AAV載體靶向修飾策略在基因治療中的研究進(jìn)展

鄧怡晨，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

綜述與專論

AAV載體靶向修飾策略在基因治療中的研究進(jìn)展

鄧怡晨，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科的一種，它能以其廣泛的宿主范圍及低的免疫原性對(duì)人及靈長類進(jìn)行感染，而且經(jīng)過改造后的 AAV 能夠更有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)特異組織及細(xì)胞。腺相關(guān)病毒作為一種基因治療載體其生物學(xué)特性已被深入了解，通過改造腺相關(guān)病毒的血清型和蛋白衣殼結(jié)構(gòu)能夠擴(kuò)寬其應(yīng)用范圍。本文對(duì) AAV 病毒載體的衣殼蛋白基因工程修飾、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控修飾、基因改造和衣殼蛋白共價(jià)偶聯(lián)修飾的靶向機(jī)理以及相關(guān)的一些研究成果進(jìn)行介紹。

腺相關(guān)病毒 靶向 基因治療

隨著對(duì)腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)AAV作為轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體有一定的局限性，如AAV宿主范圍廣泛、組織或細(xì)胞特性缺乏等，使得其作為基因的載體被用于臨床治療實(shí)驗(yàn)中存在安全性、靶向性和轉(zhuǎn)染效率低的缺陷[1]。因此，AAV的靶向性對(duì)于基因治療的成功與否非常關(guān)鍵。具有靶向性的病毒載體是目前基因治療臨床試驗(yàn)研究的主要載體，應(yīng)用AAV載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)治療基因有宿主范圍廣泛及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。而且經(jīng)過AAV改造后的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體更能有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)治療基因和靶向特定的組織或細(xì)胞[2, 3]。在AAV成功用于基因治療的研究中，需要盡可能提高基因治療的效率和努力使其造成的細(xì)胞毒性降到最低，探究AAV載體介導(dǎo)基因治療的最佳靶向策略。目前優(yōu)化AAV的感染靶向性有四種策略：一是衣殼蛋白基因工程修飾；二是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行靶向調(diào)控；三是通過基因改造；四是對(duì)衣殼蛋白通過共價(jià)偶聯(lián)進(jìn)行修飾。

1 衣殼蛋白基因工程修飾

AAV對(duì)細(xì)胞的靶向性依賴于其衣殼和特異細(xì)胞表面受體的相互作用，是由受體和衣殼的相互作用介導(dǎo)的AAV內(nèi)化和細(xì)胞運(yùn)輸?shù)冗^程。目前對(duì)構(gòu)成衣殼的cap蛋白 (capsid protein) 進(jìn)行改造成為主要研究方向[4-6]。

在早期對(duì)AAV靶向性研究中一般是直接將目標(biāo)配體插入到cap基因中。如Yang等首次構(gòu)建了一種以人類造血干細(xì)胞為靶點(diǎn)的AAV載體，方法是在AAV2的VP2蛋白N端插入了抗人CD34的單鏈抗體基因，結(jié)果顯著地增強(qiáng)了AAV對(duì)CD34細(xì)胞的感染率[7]。隨后的研究中，Buning等發(fā)現(xiàn)在AAV2衣殼蛋白的表面有6位點(diǎn)暴露出來，位點(diǎn)分別是261、381、447、534、573、587，且在這些位點(diǎn)插入一些氨基酸序列不會(huì)影響 病毒的衣殼包裝等正常生活周期并且能改變其轉(zhuǎn)染趨向性。如White等構(gòu)建了靶向人內(nèi)皮細(xì)胞的AAV載體，即在AAV2衣殼的587位點(diǎn)插入靶向人內(nèi)皮細(xì)胞的多肽序列，結(jié)果是大大增強(qiáng)了AAV2載體轉(zhuǎn)染人內(nèi)皮細(xì)胞的靶向性。而且該突變體感染途徑不依賴硫酸乙酰肝素(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)而增強(qiáng)了其特異靶向性。因?yàn)橐吧虯AV2廣泛趨向性是在其感染各種細(xì)胞過程中先與HSPG結(jié)合，而大多細(xì)胞表面都表達(dá)葡萄糖胺聚糖[8]。

