單核苷酸多態(tài)性在寄生蟲上的應(yīng)用

陳 婷，韓紅玉，朱順海，董 輝，趙其平，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

·綜述·

單核苷酸多態(tài)性在寄生蟲上的應(yīng)用

陳 婷，韓紅玉，朱順海，董 輝，趙其平，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）作為第三代分子標(biāo)記，由于其檢測方法多樣，具有數(shù)量多、二態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性高等眾多優(yōu)勢，在人類和動植物領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，有著很高的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。本文從SNP分子標(biāo)記簡介出發(fā)，簡述了SNP在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用概況，對SNP在寄生原蟲、蠕蟲、節(jié)肢動物上的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，涉及寄生蟲的遺傳發(fā)育、種群進(jìn)化、致病性及耐藥性等方面，為了解SNP在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀和開展寄生蟲的相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)資料。

單核苷酸多態(tài)性；寄生蟲；基因組

前言

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由Lander[1]于1996年首次提出的一種分子標(biāo)記，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。作為第3代分子標(biāo)記，它具備幾個(gè)特點(diǎn)：1）SNP數(shù)量多，分布廣泛，在人類基因組中，每300～1000個(gè)堿基中即存在1個(gè)SNP，這樣在整個(gè)基因組的分布就多達(dá)300萬個(gè)[2,3]；2）二態(tài)性和等位基因性，在動植物群體中，SNP標(biāo)記可能由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上后2種情況出現(xiàn)的機(jī)率異常少見，SNP標(biāo)記一般只有兩種等位型的堿基組成，具有二態(tài)性和等位基因性，在任何種群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來[4]；3）遺傳穩(wěn)定性高，SNP標(biāo)記的突變率低，且能夠在生物體基因組中穩(wěn)定遺傳[5]。此外，SNP還存在適合快速、規(guī)?；Y查，易于基因分型，富有代表性等特點(diǎn)[6-8]。

根據(jù)檢測的通量，目前檢測SNP 的技術(shù)主要分為兩大類，一類是以凝膠電泳檢測為基礎(chǔ)，另一類是以高通量檢測為基礎(chǔ)，前者包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DDGE）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS）、等位基因特異性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）等，后者包括DNA測序、DNA芯片、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、飛行質(zhì)譜儀檢測、高分辨率溶解曲線（high-resolution melting，HRM）等[9]。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，SNP越來越多地應(yīng)用于生物領(lǐng)域中的許多方面。在對人類生命科學(xué)的研究中，SNP的應(yīng)用十分廣泛，主要體現(xiàn)在疾病病因、藥物基因組學(xué)和人類進(jìn)化史等方面，有助于及早發(fā)現(xiàn)和治療疾病，為患者選擇合適的藥物，同時(shí)也可以繪制進(jìn)化樹來研究人類的發(fā)展[10-16]。在植物研究領(lǐng)域，SNP 可用于構(gòu)建不同植物的遺傳圖譜，如根據(jù)SNP構(gòu)建的水稻精密遺傳圖譜，作為分子標(biāo)記對水稻進(jìn)行進(jìn)化分型[17-20]；同樣利用SNP構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜遺傳圖譜，可將其與甘藍(lán)型油菜的開花、種子等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)[21]；SNP作為分子標(biāo)記也可對棉花的某些基因進(jìn)行定位等[22]。在動物研究領(lǐng)域，SNP已應(yīng)用于許多方面，如藏雞的基因型與生長性狀的相關(guān)性研究[23]；分析牛AMPK家族7個(gè)基因的遺傳變異，為肉牛的早期精準(zhǔn)選種、高效育種技術(shù)體系和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫的建立，以及種質(zhì)資源保存與利用等提供了基礎(chǔ)和依據(jù)[24]；也用于美洲牡蠣抗病相關(guān)基因的篩選[25]。此外，SNP還在豬的育種[26]、豬的血糖和糖基化血清蛋白性狀分析[27]、牛的親子鑒定[28]等方面得到應(yīng)用。

