酶解時間對葵花11S球蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

王殿友,任 健

(1.齊齊哈爾市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗所，黑龍江 齊齊哈爾161000；2.齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

油料蛋白

酶解時間對葵花11S球蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

王殿友1,任 健2

(1.齊齊哈爾市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗所，黑龍江 齊齊哈爾161000；2.齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

以脫脂后的葵花籽粕為原料制備了葵花11S球蛋白，并利用堿性蛋白酶Alcalase酶解(控制酶解時間30、60、90、120 min)制備4種酶解產(chǎn)物，探討酶解時間對酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。凝膠色譜分析結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量顯著下降；圓二色譜分析結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加；功能性質(zhì)分析結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物在pH 2～9范圍內(nèi)可溶性氮含量達(dá)80%以上，短時間酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性提高，但長時間酶解導(dǎo)致產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性和乳化性下降。

葵花11S球蛋白；堿性蛋白酶；酶解時間；結(jié)構(gòu)；功能性質(zhì)

葵花是全球四大油料作物之一，我國葵花籽產(chǎn)量比較豐富?？ㄗ哑墒强ㄗ讶∮秃蟮闹饕碑a(chǎn)物，通常被用作飼料?？ㄗ哑芍泻?0%左右的蛋白質(zhì)[1]，提取其中的蛋白質(zhì)對擴(kuò)大蛋白質(zhì)的應(yīng)用極其有意義?？ㄗ训鞍椎闹饕M分為1.7S、7.8S、11.9S和18.1S，其中11S組分含量最高[2]，該組分的性質(zhì)將直接影響葵花籽蛋白的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)酶法水解被廣泛應(yīng)用[3]，目的是改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，作為食品配料應(yīng)用于食品行業(yè)。

本研究采用葵花籽為原料制備了葵花11S球蛋白，并利用堿性蛋白酶Alcalase酶解葵花11S球蛋白，考察了酶解時間對酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，為在實際應(yīng)用中控制酶解時間以期獲得具有良好功能特性的葵花籽蛋白或功能性多肽等食品基料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葵花籽：購于黑龍江省齊齊哈爾市；葵花籽分離蛋白：自制；堿性蛋白酶Alcalase：諾維信生物技術(shù)有限公司；高相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(15.6～438 kDa)：GE公司；其他試劑均為分析純。

722s型可見分光光度計；PB-10型酸度計；AKTA prime100型蛋白質(zhì)色譜儀，GE公司；J-815型圓二色譜儀，日本 JASCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葵花11S球蛋白的制備

參照Rahma等[4]的方法，由葵花籽粕鹽溶鹽析法制備。用95%乙醇醇洗葵花籽脫脂粕(葵花籽經(jīng)石油醚脫脂所得)，粕溶比為1∶10，在50℃、pH 4.5條件下機(jī)械攪拌兩次，每次2 h，醇洗后低溫干燥。在室溫下用10% NaCl溶液鹽提，粕溶比為1∶10，機(jī)械攪拌1 h，然后4 000 r/min離心20 min。向所得上清液中加6.5%固體(NH4)2SO4，攪拌溶解后于4℃冷藏30 min。再次離心得上清液，向其中加(NH4)2SO4至13%后冷藏。離心后用1 mol/L NaCl溶液溶解所得沉淀，在蒸餾水中透析后冷凍干燥，制得蛋白質(zhì)含量為95.38%的葵花11S球蛋白。

1.2.2 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物的制備

將制得的葵花11S球蛋白粉碎后過100目篩，加入超純水配制成7%分散液，加入2%堿性蛋白酶Alcalase，60℃分別酶解30、60、90、120 min。酶解過程中，通過向反應(yīng)體系中滴加0.1 mol/L NaOH溶液，維持pH 8.5恒定。酶解結(jié)束后，沸水浴中滅酶30 min，4 000 r/min離心15 min得上清液，將其冷凍干燥后備用。參照參考文獻(xiàn)[5]的方法測定水解度。