隨后，很多研究團(tuán)隊(duì)也分別通過直接插入的方式在AAV衣殼上插入選擇配體從而構(gòu)建了具有不同靶向性的AAV載體。Grifman等用受體靶向性修飾AAV衣殼，將腫瘤靶向多肽序列NGRAHA插入至AAV衣殼的特定位點(diǎn)，使插入該靶向多肽的rAAV載體感染Kaposi肉瘤細(xì)胞和胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞的能力遠(yuǎn)高于用野生型AAV2的感染效果[9]。Nicklin等通過用多肽SIGYPLP修飾AAV衣殼，使構(gòu)建的AAV能人為靶向的感染多種腫瘤細(xì)胞株，包括惡性黑色素瘤細(xì)胞系(C8161)、前列腺癌細(xì)胞系(PC-3和LnCAP)、胃癌細(xì)胞系(MKN-45)、和肺腺癌細(xì)胞(A549)，而且不受AAV本身對(duì)細(xì)胞親噬性的影響[10]。這些研究有力的說明了野生型 AAV 經(jīng)過對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行插入和突變修飾能提高其對(duì)特異細(xì)胞的靶向性，從而提高AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)染率。

2 在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行靶向調(diào)控

在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)AAV靶向調(diào)控方式包括：一、組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的靶向性；二、轉(zhuǎn)錄后水平的 microRNA 靶向元件調(diào)控AAV的靶向性。

2.1 組織特異性啟動(dòng)子對(duì)AAV的靶向性探究

在機(jī)體內(nèi)，幾乎所有的細(xì)胞都具有完整基因組，但在不同組織細(xì)胞中會(huì)呈現(xiàn)出不同的表型特征，這是因?yàn)橛蒁NA中的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件及轉(zhuǎn)錄因子相互作用在基因組表達(dá)過程中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。病毒啟動(dòng)子如CMV具有廣泛的組織表達(dá)特性，也就是在多種細(xì)胞中均有活性，在傳統(tǒng)的基因治療研究中，經(jīng)常會(huì)選擇這類病毒啟動(dòng)子來調(diào)控基因治療的表達(dá)，這就不可避免的對(duì)靶外細(xì)胞和組織產(chǎn)生毒副作用，并引起機(jī)體免疫反應(yīng)[11, 12]。而組織特異性啟動(dòng)子則由于啟動(dòng)子對(duì)細(xì)胞的特異性而限制基因只在靶細(xì)胞中才能得以表達(dá)，更加適合用于基因治療的靶向調(diào)控[13]。

目前，各類型的組織特異性啟動(dòng)子已經(jīng)被報(bào)道并用于AAV載體靶向調(diào)控的研究中。但有些特異性啟動(dòng)子的活性要低于病毒啟動(dòng)子，如在肝臟細(xì)胞中，α-抗胰酶(hAA)、白蛋白(Alb)都是肝特異性蛋白基因，這兩種啟動(dòng)子比CMV啟動(dòng)子的活性低。Okuyama等在hAAT啟動(dòng)子上插入了肝特異性增強(qiáng)子ApoE，較之前單一特異性啟動(dòng)子表達(dá)水平提高15倍[14]。在用AAV介導(dǎo)的肝靶向性血友病基因治療中，Jenny McIntosh等用rAAV載體攜帶重組人類凝血因子VIII靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選擇用一種肝臟細(xì)胞特異性的嵌合啟動(dòng)子HLP，同時(shí)還優(yōu)化了B結(jié)構(gòu)域缺失的人凝血因子Ⅷ基因中226個(gè)氨基酸區(qū)域，用新型17-aa肽替換，用所構(gòu)建的新型rAAV載體(rAAV-HLP-codop-hFVIII-V3)通過外周靜脈注射靶向感染肝細(xì)胞，得到超生理水平表達(dá)目的基因的結(jié)果，且在小鼠和獼猴的體內(nèi)都得到有效的驗(yàn)證[15]。