為了解SNP在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用狀況，更好地將SNP用于寄生蟲基因組的分析，本文分別綜述了SNP在原蟲、蠕蟲和節(jié)肢動物上研究進(jìn)展。

1 SNP分子標(biāo)記在原蟲上的應(yīng)用

1.1 惡性瘧原蟲

瘧原蟲感染人類可引起瘧疾，在對瘧疾進(jìn)行藥物治療的過程中，出現(xiàn)了對抗瘧藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。多藥耐藥蛋白（multidrug resistance protein，MRP）與蟲體對多種藥物的耐藥性形成有關(guān)，屬于ATP結(jié)合域（ATP-bindingcassette transporter，ABC）超家族成員，最初是從腫瘤組織細(xì)胞中分離出來，用于研究腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的蛋白[29]。國內(nèi)外學(xué)者對惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）基因組研究分析發(fā)現(xiàn)，有兩個(gè)基因編碼多藥耐藥蛋白，分別為Pfmrp1基因和Pfmrp2基因。Dahlstrom等[30]通過焦磷酸測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Pfmrp1基因I876V 位點(diǎn)的SNP與蟲體對蒿甲醚-本芴醇藥物的敏感性相關(guān)；并發(fā)現(xiàn)Pfmrp1基因K1466R位點(diǎn)的多態(tài)性變化與蟲體對磺胺多辛—息瘧定（Sulfadoxine-pyrimethamine）的耐藥性相關(guān)[31]。Ursing等[32]用PCR-RFLP和測序方法，研究了伊朗東南部地區(qū)惡性瘧原蟲氯喹（Chloroquine，CQ）抗藥性基因（pfcrt）和Pfmrp1基因與CQ耐藥性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)瘧原蟲體內(nèi)，99%pfcrt基因第76位密碼子由K變?yōu)門（K代表2兼并堿基T/G中的一個(gè)），72%Pfmrp1基因第86位密碼子由N變?yōu)閅（N代表4兼并堿基A/T/G/C中的一個(gè)，Y代表2兼并堿基C/T中的一個(gè)），對pfcrt基因第72～76位密碼子進(jìn)行單倍型測序，結(jié)果為SVMNT（S代表2兼并堿基G/C中的一個(gè)，V代表3兼并堿基G/A/C中的一個(gè)，M代表2兼并堿基A/C中的一個(gè)），而SVMNT與瘧原蟲CQ耐藥性相關(guān)，表明通過基因多態(tài)位點(diǎn)檢測到的具有CQ抗性的惡性瘧原蟲在伊朗東南部有顯著的流行。Veiga等[33]對來自泰國46株惡性瘧原蟲的Pfmrp2基因序列進(jìn)行了分析，預(yù)測了該蛋白的二維結(jié)構(gòu)，并計(jì)算相關(guān)藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），發(fā)現(xiàn)了大量的SNPs和一些未有報(bào)道的SNPs，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該基因存在明顯的插入/缺失位點(diǎn)，多種藥物敏感性的關(guān)聯(lián)分析表明該基因發(fā)生SNPs與瘧原蟲對多種抗瘧藥耐藥性產(chǎn)生有關(guān)。由此推測，Pfcrt的突變，是該寄生蟲對CQ產(chǎn)生耐藥性的主要因素。Pulcini等[34]對受金剛烷胺或稻瘟菌素選擇的帶有Pfcrt基因突變的惡性瘧原蟲的研究，發(fā)現(xiàn)其食物泡變大，且對CQ或其他喹啉類抗瘧藥的敏感性增加，通過Pfcrt基因L272F（L代表2兼并堿基脫氧肌苷/脫氧次黃苷中的一個(gè)）突變的轉(zhuǎn)基因蟲株實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其對藥物的敏感性變化；此外，將C101F或L272F突變導(dǎo)入耐CQ蟲株的Pfcrt基因，會降低該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CQ的能力。Pelleau等[35]通過第二代測序技術(shù)和鋅指核酸酶技術(shù)，結(jié)合瘧原蟲流行區(qū)藥物治療的歷史，發(fā)現(xiàn)氯喹耐藥株的Pfcrt基因無C350R突變，即對CQ敏感的瘧原蟲體內(nèi)Pfcrt基因第350位密碼子含有突變（第10外顯子的半胱氨酸被精氨酸取代），若蟲株恢復(fù)其對氯喹的敏感性，則基因相應(yīng)位點(diǎn)變?yōu)镃350R。Gabryszewski等[36]同樣通過鋅指核酸酶技術(shù)，構(gòu)建了所有可能的突變重組，并以IC50和體外生長指數(shù)等參數(shù)模擬耐藥性產(chǎn)生的突變軌跡，表明突變主要通過p20和p19 2個(gè)信號通路產(chǎn)生且EcuD I356L為第一個(gè)產(chǎn)生的突變，作者同時(shí)指出，突變序列0→1→3→4 和0→3→4的頻率顯著高于0→1→2→3→4，揭示了Pfcrt基因耐藥相關(guān)的四突變位點(diǎn)Ecu1110的產(chǎn)生和演變過程。