1.2.3 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物性質(zhì)的測定

1.2.3.1 凝膠色譜法測定相對分子質(zhì)量分布

采用蛋白質(zhì)色譜儀分析酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布情況。色譜柱為Superdex Peptide 10/300GL，上樣量2 mg/mL，pH 7.0 PBS緩沖液(含0.15 mol/L NaCl)洗脫，流速0.25 mL/min。相對分子質(zhì)量校正曲線制作采用的標(biāo)準(zhǔn)品為藍(lán)色葡聚糖2000、aprotinine、桿菌肽、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，相對分子質(zhì)量分別為2 000 000、6 511.51、1 422.69、612.63、307.32 Da。

1.2.3.2 圓二色譜(CD)測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

參照參考文獻(xiàn)[6]的方法測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。測試條件為：待測樣品的質(zhì)量濃度0.15 mg/mL(pH 7.0)，檢測波長190～240 nm，掃描速度100 nm/min，數(shù)據(jù)間隔0.2 nm，帶寬1.0 nm，反應(yīng)時間0.125 s，CD數(shù)據(jù)用平均殘基橢圓率表達(dá)。

1.2.3.3 溶解性

精確稱取一定量的蛋白質(zhì)樣品，加入pH 2～9的緩沖溶液，旋渦混合30 s，4℃過夜使其充分水合，隨后8 000 r/min離心20 min，取上清液，參照參考文獻(xiàn)[7]的方法測定氮溶解指數(shù)。緩沖溶液的配制如下：pH 2～3，0.05 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液；pH 4～5，0.05 mol/L乙酸鹽緩沖溶液；pH 6～8，0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液；pH 9，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖溶液。

1.2.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

參照參考文獻(xiàn)[8]的方法測定蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

1.2.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

參照參考文獻(xiàn)[9]的方法測定蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物的品質(zhì)

堿性蛋白酶Alcalase酶解葵花11S球蛋白30、60、90、120 min時酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量及其水解度分析結(jié)果如表1所示。

表1 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量及其水解度

2.2 相對分子質(zhì)量分布

堿性蛋白酶Alcalase酶解葵花11S球蛋白30、60、90、120 min時酶解產(chǎn)物凝膠色譜與相對分子質(zhì)量分布如圖1、表2所示。

圖1 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物的凝膠色譜圖

由圖1可以看出，酶解葵花11S球蛋白產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布廣泛。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，凝膠色譜的主峰向后稍有移動，這說明酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量逐漸減小。此外，酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布總體趨勢為高相對分子質(zhì)量肽的比例逐漸減小，而低相對分子質(zhì)量肽的比例逐漸增大。分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量對數(shù)(lgMr)與有效分配系數(shù)(Kaw)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：lgMr=-3.495 2Kaw+4.692 5，R2=0.982。

表2 葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布

由表2可以看出，隨著酶解時間的延長，相對分子質(zhì)量范圍2 000～300 Da的肽段占主體，其所占比例由44.37%逐漸增大至74.64%；相對分子質(zhì)量大于2 000 Da的肽段所占比例逐漸減小，說明堿性蛋白酶Alcalase在酶解葵花11S球蛋白的過程中，可以有效地降低蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，低相對分子質(zhì)量的多肽逐漸增多。

2.3 圓二色譜(CD)分析

葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的圓二色譜圖如圖2所示。

圖2 葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的圓二色譜圖

從圖2可以看出，葵花11S球蛋白約在200 nm處相交于零點，同時在210 nm (-)出現(xiàn)了1個較大的譜帶，這表明葵花11S球蛋白主要是β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[10]，而其酶解產(chǎn)物在200 nm(-)處均出現(xiàn)了1個較明顯的譜帶，這表明酶解產(chǎn)物主要為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。隨著酶解時間的延長，所得產(chǎn)物的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多(由42%增加到60.3%)。這表明葵花11S球蛋白酶解產(chǎn)物具有更多的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

2.4 溶解性

葵花11S球蛋白經(jīng)堿性蛋白酶Alcalase酶解后，蛋白質(zhì)分子的溶解性發(fā)生了顯著性改變?？?1S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性如圖3所示。

