neuroblastoma SH-SY5Y cell activity and the synthesis of dimer of beta amyloid protein(Aβ). Methods: The human APP670/671 gene was transfected into the SH-SY5Y cells and identified. The best concentration of lovastatin which had no cell toxicity and did not affect the cell cholesterol concentration was screened, which treated SH-SY5Y cells for 24 h. Then, CCK-8 test was used to detect the cell survival rate, and Western blot was adopted to detect the protein expression level of Aβ dimer. Results: The protein and mRNA levels of APP in SH-SY5Y/APPSWE cells were obviously higher than the SH-SY5Y wild type cells. No toxic effect and no changes in cholestetol level were observed in the cells treated with 0.1 μmol/L lovastatin for 24 h. 0.1 μmol/l lovastatin pretreatment of SH-SY5Y cells with 24 h could improve the survival rate of cells and decreased Aβ dimer secretion. Conclusions: Lovastatin has a neuroprotective effect, which may be related to reducing the toxic Aβ dimer synthesis.

lovastatin; β-amyloid protein; amyloid precursor protein; Alzheimer's disease

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260173)； 教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(IRT13058)； 貴州省科技計(jì)劃[黔科合重大專項(xiàng)字(2014)6008號(hào)]； 貴州省創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06]

時(shí)間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.021.html

R749.16

A

1000-2707(2016)12-1370-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.002

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com