對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言，由于血-腦屏障的存在，用基因治療的方法很難將外源的基因表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到腦部進(jìn)而達(dá)到治療效果。AAV是一類微小的，且在正常細(xì)胞中不發(fā)生產(chǎn)毒性感染的病毒，研究表明AAV9型載體不僅可以在腦中擴(kuò)散，還能夠使目的基因進(jìn)入腦部的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以AAV能夠用于研究各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[16, 17]。特定神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡引起各種的神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)患者表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)元的丟失，帕金森病(PD)患者表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失。因此優(yōu)化AAV在神經(jīng)系統(tǒng)中的靶向性尤為重要。

Akiya Watakabe等在狨猴大腦皮層注射攜帶GFP的AAV病毒載體，得知在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下，血清型1,5,8,9的AAV的GFP都在膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，且表達(dá)效率沒有明顯的差異[18]。而AAV2表達(dá)范圍較其他4中血清型AAV明顯較小[19]。此外，狨猴腦池內(nèi)注射AAV9在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的擴(kuò)散較好，而小腦薄壁組織注射，其擴(kuò)散程度相比腦池內(nèi)注射有局限性，其主要擴(kuò)散至小腦皮層和小腦傳出神經(jīng)元。這兩種注射方式都會(huì)將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、背索內(nèi)側(cè)丘、脊髓小腦束。根據(jù)不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變部位分析，前一種注射方式適用AD、溶酶體貯積癥(LSD)等疾病研究，后一種注射方式適合小腦的損傷、腦干中相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)損傷而造成的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，如脊髓小腦病變癥。在前腦谷氨酸能神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(CAMKⅡ)調(diào)控下，所有血清型AAV載體都能高效的在大腦皮層神經(jīng)元(cortical neurons)細(xì)胞中表達(dá)[16]。hSyn是人SYN1基因的啟動(dòng)子，SYN1基因表達(dá)產(chǎn)生的Synapsin I蛋白，是在神經(jīng)元內(nèi)特異表達(dá)的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)rSynI在狨猴浦肯野細(xì)胞中的表達(dá)極弱，但在嚙齒類動(dòng)物浦肯野細(xì)胞中啟動(dòng)子活性較好，說明在不同物種之間，組織特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)基因的途徑也會(huì)有差異。2.2 microRNA 靶向元件調(diào)控AAV的靶向性

miRNA是由其前體pri-RNA被RNaseIII核酸內(nèi)切酶Drosha和Dicer酶酶切和催化而形成的雙鏈miRNA，其一條鏈被降解，另一條鏈即具有內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA。miRNA先與基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，然后在RISC的指導(dǎo)下，miRNA在與mRNA互補(bǔ)的位置結(jié)合，通過使mRNA降解或抑制mRNA翻譯來實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)控[20]。用AAV作為載體攜帶miRNA轉(zhuǎn)染特異性細(xì)胞較用其他病毒載體如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等明顯降低了外源基因在某些非靶向組織和細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和毒副反應(yīng)[21, 22]。

3 基因改造

AAV載體在靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中雙鏈DNA(dsDNA)不穩(wěn)定嚴(yán)重影響了其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持久性，研究者發(fā)現(xiàn)AAV的DNA中一個(gè)末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITR)中的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem repeat sequences，TRS)缺失或突變產(chǎn)生的AAV病毒將以二聚體形式穩(wěn)定存在，即自身互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒(scAAV)。與常規(guī)的重組腺相關(guān)病毒相比較，其主要特點(diǎn)是表達(dá)效率高且快速，所以在使用時(shí)能相對(duì)降低scAAV的使用量，進(jìn)而降低機(jī)體可能會(huì)出現(xiàn)的免疫反應(yīng)[23, 24]。scAAV載體的出現(xiàn)促進(jìn)了AAV載體在臨床試驗(yàn)上的應(yīng)用。