在對惡性瘧原蟲種群分布與進(jìn)化的研究上，Murray等[37]對從瘧原蟲高流行地幾內(nèi)亞臨床分離到的95個(gè)蟲株，進(jìn)行了基于PCR的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分型，以確定其種內(nèi)基因多態(tài)性；同時(shí)，用同一樣品進(jìn)行全基因短讀序列得到的SNP來計(jì)算種內(nèi)穩(wěn)定指數(shù)FWS，將FWS指數(shù)與微衛(wèi)星位點(diǎn)結(jié)果或SNPs結(jié)果進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析可檢測到低水平的少數(shù)基因型，當(dāng)無法進(jìn)行全基因組測序時(shí)，定量分析10個(gè)或者更多SNPs位點(diǎn)可得到合理的準(zhǔn)確估計(jì)，結(jié)果表明隨著各種方法的廣泛應(yīng)用，可以根據(jù)研究目標(biāo)選擇合適的基因分型和分析方法。

1.2 間日瘧原蟲

間日瘧原蟲（P. vivax，Pv）是造成人類瘧疾最廣泛的寄生蟲，且無法在體外長時(shí)間培養(yǎng)。因此，對間日瘧原蟲進(jìn)行生物學(xué)等的觀察需要從病人外周血中采集蟲體。Flannery等[38]以秘魯亞馬遜地區(qū)10個(gè)感染間日瘧原蟲的人為樣本，通過第二代測序技術(shù)分析其體內(nèi)寄生蟲基因組，結(jié)果顯示該地區(qū)蟲體呈多克隆性，隨后對蟲體樣本進(jìn)行耐藥性的分析，通過參考其他物種（如惡性瘧原蟲或秀麗隱桿線蟲）的耐藥性相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)具有耐藥性的間日瘧原蟲體內(nèi)部分耐藥性相關(guān)基因發(fā)生突變或基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)暗示耐藥性基因的突變是獨(dú)立產(chǎn)生的。與惡性瘧原蟲一樣，間日瘧原蟲對CQ耐藥性的出現(xiàn)，嚴(yán)重阻礙了瘧疾的控制。Das等[39]通過檢測間日瘧原蟲的二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，dhfr）和二氫蝶酸合酶（dihydropteroate synthase，dhps）基因多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在加爾各答市地區(qū)的間日瘧原蟲基因組中存在很多Pvdhfr基因和Pvdhps基因的雙突變位點(diǎn)，其中Pvdhfr基因和Pvdhps基因的4個(gè)或5個(gè)位點(diǎn)突變，可能導(dǎo)致抗葉酸藥物的臨床治療無效。