圖3 葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的溶解性

從圖3可以看出，葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物在pH 2～9范圍內(nèi)的溶解性變化較大，曲線呈“U”型，在等電點5.0附近的溶解性最差[11]，而其酶解產(chǎn)物的溶解性顯著提高，在所測定的pH范圍內(nèi)可溶性氮含量都達(dá)到了80%以上，且隨著酶解時間的延長，溶解性增加。這表明酶解對改善葵花11S球蛋白的溶解性特別有效。

2.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4 葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

從圖4可以看出，酶解作用能顯著提高蛋白質(zhì)溶液的起泡性能。這是因為酶解作用使蛋白質(zhì)的溶解性顯著提高，產(chǎn)生更多的肽分子參與液膜的形成，有利于提高起泡能力[12]；酶解時間同樣影響泡沫穩(wěn)定性，酶解30 min所得產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性最高，隨著酶解時間的延長，泡沬穩(wěn)定性下降。這是因為隨著酶解時間的延長，肽鏈逐漸變短，導(dǎo)致產(chǎn)生的液膜穩(wěn)定性變差，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性和起泡能力逐漸減??；酶解液的黏度逐漸減小，蛋白質(zhì)分子的電荷增加，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性變差，也不利于泡沫的形成[13-14]。

2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性

葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的乳化性及乳化穩(wěn)定性如圖5所示。

從圖5可以看出，酶解30～60 min時，所得產(chǎn)物的乳化性增加。然而，酶解90～120 min時，乳化性及乳化穩(wěn)定性則隨著酶解時間的延長而下降。這是因為部分酶解使部分疏水基團(tuán)暴露出來，大量的肽分子進(jìn)入到油/水界面。而且蛋白質(zhì)羧基的電荷會產(chǎn)生靜電排斥力，從而有效地減少了聚合的油滴，增強(qiáng)了乳化性和乳化穩(wěn)定性。隨著酶解時間的延長，包裹在油脂外面的肽鏈逐漸變短，從而導(dǎo)致保護(hù)膜逐漸變薄，乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。

圖5 葵花11S球蛋白及其酶解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

采用堿性蛋白酶Alcalase酶解葵花11S球蛋白能夠顯著改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。酶解導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加伸展，同時降低了蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，顯著改善了溶解性。此外，控制酶解時間能夠改善蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)和起泡性質(zhì)。

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Effects of enzymatic hydrolysis time on the structure and functional properties of sunflower 11S globulin

WANG Dianyou1, REN Jian2

(1. Qiqihar Bureau of Quality and Technical Supervision, Qiqihar 161000, Heilongjiang, China;2. Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, Qiqihar University,Qiqihar 161006, Heilongjiang, China)

Sunflower 11S globulin was prepared from defatted sunflower seed meal and hydrolyzed by Alcalase. Protein hydrolysates of four different hydrolysis time (30，60，90，120 min) were obtained. The effects of hydrolysis time on the structures and functional properties of hydrolysates were evaluated. Size Gel permeation chromatography results showed that the hydrolysis gradually decreased the relative molecular weight of sunflower 11S globulin. Circular dichroism analysis showed that the hydrolysates possessed more random coil structure. The functional properties results showed that the hydrolysates exhibited higher soluble nitrogen content(above 80%) at pH 2-9. Hydrolysates with shorter hydrolysis time showed higher foaming properties and emulsifying activity, while the hydrolysis for longer time resulted in lower foam stability and emulsifying activity.

sunflower 11S globulin; Alcalase; enzymatic hydrolysis time; structure; functional properties

2016-03-07;

2016-09-22

國家自然科學(xué)基金(31271982)

王殿友(1966)，男，高級工程師，碩士，研究方向為植物蛋白加工(E-mail)wangdianyou@163.com。

任 健，教授(E-mail)renjian1970789@163.com。

TS229;TQ936.2

A

1003-7969(2017)01-0089-04