4 衣殼蛋白共價(jià)偶聯(lián)修飾

近年來，用化學(xué)生物學(xué)方法修飾生物大分子得到了廣泛的應(yīng)用[25]，有關(guān)研究表明，用活化的高分子共價(jià)結(jié)合AAV衣殼蛋白氨基酸殘基能對(duì)病毒進(jìn)行修飾，能改變其組織特異性，提高病毒載體靶向性。

分子的PEG化，即活化的聚乙二醇與AAV衣殼蛋白的α-以及ε-氨基偶聯(lián)使衣殼蛋白活性發(fā)生改變進(jìn)而降低AAV抵抗蛋白酶水解的能力，減低免疫原性和毒副作用，延長體內(nèi)半衰期,降低血漿清除率等[26, 27]。一種水溶性高分子聚合物pHPMA對(duì)AAV進(jìn)行修飾，使高分子直接與靶細(xì)胞受體反應(yīng)或通過高分子鏈將載體上的受體包裹，從而讓AAV喪失原本具有的趨向性，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向[28]。

綜上可知，用化學(xué)方法修飾病毒能較大程度地優(yōu)化病毒載體在基因治療中的靶向性和轉(zhuǎn)染效率，為當(dāng)前解決AAV載體的靶向性等問題提供了新的思路和方法。

5結(jié)語和展望

基因治療中，應(yīng)用較早、較廣泛的兩類載體是腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄載體，但至今未取得令人滿意的臨床研究結(jié)果。AAV作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體較腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒有很多優(yōu)點(diǎn)，如廣泛的宿主細(xì)胞范圍、低免疫源性、長時(shí)間在體內(nèi)表達(dá)外源基因等。為了能將AAV作為基因載體用于臨床的基因治療，研究者不斷改善AAV對(duì)宿主或靶向細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及感染的選擇性。目前有四種調(diào)控AAV靶向的基本方式：一是衣殼蛋白基因工程修飾；二是通過轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控；三是通過基因改造；四是衣殼蛋白共價(jià)偶聯(lián)修飾。為了將AAV載體作為基因治療的工具，需要研究更多的AAV亞型、在基因水平上將AAV感染靶向性和轉(zhuǎn)錄靶向性相結(jié)合，更加深入的了解AAV在機(jī)體內(nèi)的各種分子機(jī)制。

除了從以上這些基因分子水平上調(diào)控AAV的靶向性的策略，注射途徑的選擇及添加輔助藥物、不同物種的差異和病毒的多重感染都會(huì)影響到AAV對(duì)組織和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性、感染率。為了解決這些問題，當(dāng)前有許多研究正致力發(fā)展其他策略，如構(gòu)建新型靶向AAV載體以降低免疫反應(yīng)和提高治療效果、在不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型探究AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的異同等。相信隨著對(duì)靶向修飾 AAV的技術(shù)越來越成熟，會(huì)有力的促進(jìn)人類疾病基因治療的發(fā)展。

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Progress in targeting modification strategy of AAV vector in gene therapy

DENG Yi-chen， LIU Yun-bo

(Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences. Beijing 100021)

Adeno-associated virus(AAV)belongs to the family of Parvoviridae. It is a small virus which can infect humans and some other primate species with extensive host cell and low-immunogenicity. Besides, modified AAV can target the specific tissues and cells effectively. As a kind of gene therapy vector，Adeno-associated virus have been widely known of its biological characteristics. By modification of the adeno-associated virus serotype and structure of capsid protein, we can extend the application range of AAV vectors. This article introduces the targeting mechanism and results of some related researches, the genetic engineering modification of AAV capsid proteins, the transcription regulation modification of target gene expression, and gene modification and the covalent coupling of AAV capsid proteins.

Adeno-associated virus (AAV); Targeting; Gene therapy

國家科技支撐計(jì)劃(No.2014BAI03B01)。

鄧怡晨(1991-)，女，碩士研究生，動(dòng)物學(xué)，Email：yichendeng007@126.com。

劉云波(1962-)，男，研究員，Email：yunboliu@ 126.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0081-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.015

2016-11-15