1.3 弓形蟲

在剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tg）研究方面，SNP分子標(biāo)記主要應(yīng)用于遺傳標(biāo)記的選擇和遺傳進(jìn)化的分析。Bontell等[40]分析了烏干達(dá)地區(qū)8個(gè)蟲株的大量序列，對1個(gè)基因Ⅱ/Ⅲ型重組種群的TgCkUg2基因進(jìn)行了全基因測序，發(fā)現(xiàn)70 000多個(gè)SNPs；在編碼區(qū)上發(fā)現(xiàn)1252個(gè)新的SNPs和新SNPs富集區(qū)，顯示出包括表面抗原基因和棒狀體蛋白基因在內(nèi)的一些基因的選擇性壓力，并對除基因Ⅱ/Ⅲ型重組蟲種群外的6個(gè)基因Ⅱ型和1個(gè)基因Ⅲ型種群作進(jìn)一步測序，驗(yàn)證了這些SNPs的存在并指出這是存在于烏干達(dá)地區(qū)的Ⅱ型蟲株變異。動物實(shí)驗(yàn)表明Ⅲ型蟲株的致病性為Ⅱ型蟲株的30倍，而重組蟲株的毒性介于兩者之間；同時(shí)篩選出了可作為分子標(biāo)記的一些高可信度SNPs。Minot等[41]為鑒定菌株之間共有的單倍型區(qū)域并構(gòu)建弓形蟲單倍型圖譜，采用全基因組測序的方法，鑒定了來自歐洲、北美和南美的10株弓形蟲的大量SNPs位點(diǎn)，此外，為構(gòu)建一個(gè)包含有性重組的弓形蟲綜合家譜，又對可代表全球多態(tài)性的另外26個(gè)蟲株的RNA序列進(jìn)行SNP分析。結(jié)果表明大多數(shù)現(xiàn)存蟲株是由親代蟲株重組形成的產(chǎn)物，基因組的某些區(qū)域還未在親代蟲株之間互換，但是有些區(qū)域已經(jīng)從親代蟲株重組到其他蟲株。

1.4 球蟲

在雞球蟲基因組研究方面，Blake等[42]運(yùn)用質(zhì)譜檢測、測序和細(xì)胞分型的方法，對分離自埃及、利比亞、印度、尼日利亞等地的柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）在序列多態(tài)性、蟲株選擇進(jìn)化中的指示功能等方面的作用大于其在免疫逃避中的作用，其不同區(qū)域的蟲株具有明顯的單倍體多態(tài)性和種群結(jié)構(gòu)多態(tài)性。Pegg等[43]用SNP方法對來自非洲和亞洲的244株柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)這些蟲株在單倍體多態(tài)性、種群結(jié)構(gòu)等方面均存在顯著變異，具有明顯的地域性，為使用更實(shí)惠、更方便的PCR-RFLP技術(shù)對其他區(qū)域種群進(jìn)行大規(guī)模研究，選擇一部分SNPs標(biāo)記驗(yàn)證PCR-RFLP技術(shù)的實(shí)用性，結(jié)果表明該技術(shù)可行性強(qiáng)，此后，通過PCR-RFLP技術(shù)對采集自英國和愛爾蘭的柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)蟲株存在嚴(yán)格的單倍體多態(tài)性。

1.5 吉氏巴貝斯蟲

在巴貝斯蟲（Babesia）研究方面，Iguchi等[44]在實(shí)驗(yàn)室成功誘導(dǎo)對阿托伐琨（Atovaquone，AQ）具有耐藥性的吉氏巴貝斯蟲（B. gibsoni）蟲株，對其進(jìn)行SNPs的檢測，發(fā)現(xiàn)其染色體cytbnt363 位點(diǎn)出現(xiàn)了基因突變，即G變?yōu)門，導(dǎo)致蛋氨酸被異亮氨酸取代（M121I）；再通過位點(diǎn)特異性熒光染料定量PCR方法，檢測了不同突變型占總樣本的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥蟲株體內(nèi)該位點(diǎn)突變率達(dá)99%。

2 SNP分子標(biāo)記在蠕蟲上的應(yīng)用

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲

在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchuscontortus）的研究中，蔡葵蒸[45]以來自田間的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲（10份經(jīng)過苯并咪唑處理、54份未經(jīng)過藥物處理）為樣本，用PCR-RFLP分析其β-微管蛋白I型基因第200位密碼子單核苷酸的多態(tài)性，結(jié)果顯示耐藥蟲株存在該位點(diǎn)的突變，耐藥性等位基因頻率為45%，自然感染群體中耐藥性等位基因頻率為9.3%。Bar rè re等[46]為研究不同劑量苯并咪唑?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲耐藥SNP位點(diǎn)頻率的影響，對感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的羊分別進(jìn)行不用藥、推薦劑量用藥、推薦劑量3倍用藥、推薦劑量9倍用藥處理，對各組蟲株β-微管蛋白Ⅰ型基因的167、200、198密碼子進(jìn)行焦磷酸測序，結(jié)果顯示，用藥劑量越高，200 SNP（TTC變?yōu)門AC）頻率越高，167 SNP（TTC變?yōu)門AC）頻率越低，密碼子198處基因型均為GAA（未從GAA 變?yōu)?GCA）。Dos Santosa等[47]對塞阿拉州5個(gè)縣的6個(gè)農(nóng)場捻轉(zhuǎn)血矛線蟲進(jìn)行苯并咪唑耐藥性評估，并對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑耐藥株和ISE標(biāo)準(zhǔn)敏感株β-微管蛋白Ⅰ型基因F200Y（200位密碼子由F突變?yōu)閅）、F167Y（167位密碼子由F突變?yōu)閅）和E198A （198位密碼子由E突變?yōu)锳）SNPs進(jìn)行qPCR，發(fā)現(xiàn)耐藥蟲株中擁有高頻率F200Y和F167Y SNPs，而E198A SNP變化不明顯，表明F167Y和F200Y的SNPs可作為蟲株苯并咪唑耐藥性的分子標(biāo)記。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑耐藥株中，β-微管蛋白Ⅰ型基因198位密碼子由谷氨酸（GAA）變?yōu)楸彼幔℅CA）（即E198A）[48,49]。在應(yīng)用方面，Chagas等[50]對亞馬遜東部地區(qū)部分羊場的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲β-微管蛋白Ⅰ型基因第200位密碼子進(jìn)行基因型頻率計(jì)算，結(jié)果顯示F200Y多態(tài)位點(diǎn)RR、SR 和SS基因型頻率分別為31%、37%和32%，對相應(yīng)羊場的管理模式進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在用藥方面，管理者并未按照藥物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)用藥，而是根據(jù)效益和成本用藥，研究表明將該位點(diǎn)作為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑耐藥性檢測的分子標(biāo)記具有可行性。同樣SNPs也用于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在遺傳進(jìn)化方面的研究，葛程[51]以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中國湖北、內(nèi)蒙、西藏和四川的現(xiàn)場蟲株以及英國的抗藥蟲株、澳大利亞的標(biāo)準(zhǔn)蟲株為研究對象，分別對這些蟲株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定、新一代高通量測序，獲得了不同種群的SNP位點(diǎn)，通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)不同國家地理起源的種群遺傳分化水平較高，我國國內(nèi)的不同地理株種群遺傳分化水平適中，但西藏種群由于特殊的地理、氣候條件，與其他國內(nèi)株的遺傳差異水平略高；同時(shí)找到了與抗伊維菌素相關(guān)的兩個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分別為P-糖蛋白基因的SNP標(biāo)記位點(diǎn)（由C變?yōu)锳）、與P-糖蛋白基因同一片段上的且位于 P-糖蛋白基因附近的SNP位點(diǎn)（由T變?yōu)镃）。

2.2 鉤蟲

犬鉤口線蟲（Ancylostoma caninum）主要寄生于犬小腸，在耐藥性研究方面，F(xiàn)urtado等[52]基于其他線蟲研究結(jié)果，用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)多聚鏈酶式擴(kuò)增（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）方法，驗(yàn)證了犬鉤口線蟲β-微管蛋白Ⅰ型基因上第198和200位密碼子多態(tài)位點(diǎn)與蟲體對苯并咪唑耐藥性的關(guān)系，結(jié)果表明該基因第198位密碼子位點(diǎn)多態(tài)性與蟲株耐藥性相關(guān)，此實(shí)驗(yàn)為犬鉤口線蟲β-微管蛋白Ⅰ型基因與苯并咪唑耐藥相關(guān)的首次報(bào)道，但對β-微管蛋白Ⅰ型基因的F167Y SNP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在相關(guān)耐藥性突變，作者指出耐藥性的研究應(yīng)與蟲株種群進(jìn)化及分布相聯(lián)系[53]。此外，使用一種新技術(shù)即四引物ARMS-PCR技術(shù)來驗(yàn)證犬鉤口線蟲β-微管蛋白基因的第198個(gè)密碼子多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果表明該技術(shù)實(shí)用性很強(qiáng)，也適用于其他線蟲屬的該位點(diǎn)耐藥性驗(yàn)證[54]。

2.3 絲蟲

大環(huán)內(nèi)酯（macrocyclic lactone，ML）抗蟲藥主要用于犬和貓的絲蟲病預(yù)防，由于犬惡絲蟲（Dirofilaria immitis）耐藥性的出現(xiàn)，促使研究學(xué)者們對蟲體的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。Bourguinat等[55]對來自美國和日本的犬惡絲蟲蟲株的β-微管蛋白基因全長和熱休克蛋白60基因（heat shock protein 60，HSP60）、P糖蛋白基因（P-glycoprotein，PGP）、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶基因（Ca2+-ATPase，SERCA2a）及磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）部分片段進(jìn)行SNP檢測，發(fā)現(xiàn)除PFK外均有單核苷酸多態(tài)性，通過用兩個(gè)SNPs進(jìn)行聯(lián)合重組基因型分析，并計(jì)算15個(gè)SNPs的F系數(shù)，發(fā)現(xiàn)犬惡絲蟲具有遺傳異質(zhì)性，為研究蟲體對大環(huán)內(nèi)酯的耐藥性提供了一定基礎(chǔ)。Bourguinat等[56]為研究對藥物不敏感的犬惡絲蟲蟲株是否為ML耐藥株，并尋找相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)，對耐藥表型的蟲株進(jìn)行了全基因組重測序，通過對186個(gè)潛在SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選出一些耐藥性相關(guān)的位點(diǎn)，其中一些位點(diǎn)是其他種類寄生蟲ML耐藥位點(diǎn)。Mani等[57]指出，將蟲體的離子通道作為潛在位點(diǎn)可以研制新的寄生蟲藥物，通過對已注釋的犬惡絲蟲大環(huán)內(nèi)酯敏感株和耐藥株的224個(gè)離子通道基因測序并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了1762個(gè)SNPs，覆蓋率為0.18%，外顯子中129個(gè)SNPs造成非同義突變，14個(gè)造成預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)改變，一些SNPs甚至?xí)绊懟虻谋磉_(dá)。

2.4 其他蠕蟲

β-微管蛋白Ⅰ型基因200、167和198位密碼子的突變與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲大環(huán)內(nèi)酯耐藥相關(guān)，是否也與胃腸道線蟲對苯并咪唑耐藥相關(guān)。為了弄清楚這一問題，Martínez-Valladares等[58]用焦磷酸測序?qū)Νh(huán)紋背帶線蟲（Teladorsagia circumcincta）潛在耐藥位點(diǎn)進(jìn)行研究，通過藥物敏感實(shí)驗(yàn)及糞便卵囊減少率等數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)對環(huán)紋背帶線蟲使用藥物前后，沒有與耐藥性相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)出現(xiàn)。Hansen等[59]提取了不同種類動物體內(nèi)鞭蟲（Trichurisspp.）DNA，設(shè)計(jì)種屬特異性簡并引物，擴(kuò)增覆蓋有β-微管蛋白Ⅰ型基因200、167和198位密碼子的基因片段，測序結(jié)果顯示，不論哪種動物體內(nèi)的鞭蟲，其β-微管蛋白Ⅰ型基因3個(gè)位點(diǎn)的SNPs并未造成氨基酸的改變。Pe?a -Espinoza等[60]用不同劑量左旋咪唑和芬苯噠唑進(jìn)行試驗(yàn)，對丹麥山羊和綿羊養(yǎng)殖場的線蟲進(jìn)行耐藥性檢測，經(jīng)鑒定這些線蟲主要為毛圓線蟲（Trichostrongylusspp.）、背帶線蟲（Teladorsagiaspp.）和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑相關(guān)耐藥基因?yàn)閰⒖迹瑢ζ溥M(jìn)行焦磷酸測序，發(fā)現(xiàn)β-微管蛋白Ⅰ型基因200位（TTC突變?yōu)門AC，即F突變?yōu)閅）密碼子突變頻率增加，但是167位（TTC突變?yōu)門AC，即F突變?yōu)閅）和198位（GAA突變?yōu)镚CA，即E突變?yōu)锳）密碼子突變頻率并未顯著增加。同樣，Knapp-Lawitzke等[61]對寄生于牛腸道的奧氏奧斯特線蟲（Ostertagia ostertagi）在感染用藥后的β-微管蛋白Ⅰ型基因進(jìn)行了分析，該試驗(yàn)將牛分為5組，1組感染純種奧氏奧斯特線蟲（4頭牛），其余4組通過污染牧場自然感染（每組2頭牛，并分別用35%～65%丙硫咪唑治療），用種屬特異性PCR對各組線蟲（用藥前和用藥后）的特定基因進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算苯并咪唑耐藥相關(guān)位點(diǎn)β-微管蛋白Ⅰ型基因200位密碼子（TAC）的基因型頻率，結(jié)果表明，當(dāng)少量多次地用藥物對蟲體治療時(shí)，蟲體對苯并咪唑產(chǎn)生耐藥性的速度將會大大加快。此外，在實(shí)驗(yàn)及田間種群的反芻動物和馬體內(nèi)，SNP已多次成功用于研究動物體內(nèi)線蟲β-微管蛋白200位密碼子的功能作用[62-68]。寄生于駱駝的古柏線蟲（Cooperiaspp.）或寄生于馬的小型圓線蟲（Cyathostomin）同樣也可以發(fā)現(xiàn)相同的SNP[69-71]。然而，Silvestre等[65]和Samson-Himmelstjerna等[72]研究發(fā)現(xiàn)，即使在進(jìn)化上極為相近的線蟲屬，其基因組內(nèi)的SNPs也顯著不同，這可能意味著耐藥性與基因分子標(biāo)記關(guān)系的研究應(yīng)該在種特異性的基礎(chǔ)上進(jìn)行。賈萬忠[73]通過RT-PCR方法對豬帶絳蟲（Taenia solium）45W-4B基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該基因外顯子IV上存在有SNP，且多為單堿基突變。

3 SNP分子標(biāo)記在節(jié)肢動物上的應(yīng)用

3.1 蚊

張仁利等[74]用直接克隆測序的方法，對深圳市白紋伊蚊（Aedes albopictus）核糖體DNA的第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）進(jìn)行SNP分析，以研究ITS2核酸的特異性及不同個(gè)體在該區(qū)域的單核甘酸多態(tài)性，測序結(jié)果表明，深圳市4個(gè)不同地理區(qū)域的白紋伊蚊ITS2同一性為97%，兩個(gè)地方之間相比有99%的同一性，其ITS2基因單核苷酸存在轉(zhuǎn)換、顛換和缺失。耿藝介等[75]用同樣的方法對嗜人按蚊（Anopheles anthropophagus）ITS2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)嗜人按蚊6 個(gè)克隆的同一性為 99.6%，ITS2片段的單核苷酸存在顛換和插入。朱國鼎[76]對采集自江蘇省4個(gè)地區(qū)的4齡期按蚊幼蟲或蛹進(jìn)行形態(tài)及分子鑒定，測定其對擬除蟲菊酯的耐藥性，再用AS-PCR的方法，檢測不同抗性表型中華按蚊（Anopheles sinensis）的擊倒抗性（knock-down resistance，kdr）基因突變頻率，發(fā)現(xiàn)蟲株的耐藥性很高，且存在TGT、TTT、TTC 3種突變基因型和L1014C、L014F 2種突變，當(dāng)在實(shí)驗(yàn)室不用藥物飼養(yǎng)一段時(shí)間后，該蟲株的耐藥性消失，突變也隨之消失。王琰[77]對山東北湖與曹縣2個(gè)現(xiàn)場采集的中華按蚊進(jìn)行基因組水平分析，統(tǒng)計(jì)了8個(gè)與抗性相關(guān)的代謝解毒酶基因編碼區(qū)SNPs，各基因編碼區(qū)均存在一定程度的多態(tài)性，隨后對1996年至2014年采集自我國17個(gè)省的中華按蚊樣本的kdr基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示L1014 位點(diǎn)存在突變。

3.2 螨

在對瓦螨的研究過程方面，基于其體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶1和細(xì)胞色素b上的SNPs，Gajic等[78]采用ARMS和PCR-RFLP方法，對同一地區(qū)64個(gè)成年雌性狄斯瓦螨（Varroa destructor）的Serbia 1（S1）和Peshter 1（P1）線粒體單倍型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其分析結(jié)果與SNPs測序結(jié)果一致，表明將來可用這些方法對狄斯瓦螨進(jìn)行種群研究。

4 展望

眾所周知，大規(guī)模篩選SNP并非易事，費(fèi)用也相對較高，大多數(shù)分析是基于單個(gè)的SNP；盡管已在檢測技術(shù)方面取得了許多進(jìn)展，但迄今為止沒有突破性技術(shù)出現(xiàn)，有些甚至需要依賴于昂貴的精密儀器。但是，隨著生物信息技術(shù)、基因芯片和DNA測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，SNP的檢測方法將越來越簡便，不同物種的SNP數(shù)據(jù)庫將越來越完善，SNP的研究將從前期的單點(diǎn)、低通量向全基因組、高通量化發(fā)展，作為第三代分子標(biāo)記的SNP依然擁有廣闊的應(yīng)用前景，使研究者們可以更方便、更準(zhǔn)確地將物種的基因和性狀聯(lián)系在一起。

目前SNP的研究在人類基因組中應(yīng)用最為廣泛，在動物領(lǐng)域，SNP在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛上的應(yīng)用也有相應(yīng)報(bào)道，在植物領(lǐng)域，也可看到關(guān)于植物抗性、性狀和遺傳圖譜等方面的應(yīng)用。現(xiàn)有的關(guān)于SNP在寄生蟲上的應(yīng)用主要集中于分類鑒定、種群進(jìn)化分析和耐藥性關(guān)聯(lián)分析，鮮有寄生蟲的致病性和疫苗研究的報(bào)道。隨著科技的發(fā)展和研究的深入，SNP在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用將會越來越廣泛，不僅可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供思路，也可以進(jìn)一步指導(dǎo)寄生蟲臨床實(shí)際用藥及宿主的飼養(yǎng)管理，為科研、育種及經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供一定的支持與幫助。

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APPLICATION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN PARASILOGICAL STUDIES

CHEN Ting, HAN Hong-yu, ZHU Shun-hai, DONG Hui, ZHAO Qi-ping, HUANG Bing
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

Single nucleotide polymorphisms (SNP) is the third generation molecular marker. Owing to its diverse detection methods,SNP has many advantages such as large quantities, dimorphism and high genetic stability. Therefore, SNP has been widely used in human, animal and plant fields for its high research values and application prospects. This article summarizes the research progress of SNP in parasitic protozoa, worms and arthropods, including parasite genetic development, population evolution, pathogenicity and drug resistance.

Single nucleotide polymorphism; parasite; genome

S852.7:Q819

A

1674-6422（2017）06-0074-09

2017-07-18

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2016JB10）

陳婷，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

黃兵，E-mail：hb@shvri.ac.cn